郭敏　李祥龍

摘要：利用生物信息學(xué)方法對(duì)13個(gè)物種TYR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，以及一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，同時(shí)擬構(gòu)建13個(gè)物種TYR基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：TYR基因編碼產(chǎn)物為不穩(wěn)定蛋白（貉子除外），整條多肽鏈表現(xiàn)出親水性。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋、β折疊，β轉(zhuǎn)角區(qū)域分布少且散，均存在信號(hào)肽和跨膜區(qū)，可以判斷TYR基因編碼蛋白是定位于生物膜上的膜蛋白或分泌蛋白，主要在嘌呤和嘧啶、運(yùn)輸和結(jié)合、電壓門控離子通道及轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用。各物種TYR基因編碼產(chǎn)物主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及細(xì)胞質(zhì)膜。除原雞外，其他物種該蛋白均存在跨膜區(qū)，貉子有2個(gè)跨膜區(qū)域。各物種系統(tǒng)發(fā)育樹與動(dòng)物學(xué)進(jìn)化觀點(diǎn)基本一致。

關(guān)鍵詞：物種；酪氨酸酶基因；毛色；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： Q754文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0044-05[

[HJ14mm]

收稿日期：2016-06-01

基金項(xiàng)目：河北省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)領(lǐng)軍人才培育計(jì)劃（編號(hào)：LJRC004）；河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（編號(hào)：15962901D）；河北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：C2016407114）。

作者簡(jiǎn)介：郭敏（1991—），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ芑蚪M學(xué)。E-mail：1908384796@qqcom。

通信作者：李祥龍，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail：lixianglongcn@yahoocom。

動(dòng)物的毛色、羽色不但可以作為質(zhì)量性狀，也可作為一種經(jīng)濟(jì)性狀被利用。目前，綠色、環(huán)保、優(yōu)質(zhì)的毛皮產(chǎn)品已成為廣大消費(fèi)者追求的目標(biāo)。毛色表型主要受黑色素的影響，是黑色素在毛皮質(zhì)和髓質(zhì)中沉淀的種類和數(shù)量不同造成的。研究表明，動(dòng)物毛色的形成主要與黑色素細(xì)胞中合成的2種色素（真黑色素、褐黑色素）比例有關(guān)。真黑色素通?？墒蛊つw或毛皮表現(xiàn)為褐色、黑色，褐黑色素能使皮膚或毛皮表現(xiàn)為黃色、紅棕色[1]，黑色素沉淀取決于這2種色素的相對(duì)含量。對(duì)于動(dòng)物黑色素細(xì)胞而言，酪氨酸酶（tyrosinase，簡(jiǎn)稱TYR）作為關(guān)鍵酶參與黑色素的合成[2]，具有加氧酶、脫氫酶雙重功能[3]，動(dòng)物黑色素的形成主要遵循多巴（DOPA）途徑，指在動(dòng)物體內(nèi)，酪氨酸在TYR的催化作用下，經(jīng)由DOPA、多巴醌、吲哚醌等形式，最后生成黑色素。酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶1（TYRP1）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶2（TYRP2）與酪氨酸酶（TYR）構(gòu)成了酪氨酸酶基因家族，TYRP1、TYRP2各自催化特異的反應(yīng)參與黑色素的合成，這3種成員協(xié)同調(diào)控黑色素的形成[4]，并且與其他毛色相關(guān)基因共同作用調(diào)控毛色的形成。引起黑色素代謝紊亂的主要原因是TYR基因突變或酶的失活，最終將導(dǎo)致機(jī)體組織異常表達(dá)[5]。有研究表明，哺乳動(dòng)物TYR基因包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，序列長(zhǎng)度約為16 kb[6]。本研究選用GenBank中已提交物種的TYR基因編碼蛋白序列，利用生物信息學(xué)方法對(duì)TYR基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，以期研究TYR基因及其編碼蛋白的功能，進(jìn)而為該基因調(diào)控的動(dòng)物毛色機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11序列來源

[JP2]從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（http：wwwncbinlmnihgov）的GenBank中下載包括斑馬魚、犬、東北虎、家兔、[JP3]家貓、綿羊、貉子、家牛、人、狨猴、原雞、中央蝙蝠、家豬等13個(gè)物種的TYR基因編碼蛋白序列[7]。序列來源見表1。

12蛋白結(jié)構(gòu)分析

121一級(jí)結(jié)構(gòu)利用Expasy開發(fā)的針對(duì)蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的Protparam工具（http：wwwexpasyorgtoolsprotparamhtml）分析TYR基因編碼蛋白序列的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)（pI）、消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性等。同時(shí)通過 Expasy開發(fā)的Protscale工具對(duì)TYR基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親水性、疏水性分析。利用TMHMM Server v20在線軟件（http：wwwcbsdtudkservicesTMHMM-20）預(yù)測(cè)跨膜區(qū)[8-9]。

122二級(jí)結(jié)構(gòu)利用Chou & Fasman Secondary Structure Prediction Server軟件預(yù)測(cè)TYR基因所編碼蛋白質(zhì)的α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角。同時(shí)，分別使用Protfun 22 Server[10-11]、Signal P 41 Server[12]在線軟件分析預(yù)測(cè)TYR基因編碼產(chǎn)物的功能分類和信號(hào)肽。

123亞細(xì)胞定位利用PSORT Ⅱ Prediction在線軟件（http：psorthgcjpform2html）對(duì)TYR基因編碼蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置進(jìn)行定位與分析[13]。

13構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)不同物種TYR基因編碼蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

2結(jié)果與分析

21不同物種TYR基因編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)

211蛋白質(zhì)理化性質(zhì)由表2可知，13個(gè)物種TYR基因編碼蛋白的氨基酸組成相同，且亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）含量明顯高于其他氨基酸。表3為13個(gè)物種TYR基因編碼蛋白的理化參數(shù)，包括氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、pI值、分子式、原子總數(shù)、正電荷殘基數(shù)負(fù)電荷殘基數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪系數(shù)和親水性總平均值等?？梢钥闯觯鞠禂?shù)均高達(dá)70以上，其中貉子的脂肪系數(shù)最高，達(dá)到8139；親水性總平均值表現(xiàn)為負(fù)值，說明這13個(gè)物種TYR基因編碼的蛋白均為親水蛋白；除貉子（不穩(wěn)定指數(shù)<40，穩(wěn)定）外，其他物種TYR基因編碼的蛋白均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。endprint

212跨膜區(qū)分析通過軟件分析可知：貉子TYR基因編碼產(chǎn)物有2個(gè)跨膜區(qū)域，原雞TYR基因編碼產(chǎn)物無跨膜區(qū)域，第1～499 aa位于胞外。對(duì)13個(gè)物種進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，除原雞外，其他物種該蛋白均存在跨膜區(qū)（表4），揭示該蛋白是定位于生物膜的跨膜蛋白。

22不同物種TYR基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

221α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角的預(yù)測(cè)經(jīng)過軟件分析可知：在各物種TYR基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、β-折疊區(qū)域分布較廣，而β-轉(zhuǎn)角區(qū)域分布少且較分散（表5）。

222信號(hào)肽的預(yù)測(cè)通過分析蛋白序列有無信號(hào)肽，可以判斷此蛋白是否為分泌蛋白[15]。表6的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，原始剪切位點(diǎn)分值（raw cleavage site score，簡(jiǎn)稱C值）的最大值與被結(jié)合的剪切位點(diǎn)的分值（combined cleavage site score，簡(jiǎn)稱Y值）的最大值均趨向于+1，信號(hào)肽分值（signal peptide score，簡(jiǎn)稱S值）的最大值在切割位點(diǎn)前高，在切割位點(diǎn)后低，符合信號(hào)肽的標(biāo)準(zhǔn)，可以判斷TYR基因編碼產(chǎn)物中存在信號(hào)肽。

223親水性與疏水性的預(yù)測(cè)親水性氨基酸一般位于蛋白分子表面，而疏水性氨基酸位于蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部[16]。氨基酸的親水、疏水性可以用來判斷蛋白質(zhì)折疊的大致趨勢(shì)。對(duì)13個(gè)物種TYR氨基酸序列的親水、疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，正值

表疏水，負(fù)值表親水；正值越大表示疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越小表示親水性越強(qiáng)，表7結(jié)果顯示，13個(gè)物種整條多肽鏈均表現(xiàn)親水性，因此認(rèn)為，TYR基因編碼產(chǎn)物為親水蛋白，且位于蛋白質(zhì)分子表面。

23不同物種TYR基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

如表9所示，各物種TYR基因編碼產(chǎn)物主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及細(xì)胞質(zhì)膜，其中人的該基因編碼產(chǎn)物有小部分定位于細(xì)胞外（111%），而原雞的該基因編碼產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞外，比例高達(dá)667%，小部分定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及液泡中，且比例均為111%。

24不同物種TYR基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

對(duì)不同物種TYR基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，結(jié)果表明，各物種蛋白結(jié)構(gòu)豐富多樣，存在大量折疊、螺旋扭曲，這些特點(diǎn)對(duì)物種的生物學(xué)功能具有重大意義。

25系統(tǒng)發(fā)育樹

3結(jié)論

不同物種TYR基因編碼蛋白脂肪系數(shù)均高達(dá)70以上，其中貉子最高，達(dá)到8139。除貉子外，其他物種TYR基因編碼蛋白均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，整條多肽鏈表現(xiàn)親水性。除原雞外，其他物種該蛋白均存在跨膜區(qū)，貉子有2個(gè)跨膜區(qū)域，揭示該蛋白是定位于生物膜的跨膜蛋白。

TYR基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋、β折疊，β轉(zhuǎn)角區(qū)域分布少且散，均存在信號(hào)肽、跨膜區(qū)，主要在嘌呤和嘧啶、運(yùn)輸和結(jié)合、電壓門控離子通道及轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用。各物種TYR基因編碼產(chǎn)物主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及細(xì)胞質(zhì)膜，人有小部分定位于細(xì)胞外（111%），而原雞主要定位于細(xì)胞外（667%），小部分定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及液泡中（111%）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果符合動(dòng)物學(xué)進(jìn)化觀點(diǎn)。

[FK（W14][TPGM1tif]

參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]Ito S，Wakamatsu K，Oeki H Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis[J] Pigment Cell Research，2000，13（8）：103-109

[2]Hearing V J，Tsukamoto K Enzymatic control of pigmentation in mammals[J] FASEB J，1991，5（14）：2902-2909

[3]Crippa R，Horak V，Prota G，et al Chemistry of melanins[J] The Alkaloids，1989，36：253-323

[4]Jimbow K Biological role of tyrosinase-related protein and its relevance to pigmentary disorders （Vitiligo vulgaris）[J] Dermatol，1999，26（11）：734-737

[5]Aigner B，Besenfelder U，Seregi J，et al Expression of the murine wild-type tyrosiness gene in transgenic rabbits[J] Transgenic Res，1996，5（6）：405-411

[6]Oetting W S The tyrosinase gene and oculocutaneous albinism type 1（OCA1）：a model for understanding the molecular biology of melanin formation[J] Pigment Cell Res，2000，13（5）：320-325

[7]付鑫，李祥龍，周榮艷，等 14個(gè)物種RPSA基因編碼區(qū)生物信息學(xué)分析[J] 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（2）：389-390

[8]楊洪一，孫立娜，張杰，等 黃瓜綠斑駁花葉病毒抗原表位預(yù)測(cè)[J] 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（8）：67-70

[9]胡慧艷，賈青，陶雋，等 家豬TBP蛋白結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的生物信息學(xué)分析[J] 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（3）：128-132

[JP2][10][ZK（#]Jensen L J，Gupta R，Blom N，et al Prediction of human protein function form post-translational modification and localization features[J] Journal of Molecular Biology，2002，319（5）：1257-1265

[11]Jensen L J，Gupta R，Strfeldt H H，et al Prediction of human protein function according to Gene Ontology categorise[J] Bioinformatics，2003，19（5）：635-642

[12]李玩生，劉磊，馮海燕，等 豬T細(xì)胞受體β鏈基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J] 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（3）：1-6

[13]Nakai K，Horton P PSORT：A program for detecting sorting signals in protein and predicting their subcellular localization[J] Trends Biochem Sci，1999，24 （1）：34-36

[14]徐小剛，劉雅婷，李永忠，等 番茄斑萎病毒屬病毒SRNA序列比對(duì)[J] 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，36（2）：142-146

[15]Thorton J M From genome to function[J] Science，2001，292（5524）：2095-2097

[16]閻隆飛，孫之榮 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)[M] 北京：清華大學(xué)出版社，1999：221-229endprint