王曉元,李曙光,趙軼峰,楊永江,李坤

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

結直腸癌組織中SLC12A5、MMP-7表達變化及意義

王曉元,李曙光,趙軼峰,楊永江,李坤

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

目的觀察溶質載體家族12A5基因(SLC12A5)和基質金屬蛋白酶7(MMP-7)在結直腸癌組織中的表達變化，并探討其意義。方法采用免疫組化SP法檢測40例結直腸癌組織及相應癌旁正常組織中SLC12A5和MMP-7表達，分析二者表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系。SLC12A5和MMP-7相關性分析采用Pearson法。結果SLC12A5在癌旁正常組織和癌組織中陽性表達率分別為32.50%(13/40)和87.50%(35/40)，Plt;0.001；MMP-7在癌旁正常組織和癌組織中陽性表達率分別為27.50%(11/40)和80%(32/40)，Plt;0.001；SLC12A5和MMP-7表達與結直腸癌患者的浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移和脈管浸潤有關(P均lt;0.05)；SLC12A5在結直腸癌組織中的表達與MMP-7呈正相關(r=0.479,P=0.000)。結論SLC12A5和MMP-7在結直腸癌組織中呈高表達，二者可能在結直腸癌的侵襲、轉移中發(fā)揮協(xié)同作用。

結直腸腫瘤；溶質載體家族12A5基因；基質金屬蛋白酶7

據(jù)2012年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2012)統(tǒng)計，在世界范圍內(nèi)結直腸癌發(fā)病居惡性腫瘤第3位，死亡居惡性腫瘤第4位。中國結直腸癌新發(fā)病例占全球的18.6%，且發(fā)病年齡趨于年輕化，結直腸癌居中國人群惡性腫瘤死因順位第5位。近年來，中國結直腸癌死亡人數(shù)大幅增加。溶質載體家族12A5基因(SLC12A5)是一種新型致癌基因，存在于真核細胞中，該基因能顯著增強細胞增殖和細胞G1～S期轉化，同時增強細胞侵襲和轉移能力，抑制腫瘤細胞凋亡[1]。目前僅在膀胱移行細胞癌中發(fā)現(xiàn)SLC12A5呈高表達狀態(tài)，在神經(jīng)功能疾病中SLC12A5發(fā)揮重要作用[2，3]，而在結直腸癌方面的研究鮮有報道?；|金屬蛋白酶7(MMP-7)是由內(nèi)皮細胞、粒細胞、腫瘤細胞等合成和分泌的一種蛋白水解酶，與腫瘤細胞浸潤和轉移等生物學行為密切相關，且能參與腫瘤細胞淋巴管和血管的生成[4]。2016年9月，我們采用免疫組化SP法檢測了40例結直腸癌患者癌及癌旁正常組織中SLC12A5和MMP-7表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年9月～2017年1月河北北方學院附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科手術切除的結直腸癌組織40例份，患者男25例、女15例，年齡32～70(50.5±14.6)歲。腫瘤直徑≥5 cm者26例，lt;5 cm者14例；腫瘤分化程度為高分化9例，中分化18例，低分化13例；漿膜浸潤34例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期8例，Ⅲ+Ⅳ期32例；淋巴結轉移24例；肝轉移9例；脈管浸潤11例。另取癌標本殘端切緣(距腫瘤組織gt;5 cm)經(jīng)病理檢查證實為癌旁正常腸組織40例份。病例均為原發(fā)性腫瘤，且術前未行新輔助放化療等針對性治療，術后標本均在1 h內(nèi)獲得，并存于液氮中。

1.2 癌及癌旁組織中SLC12A5和MMP-7蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。10%甲醛溶液固定標本，石蠟包埋，切片4 μm，蘇木精-伊紅染色。切片經(jīng)80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脫水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復；PBS洗3次，加一抗(1∶100)50 μL，4 ℃過夜；PBS洗3次，加二抗50 μL。室溫下DAB顯色，PBS洗3次，蘇木精輕度復染，鹽酸乙醇分化，流水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明，樹膠封片，陰性對照為PBS代替一抗，光鏡下觀察。SLC12A5陽性染色主要集中于細胞質中，少量表達于細胞核，MMP-7陽性染色主要集中于細胞質中，少量表達于細胞膜，均為棕黃色或褐色顆粒，計算陽性細胞百分比并評分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，gt;75%為4分；無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分。兩者相乘，0分為-,1～4分為+,5～8分為++,9～12分為+++，+～+++均視為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗。分析SLC12A5和MMP-7表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系，SLC12A5和MMP-7相關性分析采用Pearson法。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癌及癌旁組織中SLC12A5和MMP-7表達比較 SLC12A5在癌旁正常組織中表達-27例，+7例，++3例，+++3例，陽性表達率為32.50%(13/40)；SLC12A5在癌組織中表達-5例，+6例，++11例，+++18例，陽性表達率為87.50%(35/40)；SLC12A5在癌旁正常組織、癌組織中陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.275，Plt;0.001)。MMP-7在癌旁正常組織中表達-29例，+6例，++4例，+++1例，陽性表達率為27.50%(11/40)；MMP-7在癌組織中表達-8例，+5例，++12例，+++15例，陽性表達率為80%(32/40)；MMP-7在癌旁正常組織、癌組織中陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=18.744，Plt;0.001)。

2.2 SLC12A5和MMP-7表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 SLC12A5和MMP-7表達均與腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移及脈管浸潤相關(P均lt;0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織分化程度等均無關(P均gt;0.05)，見表1。

2.3 結直腸癌組織中SLC12A5和MMP-7表達的關系 SLC12A5和MMP-7在結直腸癌組織中的表達呈正相關(r=0.479,P=0.000)。SLC12A5在MMP-7陽性者中的表達(陽性率82.05%)高于MMP-7陰性者(陽性率36.36%)，二者比較，Plt;0.001。

3 討論

腫瘤發(fā)生進展是一個多步驟的遺傳及表觀遺傳學改變累積的過程?？截惍惓?包括染色體的增加和減少，局部的擴增和缺失)在惡性腫瘤中頻繁被發(fā)現(xiàn)，并已成為癌基因異?；罨耙职┗蚴Щ畹闹饕騕5]。諸如人染色體18q12.2整體缺失、11q13.3和11q22.3區(qū)域缺失、MPL1/PZR基因擴增等拷貝異常與腫瘤臨床結局和轉移進展密切相關[6]。

SLC12A5是溶質載體家族12亞組中的重要成員之一，定位于人染色體20q13.12，是人類多種惡性腫瘤最常見的擴增區(qū)[7]。SLC12A5最初作為一種跨膜氯化鉀轉運體被發(fā)現(xiàn)，這種轉運體可維持神經(jīng)元內(nèi)外氯平衡，因而最初對SLC12A5的研究僅局限于癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，SLC12A5突變或異常表達參與某些實體瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[9]表明，SLC12A5抗凋亡作用是通過抑制凋亡誘導因子和核酸內(nèi)切酶G-依賴的凋亡信號通路介導，而促轉移作用是通過調節(jié)基質體系結構的關鍵要素，包括各類基質金屬蛋白酶和纖維連接蛋白等。

表1 SLC12A5、MMP-7表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系[例(%)]

浸潤和轉移是惡性腫瘤重要的生物學行為，腫瘤侵襲的三部學說即黏附、降解和轉移，MMP-7是重要的蛋白水解酶，MMP-7能降低細胞間的黏附力、打破基質的降解平衡、誘導癌細胞穿透細胞外基質與基底膜構成的屏障，從而使癌細胞向周圍組織浸潤、侵襲并轉移到周圍器官[10]；此外，在降解過程中還能誘導細胞釋放大量血管內(nèi)皮生長因子，促進腫瘤新生血管和脈管形成，為腫瘤細胞的增殖與浸潤提供必要的營養(yǎng)基礎與轉移途徑[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，SLC12A5和MMP-7在結直腸癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，表明SLC12A5和MMP-7過表達在結直腸癌癌變過程中發(fā)揮促進作用，SLC12A5是一種促進結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的致癌基因。進一步研究發(fā)現(xiàn)，結直腸癌伴漿膜浸潤者較未侵及漿膜者SLC12A5蛋白表達明顯增高；伴肝轉移、淋巴結轉移、脈管浸潤者較無轉移浸潤者SLC12A5和MMP-7蛋白表達增高；TNM分期越高，SLC12A5和MMP-7蛋白表達越高，表明SLC12A5和MMP-7蛋白表達與結直腸腫瘤的惡性生物學行為密切相關，對結直腸癌的侵襲、轉移有促進作用。Yu等[12]通過單細胞測序研究發(fā)現(xiàn)，突變型SLC12A5在大腸癌患者中呈高表達，而在正常人群中呈低表達，表明突變型SLC12A5在大腸癌中有潛在的致癌作用。進一步研究顯示SLC12A5過表達與大腸癌患者生存期顯著下降關系密切。Xu等[13]通過基因測序、基因擴增技術發(fā)現(xiàn)，SLC12A5與原發(fā)性大腸癌的發(fā)生密切相關，其能顯著促進細胞增殖，誘導細胞周期G1過渡，增強其侵襲、遷移能力。此外，本研究結果顯示SLC12A5和MMP-7在結直腸癌組織中的表達呈明顯正相關，二者在結直腸癌發(fā)生進展過程中有協(xié)同作用，但具體機制目前尚不明確。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SLC12A5可能作為調節(jié)NF-κB信號通路和促進MMP-7增殖的重要因子，促進膀胱腫瘤轉移，增強其惡性生物學行為。

總之，SLC12A5異常高表達參與了結直腸癌的發(fā)生、演進，其誘導MMP-7過表達可能是促進結直腸癌浸潤、轉移的重要途徑之一。

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李曙光(E-mail:shuguangli6688@126.com)

2017-06-30)