吳宗澤 丁國芳① 楊最素 余方苗 唐云平賈盈露 鄭媛媛 陳 銳

(1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院 浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心 舟山 316022;2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 舟山 316021)

綠側(cè)花?？?Anthopleura anjunae)寡肽制備的關鍵技術與抗前列腺癌作用研究*

吳宗澤1,2丁國芳1,2①楊最素1余方苗1唐云平1賈盈露1鄭媛媛1陳 銳1

(1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院 浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心 舟山 316022;2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 舟山 316021)

本文探討綠側(cè)花海葵(Anthopleura anjunae)抗前列腺癌酶解寡肽制備與工藝優(yōu)化。以綠側(cè)花?？鉃樵线M行酶解,篩選最佳蛋白酶,通過正交實驗優(yōu)化酶解條件,并通過超濾、陰離子交換層析、G-25凝膠過濾和反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化,通過LC-MS和氨基酸序列測定鑒定寡肽的氨基酸序列,并以MTT法檢測產(chǎn)物對前列腺癌細胞系DU-145增殖抑制率,以確定活性最強組分,最后通過倒置顯微鏡觀察純化肽的抗前列腺癌活性。結(jié)果表明,堿性蛋白酶為最佳酶種;工藝條件為:最適料液比1︰5、最適pH=11、最適加酶量2000U/g、最適溫度35oC、最適酶解時間6h;經(jīng)高效液相純化得到由五個氨基酸組成的綠側(cè)花?？骨傲邢侔┕央?其氨基酸序列為:Tyr-Val-Pro-Gly-Pro (AAP-H);倒置顯微鏡結(jié)果顯示經(jīng)AAP-H作用24h后的DU-145細胞具有明顯的凋亡形態(tài)學特征。結(jié)論:采用堿性蛋白酶酶解并通過超濾和色譜分離技術能從綠側(cè)花?？庵兄苽淇鼓[瘤活性肽;且AAP-H對DU-145細胞的增殖抑制作用呈時間與劑量依賴關系,作用后細胞出現(xiàn)了凋亡的形態(tài)學特征。因此,AAP-H能明顯抑制前列腺癌細胞DU-145增殖,可以誘導其發(fā)生凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綠側(cè)花?？?酶解;抗腫瘤;寡肽;工藝

前列腺癌(Prostate,PCa)一種早期難被發(fā)現(xiàn)、卻高危性的疾病,相比歐美國家,我國前列腺癌發(fā)病率要低得多,但是近年來由于人們飲食不均衡和環(huán)境污染,發(fā)病率也呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(景奕文等,2014),并成為威脅我國男性健康的重要因素。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤失去調(diào)控有關,如果得不到及時有效的治療將發(fā)展為雄性激素非依賴性前列腺癌,加上晚期骨轉(zhuǎn)移,給治療帶來極大的難度(Michalakiet al,2004)。因此,尋找既能提高人體免疫能力又能有效誘導癌細胞凋亡的活性物就顯得尤其重要。

?？?sea anemone)屬于原始海洋生物,六放珊瑚亞綱的一目,有6科、37種,分布廣泛,常見于熱帶和溫帶海底巖石和泥沙中(胡波,2011)。目前,各國科學家對海葵毒素(張均順等,1998)鉀離子通道和鈉離子通道活性進行了大量的研究(Rodríguezet al,2014);另外,其降血壓(Shkrobet al,2005)、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)(Chiet al,2011)和抗腫瘤(Solettiet al,2008)的研究也有大量報道。但是由于?？舅睾繕O少、提取困難,嚴重制約生理學和病理學方面的研究(Monroy-Estradaet al,2007)。參考海洋生物活性肽的研究進展發(fā)現(xiàn)用酶解法制備生物活性肽已經(jīng)成為新的研究熱點,提取得到的活性肽既能補充機體營養(yǎng)成分,又具有抗氧化、抗凝血、降血壓、抗腫瘤等活性(張巖等,2012)。

據(jù)竇光宇(2003)報道,在眾多?？?數(shù)量最多的為綠側(cè)花?？?Anthopleura anjunae)。在我國東海部分海域,每平方米綠側(cè)花?？臄?shù)量可達數(shù)百個。實驗前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)在舟山海域,綠側(cè)花?？麛?shù)量龐大,在部分海水養(yǎng)殖區(qū),綠側(cè)花?？c其它水產(chǎn)品(如貽貝等)形成競爭共生,對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成一定的危害。雖然綠側(cè)花?？Y源豐富,但到目前為止,對綠側(cè)花?？难芯繀s鮮有報道,而利用酶法開發(fā)海葵活性肽尚未見有報道。本實驗以綠側(cè)花海葵肉為原料,采用酶解法制備具有抗前列腺癌的活性肽,通過正交實驗優(yōu)化酶解條件,并通過超濾、陰離子交換層析、G-25凝膠過濾層析和高效液相分離純化,以MTT法檢測產(chǎn)物對前列腺癌細胞系DU-145增殖抑制率為指標篩選活性肽;最后通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),檢驗純化肽的抗前列腺癌活性,旨在為綠側(cè)花?？鼓[瘤藥物和保健品的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

綠側(cè)花?？?采集舟山海域野生?？?經(jīng)浙江海洋大學趙盛龍教授鑒定為綠側(cè)花?？?Anthopleura anjunae)。堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶:亞太恒信生物科技有限公司;甲醇、乙腈:色譜純,德國默克公司;聚凝胺:上海博普生物技術有限公司;F12培養(yǎng)基:美國Gibco公司;無支原體胎牛血清(FBS):杭州四季青生物制品有限公司。

CF16RN型高速冷凍離心機、L8900氨基酸自動分析儀:日立儀器有限公司;Agilent-1260型高效液相色譜儀:美國安捷倫公司;ALPHA1-4/LDplus超濾系統(tǒng):德國默克密理博公司;Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱:美國Thermo公司;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS公司;酶標儀:美國BioRad科技公司。

1.2 材料預處理

實驗參考?？馄?李霞等,2004)及營養(yǎng)成分分析(朱春曉等,2011)并稍作修改,取新鮮野生綠側(cè)花?？糜谑覝馗蓛艉Ｋ叙B(yǎng)一天,清洗除去雜質(zhì)。用剪刀從中間剖開后,在大燒杯中加水覆蓋,置于–20oC下冷凍12h,室溫自然解凍后,反復操作三次。擠出觸手毒液,沖洗至得到白色?？?。然后高速勻漿(10000r/min,5min),將勻漿液浸泡于異丙醇中去脂,每4h更換一次,連續(xù)換3次,再用純水將異丙醇沖洗干凈,置于通風櫥中瀝干,最后分裝標記,置于–20oC保存?zhèn)溆谩鋈谝簠⒖?Anderluhet al,2002)?？舅氐奶崛》椒ㄌ幚?收集?？舅?。

1.3 綠側(cè)花?？嚓P指標測定

1.3.1 基礎成分測定 參考GB 5009.3-2016測定水分;參考 GB5009.4-2016測灰分;參考 GB50095-2016測粗蛋白含量;參考GB5009.6-2016測定?？獾拇种竞?。

1.3.2 海葵氨基酸組成及含量分析 參考GB5009.124-2016,稱取?？鈩驖{樣品經(jīng)6mol/L鹽酸水解后,用日立L8900氨基酸自動分析儀測定氨基酸的組成及含量。

1.4 酶種的篩選

分別取10g預處理后的?？鈩驖{加50mL純水,加酶量為1000U/g,根據(jù)酶試劑盒上的說明調(diào)節(jié)最佳pH和溫度(表1),置于恒溫水浴鍋中進行酶解。期間勻速緩慢攪拌,結(jié)束后煮沸滅活 15min,然后用三層紗布過濾除去粗雜質(zhì),濾液在4oC、12000r/min離心10min,連續(xù)離心兩次。收集上清液用0.45μm針式濾膜過濾,調(diào)節(jié)pH=7并對產(chǎn)物進行旋蒸濃縮和冷凍干燥。產(chǎn)物分裝置于–20oC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 酶解條件Tab.1 The conditions for enzymolysis reaction

1.5 MTT法檢測產(chǎn)物對DU-145細胞增殖抑制活性及倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

前列腺癌細胞系DU-145用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液于37oC、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞貼壁生長至70%—80%匯合度時進行傳代或?qū)嶒灐?/p>

MTT法參考張國梅等(2015)并稍作修改,將DU-145細胞接種于96孔板中,設置空白對照組及藥物組,藥物組加入含不同劑量酶解產(chǎn)物的培養(yǎng)液,每組設3個復孔,培養(yǎng)24h后加入200μL含有10% MTT的 PBS緩沖液,并孵育 4h。棄 MTT培養(yǎng)液,加入DMSO震蕩反應,酶標儀檢測吸光度A值,計算抑制率(IR),計算公式為:IR=(對照組A值–藥物組A值)/對照組A值×100%

在六孔板中培養(yǎng)細胞,并按照產(chǎn)物的IC50加藥處理 24h,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),分析產(chǎn)物對細胞增殖抑制的原因。

1.6 正交實驗優(yōu)化綠側(cè)花海葵抗腫瘤酶解寡肽的制備工藝

通過方法 1.4確定最佳的蛋白酶后,以 L16(45)正交實驗優(yōu)化綠側(cè)花?？鼓[瘤酶解寡肽的制備工藝,以確定最佳的溫度、時間、pH、加酶量和料液比,產(chǎn)物經(jīng)濃縮冷凍干燥并采用 MTT法檢測對DU-145增殖抑制活性,正交實驗的因素和水平如表2所示。

表2 正交實驗中各酶解反應的條件Tab.2 The conditions of enzymolysis reaction in orthogonal experiments

1.7 最優(yōu)酶解產(chǎn)物分離與純化

1.7.1 ?？附庖撼瑸V 按照1.6確定的最佳酶解條件進行酶解,制備綠側(cè)花海葵抗腫瘤寡肽(Anthopleura anjunaeAnti-tumor Peptide,AAP),用ALPHA1-4/LDplus超濾系統(tǒng)8kDa和20kDa的濾膜分級,并按分子量由小到大命名為AAP-I (MW＜8kDa)、AAP-II (8kDa ≤ MW ＜ 20kDa)、AAP-III (MW ≥20kDa)。MTT法篩選活性最好組分。

1.7.2 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析提前活化、平衡交換柱(2cm×35cm),上樣濃度為30mg/mL溶液,超聲 5min,0.45μm 針式濾膜過濾,每次上樣3mL,分別以純水、0.1、0.3、0.5、0.8mol/L的 NaCl溶液梯度洗脫,各梯度分別洗脫 30min,流速為1mL/min,用DBS-100-LCD電腦全自動部分收集器每4min收集一管,于280nm檢測吸光度,并根據(jù)吸光度曲線合并洗脫峰。產(chǎn)物濃縮冷凍干燥,分裝保存于–20oC冰箱中備用。MTT法篩選活性最好組分。

1.7.3 SephadexG25凝膠層析法分離純化 將對DU-145增殖抑制率最高的AAP-I-1采用G-25凝膠層析繼續(xù)分離純化,將樣品配制成 30mg/mL溶液,超聲5min,然后用0.45μm針式濾膜過濾,每次加3mL到處理好的Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm),用超純水洗脫,流速為1.0mL/min,用DBS-100-LCD電腦全自動部分收集器每4min收集一管,于280 nm檢測吸光度,并根據(jù)吸光度曲線合并洗脫峰,產(chǎn)物濃縮冷凍干燥。MTT法篩選活性最好組分。

1.7.4 反相高效液相色譜分離純化 將AAP-I-1-2配制成 0.5mg/mL溶液經(jīng) 0.22μm針式濾膜過濾后用反相高效液相色譜分離純化。進樣前平衡 Agilent 1260 ZORBAX SB-C18 (9.4mm×250mm)柱,柱溫30oC;洗脫液用乙腈超純水混合液按 1mL/min洗脫,0—15min 乙腈(20%—50%),15—30min:乙腈(50%);檢測波長為280 nm。純品采用PPSQ-31A蛋白質(zhì)測序儀測定肽鏈氨基酸序列。

1.8 AAP-H活性檢測

采用倒置顯微鏡觀察AAP-H抗前列腺癌活性。DU-145細胞接種在六孔板中培養(yǎng)至 80%—90%的匯合度后加藥(1、5和10mg/mL),24h后終止培養(yǎng),于倒置顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.9 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用SPASS19.0統(tǒng)計軟件分析,并采用*±s表示,*表示P＜0.05,具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠側(cè)花?？A成份檢測結(jié)果

綠側(cè)花?？獾幕A成分檢測結(jié)果見表3,含有豐富的粗蛋白占(19.76%)和較低的粗脂肪(僅為0.89%),表明綠側(cè)花海葵是一種高蛋白,低脂肪的海產(chǎn)品。

綠側(cè)花海葵肉的氨基酸組成及含量見表4,發(fā)現(xiàn)其包含常見的 17種氨基酸,種類比較齊全,其中七種必需氨基酸含量占 24.31%,低于太平洋側(cè)花?？?37.37% (朱春曉等,2011);鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)高達 50.58%,高于太平洋側(cè)花?？?45.45%),這可能也是綠側(cè)花海葵味道鮮美的原因之一。

表3 綠側(cè)花海葵肉基礎成分分析(g/100g,濕重)Tab.3 Basic components of A.anjunae flesh (g/100g,wet weight)

表4 綠側(cè)花?？獾陌被峤M成及含量(g/100g,干重)Tab.4 Composition and content of amino acids of A.anjunae flesh (g/100g,dry weight)

根據(jù)FAO/WHO對氨基酸評價標準,綠側(cè)花?？匦璋被嶂g比值與理想的人體氨基酸比值有一定的差異(結(jié)果見表5),但研究表明,親水性多肽(含有 Asp、Thr、Ser、Glu、Arg、Lys、His和Gln 等親水性氨基酸)可通過靜電吸引方式,特異性作用于腫瘤細胞,導致其細胞膜迅速破裂,細胞內(nèi)容物滲漏,最終引起腫瘤細胞死亡(謝書越等,2015)。然而綠側(cè)花?？饷附猱a(chǎn)物的親水性氨基酸占總氨基酸含量的49.3%,親水性氨基酸的高比例可為今后開發(fā)抗癌藥物或者功能食品提供依據(jù)。

2.2 MTT活性測試結(jié)果

將不同提取方法所得產(chǎn)物與前列腺癌細胞系DU-145共同培養(yǎng)24h后,進行MTT活性測試,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有產(chǎn)物的抑制率都表現(xiàn)出劑量依賴性,中劑量(5mg/mL)的胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物以及毒素對DU-145細胞增殖抑制率分別是(24.98±6.04)%、(28.55±5.29)% 、 (31.66±4.04)% 、 (73.7±4.31)% 和(99.12±3.96)%,對DU-145細胞增殖抑制活性順序由大到小分別是:毒素＞堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞胃蛋白酶,所以確定堿性蛋白酶為最優(yōu)酶種。胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物和毒素的 IC50分別是:12.57、12.40、10.66、3.87和0.76mg/mL。

表5 綠側(cè)花?？鞍踪|(zhì)營養(yǎng)評價Tab.5 Nutrition evaluation on protein of A.anjunae

圖1 不同產(chǎn)物作用24h后對DU145細胞增殖抑制效果Fig.1 Effects on proliferative inhibition to DU-145 cells after 24h with different enzymatic hydrolysates

2.3 對前列腺癌DU-145細胞形態(tài)的影響

圖2顯示不同酶解產(chǎn)物作用 24h對前列腺癌DU-145細胞形態(tài)的影響,空白對照組細胞生長良好,細胞間排列緊密,細胞形態(tài)飽滿;經(jīng)酶解產(chǎn)物作用后,B組到 E組細胞之間的間隙增大,細胞膜收縮變圓,并有較多細胞脫離培養(yǎng)瓶壁,即細胞死亡,同時相對空白組細胞數(shù)目明顯減少;經(jīng)毒素作用后的F組細胞出現(xiàn)破碎,被裂解成碎片。

雖然無論是毒素還是酶解產(chǎn)物都能促進 DU-145細胞死亡,但是從細胞形態(tài)變化初步判斷其作用機制不同。?？舅啬茉诩毎闲纬商禺惔┛?使細胞破碎造成溶解(Marinoet al,2004)。而細胞凋亡的形態(tài)特征主要是細胞染色質(zhì)固縮,凝聚與核邊緣,呈塊狀、環(huán)狀或者新月狀(馬嵐,2006)。因此初步推斷,酶解法制備的活性肽肽很可能是通過誘導細胞凋亡而抑制細胞增殖。

2.4 Alcalase正交實驗結(jié)果

采用正交實驗設計以料液比、溫度、pH值、加酶量和時間5個因素,以IR值作為指標,檢測堿性蛋白酶產(chǎn)物抑制前列腺癌細胞DU-145增殖活性的最優(yōu)條件,結(jié)果見表6。采用極差法進行分析,從Rj值大小可以看出,A(料液比)＞E(時間)＞D(溫度)＞C(加酶量)＞B(pH 值)。而 IR值最大時的水解條件為A4B4C3D1E3,即料液比為1︰5、pH為11、加酶量為2000U/g、溫度為35oC和時間為6h。并且按該條件酶解產(chǎn)物得率為10.32%±0.69%。

圖2 不同產(chǎn)物對DU-145細胞形態(tài)的影響,24h,倒置顯微鏡(×200)Fig.2 Morphologic changes in DU-145 cells affected by different enzymatic hydrolysates in 24h,inverted microscope(×200)

2.5 初步分離結(jié)果

將堿性蛋白酶酶解液超濾后,初步分離得到三種組分,并命名為AAP-I、AAP-II和AAP-III,經(jīng)MTT法活性篩選(圖3)后,發(fā)現(xiàn)三種組分皆可對DU-145增殖產(chǎn)生抑制作用,并表現(xiàn)劑量依賴效應,當劑量為10mg/mL時,三個組分幾乎可以完全抑制細胞增殖。當劑量為5mg/mL時,抑制率分別是 87.18±1.41%、74.36±2.30%和83.05±2.03%,綜合三個劑量的抑制率,以及到作為藥品和保健品開發(fā)原材料分子量的適用性問題,AAP-I是最好的選擇,所以采用陰離子交換層析對AAP-I進一步分離。

表6 堿性蛋白酶酶解法正交實驗結(jié)果Tab.6 The results of L16(45)orthogonal test using Alcalase

圖3 超濾后不同分子量產(chǎn)物對DU-145細胞增殖抑制Fig.3 Effects on proliferative inhibition in different molecular weights to DU-145 cells

2.6 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結(jié)果

將超濾得到的 AAP-I用 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析得到三個峰產(chǎn)物(圖4),分別命名為AAP-I-1、AAP-I-2和AAP-I-3。將每個峰產(chǎn)物濃縮冷凍干燥,同樣采用MTT法檢測產(chǎn)物對DU-145的增殖抑制活性。結(jié)果(圖5)顯示三種組分都能抑制DU-145細胞增殖,都呈現(xiàn)劑量依賴效應,并且在每一劑量下,三種組分的抑制率皆表現(xiàn)為AAP-I-1 ＞AAP-I-2 ＞ AAP-I-3。對于中劑量組(5mg/mL),抑制率分別是37.12±1.70%、34.78±2.20%和24.21±1.61%,因此選取細胞增殖抑制率最高的 AAP-I-1進一步分離純化。

圖4 AAP-I的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析曲線圖Fig.4 The elution curve of AAP-I in anion exchange chromatography

圖5 陰離子交換柱洗脫后三個峰產(chǎn)物對DU-145細胞增殖抑制Fig.5 Effects on proliferative inhibition with three products after elution to DU-145 cells

2.7 Sephadex G-25凝膠層析分離結(jié)果

將 AAP-I-1采用 Sephadex G-25凝膠層析分離,結(jié)果得到三個峰(圖6),分別命名為AAP-I-1-1、AAP-I-1-2和AAP-I-1-3,收集后冷凍干燥,分裝于–20oC冰箱保存。采用MTT法檢測抑制活性,結(jié)果(圖7)顯示三種組分都能抑制 DU-145細胞增殖,都呈現(xiàn)劑量依賴關系,濃度越高抑制率越高。在較低濃度(1和5mg/mL)時,三種組分的抑制率 AAP-I-1-2 ＞AAP-I-1-3 ＞ AAP-I-1-1,但是在高濃度組(10mg/mL),抑制率為AAP-I-1-2 ＞ AAP-I-1-1 ＞ AAP-I-1-3。對于中劑量(5mg/mL)時,三個組分的抑制率分別是 30.01±2.16%、46.14±2.29%和40.53±1.76%,結(jié)果表明,三個組分的產(chǎn)物對于劑量增加的敏感性有所不同,但是對于各個濃度,AAP-I-1-2對DU-145增殖的抑制率最好。

圖6 AAP-I-1 G-25凝膠過濾洗脫曲線Fig.6 Elution curve of AAP-I-1 in gel filtration chromatography

圖7 G-25各洗脫峰產(chǎn)物DU-145細胞增殖活性示意圖Fig.7 Effects on the proliferative inhibition with different elution from gel filtration to DU-145 cells

2.8 AAP-I-1-2經(jīng)高效液相分離結(jié)果、產(chǎn)物質(zhì)譜及肽鏈序列

將 AAP-I-1-2經(jīng) HPLC純化后結(jié)果如圖8所示,收集主峰產(chǎn)物濃縮冷凍干燥,并命名為AAP-H,進行MTT活性測試,24h、5mg/mL對DU-145增殖抑制率為49.14%±2.29%,比同等時間和劑量的AAP-I-1-2(46.14%±2.29%)略微偏高,因此推斷主峰 AAP-H 是AAP-I-1-2的主要活性物,AAP-H經(jīng)高效液相檢測基本單一樣品,純度大于95%,符合氨基酸序列測定要求,AAP-H高效液相檢測如圖9所示。

圖8 AAP-I-1-2的C18- HPLC圖Fig.8 C18 HPLC chromatogram of AAP-I-1-2

圖9 AAP-H的C18- HPLC圖Fig.9 C18 HPLC chromatogram of AAP-H

將 AAP-H進行氨基酸測序,見圖 10。結(jié)果為:Tyr-Val-Pro-Gly-Pro,分子式為:C26H37N5O7,分子量為531.68Da,與質(zhì)譜的 532.27Da基本吻合。因此推斷,AAP-H是比較純的單一組分,且是測序檢測到的Tyr-Val-Pro-Gly-Pro寡肽。

2.9 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

倒置顯微鏡觀察結(jié)果如圖11所示,經(jīng)AAP-H作用 24h后,空白對照組(A)的細胞生長良好,細胞間排列緊密,形態(tài)飽滿。隨著AAP-H濃度增加,細胞形態(tài)發(fā)生變化,如 1mg/mL組(B)細胞出現(xiàn)細胞間隙增大,輪廓模糊,相對比空白組死細胞明顯增多;5mg/mL組(C)細胞出現(xiàn)細胞收縮,間隙增大,胞膜出現(xiàn)空泡(C);10mg/mL組(D)的高劑量組,細胞收縮變圓,胞間間距增大,細胞數(shù)量明顯減少。表明AAP-H改變細胞形態(tài)同時抑制細胞增殖。

3 討論

我國海域幅員遼闊,海葵資源豐富,常見的種類有:中華仙影?？?Cereus sinensisVerrill)、太平洋側(cè)花海葵(A.pacifica)、黃側(cè)花?？?A.xanthogrammica)、縱條磯海葵(Haliplanella luciaeHand)和綠側(cè)花?？?A.anjunae)等。目前對?？难芯恐饕呛？舅?從?？|手毒素中分離出多種具有細胞毒、神經(jīng)毒作用的多肽和蛋白質(zhì);另外,也有研究表明,?？羞€有豐富的甘油酯、神經(jīng)酰胺、嘧啶、甾醇和生物堿等活性物(張均順等,1998)。這些毒素具有多種生物活性,如抗菌、降血壓、中樞神經(jīng)抑制和鎮(zhèn)痛等,另外?？鼓[瘤活性物的研究也取得一定的進展,如Tejuca等(2009)研究的三種?？舅赝ㄟ^使細胞膜成孔而抑制細胞增值。但是到目前為止對?？难芯炕径歼€停留在實驗研究階段,并不能轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品,其中重要的原因一方面是因為?？舅睾可?提取困難;另一方面由于?？舅囟拘詮?在應用中副作用大,這些因素都嚴重制約了海葵的研究進展。因此尋找新的途徑開發(fā)海葵資源就顯得尤為重要。

圖10 AAP-H質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectrogram of AAP-H

圖11 AAP-H作用DU-145細胞24h后倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)(×400)Fig.11 Cellular morphology of DU-145 under inverted microscope after treated with APP-H for 24h (×400)注:A:空白對照組細胞形態(tài)飽滿,生長情況良好;B:1mg/mL的APP-H作用DU-145細胞后,細胞開始收縮變圓(圓圈所示);C:5mg/mL的AAP-H作用于DU-145細胞后,細胞出現(xiàn)收縮變圓現(xiàn)象更明顯,同時出現(xiàn)空泡(圓圈所示);D:10mg/mL的AAP-H作用于DU-145細胞后,視野中細胞數(shù)目明顯減少,細胞間間隙增大,部分細胞脫離培養(yǎng)瓶壁(圓圈所示)

目前制備海洋生物活性肽比較常用的方法有三種:一是化學合成方法制備生物活性肽;二是以生物體或者組織為原料通過各種分離手段直接分離提取;三是采用酶解法降解生物組織或者大分子產(chǎn)物制備生物活性肽(黃芳芳,2011)。由于蛋白酶酶解法生產(chǎn)生物活性肽具有安全性高、反應條件溫和、產(chǎn)率相對較高的優(yōu)點,因此該方法已經(jīng)成為近年來制備活性肽的研究熱點。海洋生物生長環(huán)境獨特于陸生生物,有的甚至生長在極高壓或極低溫等環(huán)境中,造成海洋生物在生長過程中形成結(jié)構獨特,功能新穎的活性肽。這種活性肽部分以天然狀態(tài)存在,部分作為蛋白質(zhì)大分子的結(jié)構域,蛋白酶通過對特定的點位剪切,可以得到活性比蛋白質(zhì)更好的肽鏈,這些生物活性肽在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗菌、抗血栓、抗高血壓、調(diào)節(jié)胃腸道運動、清除自由基、抗病毒、促進礦物元素吸收和抗癌方面發(fā)揮重要的作用(黎觀紅等,2004)。根據(jù)Samaranayaka等(2011)的研究表明:肽鏈的生物活性主要受氨基酸組分和肽鏈分子量大小影響,活性肽比蛋白質(zhì)、多聚肽和單純的氨基酸具有更強的生物活性。另外肽鏈中的Trp、Tyr、Met、Gly、Lys、His和Pro等芳香族氨基酸或者疏水性氨基酸能很好地增強肽鏈的生物活性(Saitoet al,2003;Guoet al,2009)。本實驗結(jié)合舟山實際情況,以綠側(cè)花海葵肉為原料,通過酶解法制備?？鼓[瘤肽,旨在為?？Y源的開發(fā)提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

通過實驗確定堿性蛋白酶為最佳酶種,采用正交實驗進一步優(yōu)化酶解法提取?？鼓[瘤肽的最佳工藝條件為:料液比為1︰5 (W/V)、pH=11、加酶量為2000U/g、酶解溫度為35oC和最佳酶解時間為6h。通過超濾、陰離子交換層析、G-25凝膠層析和反向高效液相等方法分離純化,以產(chǎn)物對DU-145增殖抑制率為指標,最終純化獲得寡肽且氨基酸序列為:Tyr-Val-Pro-Gly-Pro,并且 Tyr、Pro和Gly結(jié)構可能是產(chǎn)物具有抗腫瘤活性的重要原因之一。綜上所述,綠側(cè)花?？馐且环N蛋白含量很高脂肪含量很低的天然食品,通過酶解法制備的寡肽,具有抗前列腺癌的活性。

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ENZYMATIC PREPARATION OF OLIGOPEPTIDE FROMANTHOPLEURA ANJUNAEAND ITS ANTI-CANCER ACTIVITY OF PROSTATE CANCER CELLS

WU Zong-Ze1,2, DING Guo-Fang1,2, YANG Zui-Su1, YU Fang-Miao1, TANG Yun-Ping1,JIA Ying-Lu1, ZHENG Yuan-Yuan1, CHEN Rui1
(1.School of Food Science and Pharmacy of Zhejiang Ocean University,Zhejiang Provincial Key Engineering Technology Research Center of Biomedical Products,Zhoushan316022,China;2.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang,Zhoushan316021,China)

The enzymatic preparation of anti-prostate cancer oligopeptide fromAnthopleura anjunaeand its process optimization was investigated.Taking the flesh ofA.anjunaeas the material,the best protease for enzymatic hydrolysis was screened and the reactions were optimized in orthogonal experiments.The active oligopeptide was purified by using ultrafiltration,anion exchange chromatography,G-25 gel chromatography and high performance liquid chromatography.All the active components were detected in methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)assay on prostate cancer DU-145 cells.Morphologic changes of the cells were observed in inverted microscopy.The optimum alkaline enzymatic hydrolysis conditions were determined as:temperature 35°C,pH 11,solid to liquid ratio 1︰5,amount of enzyme 2000U/g,and hydrolysis time 6h.The anti-prostate cancer oligopeptide was obtained and identified as Tyr-Val-Pro-Gly-Pro (AAP-H)by N-terminal amino-acid sequencing.The results demonstrate that AAP-H suppressed the proliferation of DU-145 cells in a time- and dose-dependent manner and the apoptosis morphological features of cells occurred.The anti-prostate cancer oligopeptide was obtained from the enzymatic hydrolysates of green sea anemone using ultrafiltration and chromatographic separation techniques.Our findings suggest that AAP-H can inhibit the proliferation of prostate cancer DU-145 cells and induces apoptosis.

Anthopleura anjunae;enzymatic hydrolysis;anti-tumor efficacy;oligopeptide;technology

Q816

10.11693/hyhz20161200268

* 國家自然科學基金項目,81001393號,2015GA700044號;國家海洋重大計劃項目,201586-2號;浙江省科技廳重大專項,2013C03036號;浙江省自然科學基金項目,21136001115號。吳宗澤,碩士研究生,E-mail:zongze461@sina.com

① 通訊作者:丁國芳,教授,碩士生導師,E-mail:dinggf2007@163.com

2016-12-02,收修改稿日期:2017-02-16