劉立芹 王茂廷 崔文濤 劉 婉 呂振明 龔 理?xiàng)铎o文 董迎輝

(1.浙江海洋大學(xué) 海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 舟山 316022;2.浙江萬里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315100)

大黃魚(Pseudosciaena crocea)leptin和cholecystokinin基因的克隆和表達(dá)特性研究*

劉立芹1王茂廷1崔文濤1劉 婉1呂振明1龔 理1楊靜文1董迎輝2①

(1.浙江海洋大學(xué) 海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 舟山 316022;2.浙江萬里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315100)

本文克隆了兩種大黃魚(Pseudosciaena crocea)攝食調(diào)控因子膽囊收縮素(CCK)、瘦素(LEP)基因的全長序列,并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,克隆得到CCK基因?qū)儆补囚~類的CCK1亞家族,全長900nt,編碼137個(gè)氨基酸,與其他魚類的CCK1相比序列組成非常保守,特別是在20氨基酸的信號(hào)肽和8個(gè)氨基酸的CCK-8活性結(jié)構(gòu)區(qū)域;而克隆得到LEP基因?qū)儆补囚~類的LEPA亞家族,全長1290nt,編碼161個(gè)氨基酸,與其他魚類LEP相比基因同源性較差,但在3D結(jié)構(gòu)上卻保留了LEP經(jīng)典的4個(gè)α螺旋特征。兩種因子在所檢測的所有組織中均有表達(dá),但尤以腦、胃、腸消化道、肝臟等攝食及能量平衡相關(guān)組織中表達(dá)活性最高。8天的饑餓能使大黃魚腦、消化道組織的CCK和肝臟、脂肪組織中的LEP表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。該結(jié)果說明CCK和LEP可能在大黃魚的攝食生理和能量平衡中起著重要的調(diào)控作用;本研究將為深入了解魚類食欲調(diào)控的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)理提供基礎(chǔ)。

大黃魚;瘦素;膽囊收縮素;基因克隆;表達(dá)

與其他高等脊椎動(dòng)物一樣,魚類的攝食活動(dòng)是受大腦和外周系統(tǒng)間復(fù)雜的信號(hào)反饋機(jī)制來調(diào)控的(De Pedroet al,2001)。在高等動(dòng)物的下丘腦中存在著一個(gè)被稱為“攝食中樞”的特殊區(qū)域,該區(qū)域主要接收外周系統(tǒng)如消化道系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)從而控制動(dòng)物的食欲(MacDonaldet al,2009)。而這種外周系統(tǒng)分泌信號(hào)多種多樣,即包括胃腸道分泌的膽囊收縮素(CCK),神經(jīng)肽(PYY);也包括胰臟組織分泌的胰高血糖素(GLP-1)和胰臟 B細(xì)胞分泌的胰島素;同時(shí)還包括脂肪組織分泌的瘦素(LEP)等多種因子(Volkoffet al,2005)。所有這些信號(hào)因子可通過迷走神經(jīng)上的受體或通過血液直接到達(dá)大腦傳達(dá)動(dòng)物攝食和能量狀態(tài)從而控制其食欲(Terovaet al,2008)。此外,大腦本身也可直接合成一些多肽類物質(zhì)作為中樞神經(jīng)信號(hào)調(diào)控食欲,從而與外周信號(hào)一起構(gòu)成了復(fù)雜的動(dòng)物食欲調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)(Kontureket al,2003)。

在諸多的食欲調(diào)控因子中,胃腸道分泌的膽囊收縮素(CCK)是其中最重要的一種。在哺乳動(dòng)物中,CCK主要起著減緩胃排空,促進(jìn)膽囊收縮和胃、胰臟分泌,減少攝食活動(dòng)的作用(Rehfeldet al,2007)。直到最近幾年,魚類的CCK基因才得以成功克隆(Fenget al,2012)。不同形式的CCK,包括CCK-8,被證實(shí)在魚類的攝食活動(dòng)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。如在鲇魚Ictalurus punctatus(Petersonet al,2012)和金魚Carassius auratus(Peyonet al,1999)中,CCKmRNA表達(dá)在攝食后迅速增加,從而抑制食物的進(jìn)一步攝入。在金魚的腦部或腹部中注射 CCK-8能明顯抑制食物的攝取(Himicket al,1994)。在歐洲鱸Dicentrarchus labrax中,口服CCK可迅速減少食物的攝取,而該效應(yīng)可被 CCK專一性的抑制劑丙谷胺阻斷(Rubioet al,2008)。類似的結(jié)果還在虹鱒Oncorhynchus mykiss(Gélineauet al,2001)和斑點(diǎn)叉尾Ictalurus punctatus(Silversteinet al,2000)中得到證實(shí)。但至今,有關(guān) CCK在魚類食欲調(diào)控和能量平衡中的作用仍未得到充分闡述。

由脂肪組織分泌的瘦素(LEP)也是一種重要的食欲調(diào)控因子(Zhanget al,1994)。在哺乳動(dòng)物中,瘦素是一個(gè)由167個(gè)氨基酸組成的16kDa的多肽,在動(dòng)物的攝食和能量平衡的調(diào)控中也起著關(guān)鍵的作用(Wonet al,2012)。魚類的LEP基因也是最近幾年才得以成功克隆(Zhanget al,2013)。腹腔和腦室注射LEP可迅速減少金魚的攝食(Volkoff,2003)。同樣腹腔注射同源重組的 LEP可在幾小時(shí)內(nèi)迅速減弱虹鱒的攝食活動(dòng)(Murashitaet al,2008)。此外,2—3個(gè)星期的饑餓可減少綠太陽魚Lepomis cyanellus(Johnsonet al,2000)和歐洲鱸(Wonet al,2012)血清循環(huán)中的 LEP含量,表明 LEP可能通過哺乳動(dòng)物類似的機(jī)制調(diào)控魚類的攝食和能量平衡。

大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國最重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類,屬鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Pseudosciaena),曾是我國著名的“四大海產(chǎn)”之一。但20世紀(jì)70年代以來,由于過度捕撈和海域環(huán)境的變遷,其自然資源已嚴(yán)重衰竭(Sanget al,2007)。近年來,隨著大黃魚的規(guī)?；斯し庇宛B(yǎng)殖技術(shù)的突破,中國沿海大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速興起,2010年我國沿海大黃魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到85808t,占當(dāng)年全國海水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的8% (農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局,2012)。為進(jìn)一步提高大黃魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量,在養(yǎng)殖規(guī)模無法繼續(xù)增長的情況下,如何提高養(yǎng)殖大黃魚的攝食和餌料轉(zhuǎn)化效率,加快養(yǎng)殖期內(nèi)大黃魚的有效生長不失是一種可行的手段,然而,養(yǎng)殖過大黃魚的人可能都深有體會(huì),大黃魚攝食行為非常謹(jǐn)慎,有時(shí)讓大黃魚開口攝食都是一件非常困難的事情,因此對(duì)于大黃魚攝食生理和調(diào)控機(jī)制的研究有重要意義。本文擬著重對(duì)大黃魚兩種重要的攝食調(diào)控相關(guān)因子CCK和LEP基因進(jìn)行克隆,并對(duì)其在不同組織中的表達(dá)特性進(jìn)行研究,探索饑餓等攝食和營養(yǎng)狀態(tài)對(duì)其表達(dá)的影響,該研究可從一定角度了解 CCK和LEP與大黃魚攝食調(diào)控的相關(guān)性,可為今后深入了解海洋魚類的攝食調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于CCK和LEP基因克隆、組織特異性表達(dá)研究的大黃魚(Pseudosciaena crocea)樣本取自浙江海洋大學(xué)蒼南越洋公司的養(yǎng)殖基地,為體重約 150g左右的1齡大黃魚;活體解剖大黃魚樣本,取腦、肝臟、胃、肌肉、性腺(精巢)、心臟、前腸、脾臟、脂肪(腸系膜脂)等組織,用液氮保存?zhèn)溆谩Ｓ糜陴囸I實(shí)驗(yàn)的大黃魚樣本同樣取自于該實(shí)驗(yàn)基地,將 100尾同規(guī)格(體重150g左右)的1齡大黃魚平均分為兩組,正常投喂(一日兩次魚糜),經(jīng)兩周的適應(yīng)后開始正式實(shí)驗(yàn)。一組設(shè)為饑餓處理組,停止投喂任何餌料;一組仍為正常投喂的對(duì)照組。兩組魚均養(yǎng)殖于基地的漁排中,養(yǎng)殖水溫25oC。經(jīng)8天的實(shí)驗(yàn)后,活體解剖實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的樣本,取腦、胃、肝臟、脂肪等組織,液氮保存后備用。

1.2 方法

1.2.1 CCK和LEP基因的克隆 大黃魚肝臟和胃中總 RNA的提取采用 Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)參照說明書的方法進(jìn)行。提取的 RNA經(jīng) Nanodrop ND-2000 (Thermo Electrom Corporation,USA)分光光度計(jì)定量和瓊脂糖電泳檢測后,用 Dnase I (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)去處多余的 DNA,純化的 RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,USA)反轉(zhuǎn)為cDNA第一鏈后,以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,以GenBank中脊椎動(dòng)物的CCK和LEP保守序列設(shè)計(jì)引物(表1),擴(kuò)增大黃魚 CCK和LEP的核心片斷。PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系進(jìn)行,內(nèi)含 100ng 模板 cDNA、1×buffer、2.0mmol/L MgCl2、0.2μmol/L各種引物、0.2mmol/L dNTPs和4.0U的TaqDNA聚合酶(Promega,USA)。PCR反應(yīng)條件為:94oC預(yù)變性 5min,然后 94oC變性 30s,50oC 退火 30s,72oC延伸 30s,35個(gè)循環(huán),最后 72oC延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)pGEM-T載體(Promega,USA)克隆后送公司雙向測序。CCK和LEP的全長序列參照Sambrook等(2001)的 3′ RACE 和5′ RACE 方法擴(kuò)增。其基本過程如下:根據(jù)已獲得 CCK 和LEP核心片斷設(shè)計(jì) 3′RACE 上游引物和5′ RACE 下游引物(表1),以SMARTTMRACE試劑盒(Clontech,Palo Alto,CA,USA)反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 第一鏈為模板,用 3′RACE和5′ RACE引物與SMARTTMRACE試劑盒自帶的通用引物配對(duì),并參照試劑盒說明書進(jìn)行CCK和LEP 3′和5′端序列的擴(kuò)增。所有的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到 pGEM-T載體(Promega,USA)后,送公司進(jìn)行雙向測序。

表1 大黃魚CCK和LEP基因克隆和表達(dá)所用引物Tab.1 Primers used for CCK and LEP gene cloning and expression

1.2.2 序列特征與系統(tǒng)進(jìn)化 將獲得的 CCK和LEP全長序列與GenBank中的基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì),分析其同源性;采用 ORF finder server(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)中的軟件確定基因的開放閱讀框,采用 SignalP Ver.3.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)兩種基因的信號(hào)肽位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別。采用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html)程序?qū)蚓幋a蛋白的可能三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。采用Clustal W 程序?qū)⒋簏S魚與其他脊椎動(dòng)物的 CCK和LEP基因序列進(jìn)行比對(duì),采用 Mega 3.1軟件采用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建,并采用bootstrap重復(fù)抽樣1000次檢驗(yàn)聚類樹各分支置信度。

1.3 CCK和LEP基因的組織表達(dá)研究

1.3.1 半定量RT-PCR分析 取大黃魚腦、肝臟、胃、肌肉、性腺(精巢)、心臟、前腸、脾臟、脂肪(腸系膜脂)等9種組織,經(jīng)同上方法提取和純化RNA后,取2μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,用CCK和LEP特異性引物(見表1)對(duì)各組織中的兩種基因進(jìn)行擴(kuò)增,以β-actin基因作為內(nèi)參,檢測各組織中基因的表達(dá)量,β-actin基因的擴(kuò)增引物見表1。PCR擴(kuò)增采用上述20μL 的反應(yīng)體系,具體反應(yīng)條件為,94oC 預(yù)變性5min,然后 94oC 變性 30s,50oC 退火 30s,72oC 延伸30s,40個(gè)循環(huán),最后72oC 延伸10min。PCR產(chǎn)物采用 2.0%的瓊脂糖電泳檢測,并用凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)進(jìn)行拍照記錄。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析 再次取大黃魚上述9種組織,提取和純化的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA后,用 CCK和LEP特異性引物(見表1)進(jìn)行各組織基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量 qRT-PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增采用上述 20μL的反應(yīng)體系,內(nèi)含 10μL的SYBR熒光染料預(yù)混extaq酶(TaKaRa),100ng第一鏈cDNA,0.2μmol/L雙向引物。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94oC預(yù)變性 5min,然后 94oC 變性 30s,50oC 退火 30s,72oC延伸30s,40個(gè)循環(huán),最后72oC延伸10min。以β-actin為內(nèi)參,熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)2-ΔΔCt法計(jì)算,每種組織基因表達(dá)量以 5個(gè)樣本(5尾魚)的均值來確定;隨機(jī)選擇一個(gè)組織設(shè)定其基因表達(dá)量為100%,其他組織的表達(dá)量則以相對(duì)于該組織的相對(duì)表達(dá)量為計(jì)。

1.4 饑餓對(duì)CCK和LEP基因表達(dá)的影響

選取CCK表達(dá)較為豐富的腦、胃組織和LEP表達(dá)較為豐富的肝、脂肪組織為研究重點(diǎn),研究饑餓對(duì)兩種基因表達(dá)的影響。分別提取饑餓組和對(duì)照組大黃魚上述組織的RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,采用同上qPCR法檢測各組織CCK和LEP基因的表達(dá)量。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)2–ΔΔCt法計(jì)算,每種組織基因表達(dá)量以 5個(gè)樣本(5尾魚)的均值來確定,各組織的表達(dá)量仍以相對(duì)表達(dá)量為計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS19.0軟件對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,所有數(shù)據(jù)均采用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)的形式進(jìn)行表述,比較各組織或各處理組間基因表達(dá)量的差異,并用T檢驗(yàn)進(jìn)行差異的顯著性分析。采用雙尾法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),當(dāng)P＜0.05時(shí)表示兩組間有顯著性差異,當(dāng)P＜0.01表示兩組間有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大黃魚CCK和LEP基因全長序列特征分析

2.1.1 CCK基因 通過RACE PCR克隆到了一條總長為900nt的大黃魚 CCK序列(GenBank登錄號(hào):AGR51146.1),含 166nt的 5′端非編碼區(qū)(5′-UTR),411nt的開放閱讀框和326nt的3′端非編碼區(qū)(內(nèi)含終止密碼子TAA和一個(gè)加尾信號(hào)AATAAA)(如圖1所示)。該序列編碼一條137個(gè)氨基酸的多肽,內(nèi)含有一條20氨基酸的信號(hào)肽序列和一條C末端的八肽序列(CCK-8:DYVGWMDF)。同源比對(duì)表明,大黃魚CCK氨基酸序列組成與美國紅魚Sciaenops ocellatus(96%)、鰤魚Seriola quinqueradiata(89%)、牙鲆Paralichthys olivaceus(84%)和美洲擬鰈Pseudopleuronectes americanus的 CCK同源性最高(圖2),聚類分析表明(圖3),克隆得到的大黃魚的CCK與魚類的 CCK1亞類聚為一支,而與魚類的CCK2亞類相距較遠(yuǎn),表明克隆到的大黃魚 CCK基因應(yīng)該屬于CCK1亞類。

圖1 大黃魚的CCK基因序列特征Fig.1 The characteristics of CCK gene in large yellow croaker P.crocea

圖2 大黃魚與其他魚類的CCK氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of the CCK amino acid sequences from large yellow croaker P.crocea with that from other teleost fish

2.1.2 LEP基因 通過RACE PCR克隆到一條長為1290nt的 LEP全長序列(GenBank登陸號(hào):AGR51148.1),該序列含 142nt 的 5’端非編碼區(qū),486nt的開放閱讀框和662nt的3’端非編碼區(qū)(內(nèi)含有一段加尾信號(hào)序列 AATAAA和一個(gè) poly A的尾巴)(圖4)。該序列編碼一條161氨基酸的多肽,內(nèi)含一條20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列。相對(duì)于CCK,大黃魚 LEP的保守性相對(duì)較弱,其中與斜帶石斑魚Epinephelus coioides的同源性最高,達(dá)82%,其次與條紋鱸Morone saxatilis的同源性達(dá)75%,而與其他魚類的同源性均在50%以下(圖5)。與人的同源性則更低。但3D結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明,大黃魚的LEP多肽的三維結(jié)構(gòu)則相當(dāng)保守,含 4個(gè) α螺旋的經(jīng)典結(jié)構(gòu),甚至與人類的LEP 3D結(jié)構(gòu)也高度相似(圖6),顯示了大黃魚LEP結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上的保守性。聚類分析表明,魚類的 LEP基因與其他脊椎動(dòng)物相距較遠(yuǎn)而單獨(dú)成支,魚類的LEP也有兩個(gè)亞類LEPA、LEPB,其中大黃魚的LEP與魚類的LEPA亞類聚為一支,表明克隆到的大黃魚LEP基因應(yīng)屬于LEPA亞類。

2.2 CCK和LEP基因的組織特性表達(dá)分析

采用半定量RT-PCR對(duì)大黃魚9種組織中CCK和LEP基因的表達(dá)進(jìn)行研究,結(jié)果表明,CCK在所檢測的全部9種組織中均有表達(dá)。相對(duì)而言,CCK在腦、胃、前腸、性腺(精巢)、心臟及脂肪組織中表達(dá)較高,而在肝臟、肌肉、脾臟中表達(dá)較低(圖8A)。LEP同樣在所有組織中均有表達(dá),但其在肝臟、前腸組織中表達(dá)最高,而在其他組織中表達(dá)相對(duì)較低(圖8A)。實(shí)時(shí)定量qRT-PCR也給出了類似的結(jié)果,CCK在腦、胃和前腸中表達(dá)最高,然后依次是性腺(精巢)、脂肪、心臟、肝臟、肌肉和脾臟;其中腦、胃和前腸中CCK表達(dá)量是其他組織的兩倍以上(圖8B)。LEP在肝臟中的表達(dá)最高,然后依次為前腸、脂肪及其他組織,肝臟中 LEP表達(dá)量是其他組織的 8倍以上(圖8B)。由于CCK在腦和胃中表達(dá)較高,而LEP在肝臟和脂肪表達(dá)較高,因此我們選取這4種組織用于后續(xù)的饑餓實(shí)驗(yàn)。

圖3 大黃魚CCK基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CCK from large yellow croaker P.crocea

2.3 饑餓對(duì)大黃魚CCK和LEP基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證兩種多肽與攝食調(diào)控及能量平衡的相關(guān)性,本研究還開展了饑餓對(duì)兩基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明,8天的饑餓可造成大黃魚腦和胃中CCK基因表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的顯著下降(P＜0.05)(圖9),其中腦中 CCK表達(dá)量下降幅度比胃中更明顯。同樣,8天的饑餓也可造成大黃魚肝臟和脂肪組織中 LEP基因表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的顯著下降(P＜0.05),這種降低在肝臟中表現(xiàn)得比在脂肪中更為顯著,如圖9所示。

3 討論

3.1 大黃魚CCK、LEP基因的序列特征與分子進(jìn)化

圖4 大黃魚LEP基因的序列特征Fig.4 The characteristics of LEP gene in large yellow croaker P.crocea

本文首次克隆了的兩種大黃魚的攝食調(diào)控因子CCK和LEP基因的全長序列,通過GenBank等數(shù)據(jù)庫的同源比對(duì)和blast搜索,結(jié)果表明,克隆得到的大黃魚CCK和LEP與其他魚類有著較高的同源性。特別是 CCK基因序列,大黃魚的 CCK與美國紅魚(Webbet al,2010)、鰤魚(Murashitaet al,2007)、牙鲆(Suzukiet al,1999)、美洲擬鰈(MacDonaldet al,2009)等的同源性高達(dá)80%以上,如圖2所示,表明魚類的CCK保守性相對(duì)較強(qiáng)。信號(hào)肽和CCK-8區(qū)域是CCK中最為保守的區(qū)域,如圖2所示,大黃魚20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽區(qū)域與美國紅魚(Webbet al,2010)、牙鲆(Suzukiet al,1999)的同源性高達(dá) 100%和95%。GenBank(AB205406)中的鰤魚的 CCK信號(hào)肽序列盡管不完全,但已獲得的 14個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列與大黃魚的同源性也高達(dá)100%。同樣大黃魚的CCK-8區(qū)域也與大多數(shù)魚類的高度同源,僅在第6位(從 C端)氨基酸上存在部分替代,如大西洋鯡中該位點(diǎn)是甲硫氨酸(Met)(Kamisakaet al,2005),而在金魚(Peyonet al,1998)和牙鲆(Suzukiet al,1999)中該位點(diǎn)由亮氨酸(Leu)取代,而在虹鱒(Jensenet al,2001)中該位點(diǎn)為亮氨酸(Leu)、精氨酸(Asp)或蘇氨酸(Thr)。信號(hào)肽及 CCK-8區(qū)域的保守性可能暗示這些區(qū)域在魚類 CCK功能中扮演著重要角色。誠然,在哺乳動(dòng)物中,CCK-8中的WMDF區(qū)域據(jù)認(rèn)為是CCK最關(guān)鍵的活性結(jié)構(gòu)域(Nielsenet al,1998)。同樣,CCK-8中的第6位氨基酸據(jù)信也是維持哺乳動(dòng)物CCK活性的關(guān)鍵(Nielsenet al,1998),該位點(diǎn)的變異往往造成CCK活性的減弱或完全喪失。但該位點(diǎn)在魚類卻存在廣泛的變異,該現(xiàn)象可能可歸因于魚類 CCK受體在與其配體識(shí)別時(shí)相對(duì)較低的嚴(yán)謹(jǐn)性。一般而言,硬骨魚類中普遍存在兩種形式的CCK,即CCK1和CCK2亞家族(Kurokawaet al,2003),可能是魚類早期進(jìn)化過程中基因組復(fù)制的結(jié)果(Kamisakaet al,2005)。在虹鱒中,甚至發(fā)現(xiàn)了 3種類型的 CCK 即(CCK-L,N 和T)(Jensenet al,2001),從本研究的結(jié)果來看,大黃魚中也可能至少存在兩種類型的 CCK,一種是 Cai等(2015)在大黃魚中發(fā)現(xiàn)的 CCK2亞型,而另一種是本研究克隆到的 CCK,聚類分析的結(jié)果表明,我們克隆到的大黃魚 CCK與其他魚類的 CCK1聚在一起,而與CCK2亞家族相距甚遠(yuǎn),因此表明本研究克隆到的大黃魚CCK可能屬CCK1亞型。

圖5 與其他魚類的LEP氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.5 Alignment of the LEP amino acid sequences from large yellow croaker P.crocea with that from other teleost fish

圖6 大黃魚與人LEP蛋白的3D結(jié)構(gòu)比較Fig.6 Comparison in the 3D structures of large yellow croaker and human leptons

圖7 大黃魚LEP基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of LEP from large yellow croaker P.crocea

圖8 大黃魚CCK和LEP基因表達(dá)的組織特異性研究Fig.8 Tissue distribution of CCK and LEP mRNA in the large yellow croaker P.crocea

相對(duì)而言,大黃魚的 LEP基因與其他魚類的LEP同源性較低,如圖5所示。大黃魚的LEP僅與斜帶石斑魚(Zhanget al,2013)及條紋鱸(Wonet al,2012)等鱸形目的較為接近(75%以上),而與其他魚類同源性較低,LEP基因序列這種較大的種間變異在魚類及其他脊椎動(dòng)物中頗為常見(Zhanget al,2013)。然而3D結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果表明,大黃魚的 LEP在空間結(jié)構(gòu)上卻保留了經(jīng)典的4α螺旋這一LEP蛋白結(jié)構(gòu)特征,甚至與人類的LEP3D結(jié)構(gòu)也高度相似(圖6),LEP的這種4α螺旋經(jīng)典結(jié)構(gòu)據(jù)信是維持其與 LEP受體親和力,并行使其生理功能所必須的(Crespiet al,2006)。本研究在大黃魚中僅克隆到了一個(gè) LEP基因,魚類通常具有兩個(gè)LEP亞家族基因即LEPA和LEPB,兩個(gè)亞家族可能也起源于魚類早起進(jìn)化過程中基因組的復(fù)制(Fr?ilandet al,2010)。然而在鱸形目中情況可能并非如此,在已研究的所有鱸形目種類中除斜帶石斑魚之外,都僅發(fā)現(xiàn)了一種類型的LEP基因,如條紋鱸(Wonet al,2012)、藍(lán)鰭金槍魚(Yanowskiet al,2011)、鱖魚(李光照,2009)等。因此在大黃魚中是否還存在另一類型的 LEP基因還有待于今后的進(jìn)一步研究。然而聚類分析表明,本研究獲得的大黃魚 LEP基因與魚類的LEPA亞類聚在一起,而與LEPB亞類相距較遠(yuǎn),因此推測該LEP基因應(yīng)屬于LEPA亞家族類型。

圖9 饑餓對(duì)大黃魚CCK和LEP基因表達(dá)的影響Fig.9 Effects of fasting on CCK and LEP mRNA expression in the large yellow croaker P.crocea

3.2 大黃魚CCK、LEP基因的組織表達(dá)特征及可能功能作用位點(diǎn)

本研究在所檢測的所有 9種組織中均檢測到了CCK mRNA的表達(dá),在腦、胃、腸等組織中 CCK mRNA的表達(dá)量最高,大大高于剩余其他組織的表達(dá)量,類似的結(jié)果也在虹鱒(Jensenet al,2001)、鰤魚(Murashitaet al,2007)、美國紅魚(Webbet al,2010)中有所發(fā)現(xiàn),該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了前人有關(guān)腦、外周消化器官是CCK食欲調(diào)控功能的主要位點(diǎn)的一般看法(Himicket al,1994)。然而,在大黃魚的肝臟、心臟、脾臟、肌肉、性腺(精巢)及脂肪中也檢測到了少量CCK mRNA的表達(dá),在同為石首魚科的美國紅魚中,CCK mRNA也在肝臟、肌肉、脾臟、性腺及脂肪中有所表達(dá)(Webbet al,2010);CCK mRNA還在美洲擬鰈的心臟、腎臟、鰓(MacDonaldet al,2009)及鰤魚的胃盲囊、直腸及膽囊(Murashitaet al,2007)中被檢測到。CCK在這些組織中的功能尚不得而知。但有研究表明,CCK可能還在動(dòng)物的感覺系統(tǒng)(Trogeret al,2007)和生殖系統(tǒng)(Micevychet al,1992)中發(fā)揮著重要功能;最近,CCK還被證實(shí)在魚類消化道的抗炎癥反應(yīng)及垂體的激素分泌過程也起著重要作用(Peyonet al,1998;Raybould,2007)。因此CCK在大黃魚組織中的廣泛表達(dá)可能暗示著其在食欲調(diào)控外參與著廣泛的生理調(diào)控功能。

LEP基因也在所有檢測的 9種組織中均有表達(dá),但在肝臟中 LEP基因的表達(dá)量最高,類似的結(jié)果也出現(xiàn)在東方鲀(Kurokawaet al,2005)、虹鱒(Murashitaet al,2008)、條紋鱸(Wonet al,2012)及大西洋鮭(R?nnestadet al,2010)中,然而在脂肪組織中,LEP基因表達(dá)量則要低的多。該結(jié)果進(jìn)一步印證了前人關(guān)于硬骨魚類的肝臟而非脂肪組織更可能是能量收支的調(diào)控中心的表述(Wonet al,2012)。在大黃魚的胃、腸道等消化系統(tǒng)中也檢測到了一定量的的 LEP基因表達(dá),該結(jié)果與金魚(Tinocoet al,2012)及大西洋鮭(R?nnestadet al,2010)腸道內(nèi)檢測到大量LEP基因表達(dá)相吻合。在哺乳動(dòng)物中,胃腸道可分泌LEP激素以調(diào)控營養(yǎng)物的吸收,從而間接影響能量的收支(R?nnestadet al,2010),魚類腸道中LEP表達(dá)也許也與該生理功能有關(guān)。有趣的是,在大黃魚的性腺(精巢)中也有微弱的LEP基因的表達(dá),在斑馬魚(Gorissenet al,2009)及大西洋鮭(R?nnestadet al,2010)的卵巢中也發(fā)現(xiàn)了大量 LEP基因的表達(dá),該結(jié)果可能暗示了LEP在魚類的生殖過程中的可能調(diào)控作用。

3.3 饑餓對(duì)大黃魚CCK、LEP基因表達(dá)的影響及其可能機(jī)制

CCK和LEP在大黃魚腦、消化道、肝臟及脂肪等攝食及能量存儲(chǔ)組織中的大量表達(dá),似乎暗示了兩種肽在魚類食欲調(diào)控和能量平衡中的關(guān)鍵作用。為探索兩者相關(guān)性,我們首先探討了饑餓等攝食狀態(tài)對(duì)大黃魚CCK和LEP表達(dá)的影響。在哺乳動(dòng)物中,腦和消化道中CCK mRNA表達(dá)量與血液中CCK含量呈正相關(guān),并受到饑餓等攝食狀態(tài)的影響而顯著減少(Suominenet al,1998)。在大黃魚中,饑餓也會(huì)降低腦及胃腸道中CCK mRNA表達(dá)量的減少,類似的結(jié)果在包括美洲擬鰈(MacDonaldet al,2009)、鰤魚(Murashitaet al,2007)和草魚(Fenget al,2012)等硬骨魚類中屢有發(fā)現(xiàn)。然而,LEP mRNA表達(dá)與魚類饑餓等攝食狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性則要復(fù)雜的多,LEP mRNA受饑餓等攝食狀況的調(diào)控或因物種或饑餓時(shí)間而異。在虹鱒(Klinget al,2009)和斜帶石斑魚(Zhanget al,2013)中 LEP mRNA表達(dá)因饑餓而上升;在綠太陽魚(Johnsonet al,2000)、大西洋鮭(R?nnestadet al,2010)和條紋鱸(Wonet al,2012)中,LEP mRNA表達(dá)因饑餓而減少;而在鯉魚(Huisinget al,2006)和金魚(Tinocoet al,2012)中,暫時(shí)的饑餓對(duì)LEP mRNA表達(dá)并無顯著影響。在大黃魚中,短期的饑餓會(huì)造成了肝臟及脂肪組織中LEP mRNA表達(dá)的顯著下降(P＜0.05),該結(jié)果與絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物中的研究結(jié)果相類似((Wonet al,2012)。饑餓對(duì)大黃魚CCK和LEP基因表達(dá)模式的影響可能從側(cè)面反映出了其與魚類攝食生理與能量平衡間的相關(guān)性。

4 結(jié)論

本研究克隆得到了兩種大黃魚的攝食調(diào)控因子膽囊收縮素(CCK)、瘦素(LEP)基因的全長序列,兩種因子分屬魚類的 CCK1和LEPA亞家族類型。CCK和LEP在大黃魚腦、消化道等攝食及能量平衡相關(guān)組織中表達(dá)最高,饑餓等攝食狀態(tài)會(huì)顯著影響大黃魚CCK和LEP的表達(dá),該結(jié)果表明,CCK和LEP可能在大黃魚的食欲調(diào)控和能量平衡中起著重要的調(diào)控作用。

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MOLECULAR CLONING,CHARACTERIZATION AND EXPRESSION PROFILES OF CHOLECYSTOKININ AND LEPTIN IN LARGE YELLOW CROAKER(PSEUDOSCIAENA CROCEA)

LIU Li-Qin1, WANG Mao-Ting1, CUI Wen-Tao1, LIU Wan1, Lü Zhen-Ming1,GONG Li1, YANG Jing-Wen1, DONG Ying-Hui2
(1.National and Provincial Joint Laboratory of Exploration and Utilization of Marine Aquatic Genetic Resources,Zhejiang Ocean University,Zhoushan316022,China;2.Zhejiang Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resources,Zhejiang Wanli University,Ningbo315100,China)

cDNAs encoding for two feeding regulation factors,cholecystokinin (CCK)and leptin (LEP),were cloned in large yellow croakerPseudosciaena crocea.mRNA tissue distribution was examined for the two peptides,as well as the effects of 8-day fasting on their expression.The results show that large yellow croaker CCK sequences displayed identity with that of teleost CCK1 gene sub-family.It is a 900bp nucleotide sequence,encoding a peptide composed of 137 amino acids.The sequences displayed great identity with the teleost CCK1 gene,especially within the segments of signal peptide and cck-8 sequences.In contrast,large yellow croaker LEP displayed less identity with other teleost LEP gene,but kept a classic LEP 3D structure formed by four-helix bundle.It is a 1290bp nucleotide sequence,which encodes a peptide composed of 161 amino acids.The sequences displayed identity with teleost LEPA gene sub-family.Both peptides are present in all tissues examined,but only abundant in the feeding regulation tissues,such as brain,gastrointestinal tract,and other peripheral tissues,including liver.The 8-day fasting induced a significant decrease in both brain and gut CCK,and liver and mesenteric fat LEP mRNA expression (P＜0.05).Therefore,the CCK and LEP played possibly a role in feeding regulation and digestive processes in large yellow croaker.The present results provide a basis for further investigation into the neural and gastroenteric mechanisms regulating appetite in large yellow croaker.

large yellow croakerPseudosciaena crocea;leptin;cholecystokinin;gene cloning;expression profile

Q789

10.11693/hyhz20170400096

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,41606150號(hào);浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題,KL2015-2號(hào)。劉立芹,博士,副教授,E-mail:liuliqin-666@163.com

① 通訊作者:董迎輝,博士,副教授,E-mail:15067427669@126.com

2017-04-18,收修改稿日期:2017-05-19