楊馭媒，李新麗，張 可，毛元英

(成都市第六人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610051)

LOC105375840基因單核苷酸多態(tài)性位點與四川地區(qū)漢族人群顱內(nèi)動脈瘤的關(guān)聯(lián)研究

楊馭媒，李新麗，張 可，毛元英

(成都市第六人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610051)

目的探討LOC105375840基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點與四川地區(qū)漢族人群顱內(nèi)動脈瘤(IA)的關(guān)聯(lián)性。方法入選279例IA患者和670例正常對照樣本，利用病例-對照關(guān)聯(lián)研究的方法，選取LOC105375840基因內(nèi)含子區(qū)2個SNP位點(rs6473928和rs4738837)，并采用單堿基延伸法(SNaPshot)進行基因分型，研究這2個SNP位點與顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病是否相關(guān)。結(jié)果LOC105375840基因rs6473928和rs4738837位點基因型分布均符合哈迪-溫伯格平衡(P> 0.05)。兩個位點基因型(rs6473928P= 0.0327，rs4738837P= 0.0277)和等位基因(rs6473928P= 0.0106，rs4738837P= 0.0098)頻率在IA組與對照組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過Haploview單倍體型分析顯示，rs6473928和rs4738837位于8號染色體同一連鎖不平衡區(qū)，其中：AG為風(fēng)險單倍體型，可增加IA患病風(fēng)險54%(OR=1.54，P= 0.0133)，而GA則為保護型單倍體型，可降低IA易感性34%(OR=0.66，P= 0.0274)。結(jié)論LOC105375840基因內(nèi)含子區(qū)SNP位點(rs6473928和rs4738837)與四川地區(qū)漢族人群顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病相關(guān)。

LOC105375840基因；單核苷酸多態(tài)性；顱內(nèi)動脈瘤；病例-對照關(guān)聯(lián)研究

顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)是指顱內(nèi)動脈血管壁上的氣球狀異常膨出(balloon-like dilation)，主要由動脈管壁局部缺陷和管腔內(nèi)壓力增高所引起，其發(fā)病率為(18～23)/100000，而血管造影和尸體解剖評估顯示，未破裂動脈瘤的實際發(fā)生率為2.7%～6.5%[1～4]。多項研究表明，IA是遺傳和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病[5，6]，年齡、性別、高血壓以及過量飲酒等均與其發(fā)生有關(guān)[3]，遺傳因素也是IA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子。位于9號染色體9p21區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點rs10757278是第一個被報道與IA相關(guān)的多態(tài)位點[7]。隨后，不同國家的研究團隊先后成功應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome Wide Association Study，GWAS)發(fā)現(xiàn)多個與IA顯著相關(guān)的基因和位點，分別位于2q33.1、8q11.12-12.1、9p21.3、18q11.2、13q13.1、10q24.32等染色體區(qū)域[8～10]。Bilguvar等[8]的GWAS研究同時包含了歐洲人群(1，818例IA病例和6，038例對照)和日本人群(495例IA病例和676例對照)，同時發(fā)現(xiàn)2q33.1、8q11.12-12.1、9p21.3三個區(qū)域與IA相關(guān)。其中，位于8q12.1區(qū)域上LOC105375840基因內(nèi)含子區(qū)2個SNP位點(rs6473928和rs4738837)與歐洲和日本人群IA均顯著相關(guān)，但在中國人群中還未見LOC105375840基因與IA相關(guān)性的報道。因此，本研究選取LOC105375840基因2個SNP位點(rs6473928和rs4738837)，通過病例-對照關(guān)聯(lián)研究分析其與四川地區(qū)中國漢族人群IA發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1一般資料2010年1月至2016年11月成都市第六人民醫(yī)院確診為IA的患者279例為病例組(IA組)，平均年齡57.3歲(38～89歲)，其中男93例(33.3%)；IA組均通過全腦血管造影術(shù)(DSA)確診顱內(nèi)動脈瘤。同時選取670例健康體檢人群作為正常對照組(對照組)，平均年齡62.3歲(50～81歲)，其中男239例(35.7%)；對照組均無心腦血管系統(tǒng)疾病，近期無感染炎癥等，并通過CT血管造影(CTA)排除顱內(nèi)動脈瘤。本項目研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，所有流行病學(xué)調(diào)查以及樣本收集均征得受試者同意并簽署知情同意書，IA組與對照組均為無血緣關(guān)系的四川地區(qū)漢族人群，基本情況見表1。

表1 顱內(nèi)動脈瘤患者(IA)組與對照組基本情況

* 與對照組比較，P< 0.05

1.2相關(guān)生物化學(xué)指標(biāo)的檢測甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、血糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)檢測：研究對象空腹(8小時以上)采集靜脈血，相關(guān)生化指標(biāo)的檢測均在成都市第六人民醫(yī)院檢驗科進行。

1.3基因組DNA提取EDTA抗凝采血管收集受試者外周靜脈血5 ml，加入0.2%NaCl，振蕩搖勻，放于冰上15分鐘；3000 rpm離心30分鐘，棄上清，0.2%NaCl洗滌；加入10 mM Tris-HCl和10 mM EDTA (pH=8.0)、10% SDS、25 mg/ml蛋白酶K和10 mg/ml RNaseA，加入量分別為4 ml、16 μl和20 μl，混勻，37 ℃過夜；加入4 ml Tris/酚溶液，混勻，3000 rpm離心10分鐘，氯仿抽提兩次，采集水相；加入l/10體積的3 M NaAC (pH=5.2)，兩倍體積的無水乙醇，使DNA沉淀；再用70%乙醇洗滌兩次，獲得基因組DNA，溶解于TE溶液中。定量測定260 nm和280 nm光吸收率，計算DNA濃度和純度，DNA工作液濃度稀釋至50 ng/ μl，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增目的片段從NCBI基因組公共數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)獲取LOC105375840基因內(nèi)含子區(qū)2個SNP位點(rs6473928和rs4738837)周圍的DNA序列，采用Primer 3.0(version 0.4.0)在線軟件(http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)輔助設(shè)計PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(引物序列和PCR產(chǎn)物長度見表2)。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性 5分鐘，(95 ℃ 30秒，56 ℃ 30秒，72 ℃延伸30秒)× 35個循環(huán)，72 ℃延伸10分鐘，12 ℃保溫。

表2 LOC105375840基因2個位點引物序列及PCR產(chǎn)物情況

1.5SNP位點基因分型采用單堿基延伸(SNaPshot)法進行2個SNP位點的基因分型，具體步驟如下：①PCR產(chǎn)物純化：2個位點各4.5 μlPCR 產(chǎn)物混合，加入1 U堿性磷酸酶(Promega公司)以及1 U核酸外切酶(Biolabs公司)，混勻，37 ℃ 30分鐘，75 ℃ 15分鐘；②SnaPshot反應(yīng)：上述純化產(chǎn)物1 μl，加入2個位點的SNaPshot引物各0.3 μl(SNaPshot引物序列見表2)，SNPshot Multiplex試劑1 μl(美國ABI公司)，雙蒸水補足5 μl，反應(yīng)程序：96 ℃1 分鐘，(96 ℃ 10秒，50 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒)× 25個循環(huán)，12 ℃保溫；③二次純化：5 μl上述產(chǎn)物，加入1 U堿性磷酸酶，混勻，37 ℃ 15分鐘，75 ℃ 15分鐘；④基因分型：上述產(chǎn)物1 μl，加入HD 9 μl，3730XL測序儀(ABI公司)上機，檢測基因型，并通過測序儀自帶的Genemap軟件讀取基因分型情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；應(yīng)用多因素回歸分析進行相關(guān)性分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IA組與對照組基本情況比較分析如表1所示，IA組的舒張壓、收縮壓以及血清TG、GLU、LDL-C的水平均高于對照組(P< 0.05)。

2.2LOC105375840基因2個SNP位點的基因型分布如表3中數(shù)據(jù)顯示，2個SNP位點(rs6473928和rs4738837)的基因型分布在IA組和對照組均符合哈迪-溫伯格平衡(P> 0.05)，說明本研究的研究對象具有群體代表性，沒有人群分層的情況。統(tǒng)計結(jié)果顯示，2個位點的基因型分布在IA組和對照組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(rs6473928P= 0.0327、rs4738837P= 0.0277)；其小等位基因的純合子對于IA發(fā)生具有保護作用(rs6473928OR=0.70、rs4738837OR=0.69)，見表3。

表3 LOC105375840基因2個位點在IA組和對照組中基因型分布比較

*HWE：哈迪-溫伯格平衡；**多因素回歸分析校正年齡、性別等因素(OR：優(yōu)勢比，95%CI：95%置信區(qū)間)

2.3LOC105375840基因SNP位點等位基因頻率在IA組和對照組間的比較LOC105375840基因上2個SNP位點的等位基因頻率在IA組和對照組之間的差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義(rs6473928P= 0.0106、rs4738837P= 0.0098，表4)，其小等位基因可以降低對IA的易感性(rs6473928OR=0.66、rs4738837OR=0.65)，見表4。

表4 LOC105375840基因2個位點等位基因頻率比較分析

*MA：Minor allele(小等位基因)；**，P值和OR值為校正年齡、性別等參數(shù)之后的結(jié)果(OR：優(yōu)勢比，95%CI：95%置信區(qū)間)

2.4單倍體型分析通過Haploview 4.2 軟件對LOC105375840基因rs6473928和rs4738837位點進行連鎖不平衡分析，結(jié)果如圖1所示，2個SNP位點位于同一個連鎖不平衡區(qū)域(linkage disequilibrium block，LD)。這2個位點可組合產(chǎn)生3個單倍體型，其中風(fēng)險單倍體型(H1：AG)可以增加IA患病風(fēng)險54%(P= 0.013，表5)，而保護型的單倍體型(H2：GA)則可降低IA易感性34%(P= 0.027)，見表5。

3 討論

IA發(fā)病率高，危害嚴重，尤其IA破裂所導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhages，SAH)是一類非常嚴重的腦血管意外，具有高致殘率和高死亡率[11]。很大一部分IA患者在動脈瘤破裂之前沒有任何癥狀或提示。盡早發(fā)現(xiàn)及確診，尤其是沒有相關(guān)病史的IA患者，對于降低其致死致殘率非常必要。遺傳因素在IA發(fā)病過程中具有非常重要的作用，能夠盡可能多的發(fā)現(xiàn)與IA發(fā)病相關(guān)的基因組標(biāo)記物。

表5 LOC105375840基因兩個位點的單倍體型分析

*3個單倍體型(H)由LOC105375840基因2個SNP位點(rs6473928和rs4738837)所產(chǎn)生；**此處只計算P<0.05時的OR值(OR：優(yōu)勢比，95%CI：95%置信區(qū)間)

圖1 LOC105375840基因2個SNP位點(rs6473928和rs4738837)連鎖不平衡圖 a：顯示D’值(D’=1.0)；b：顯示r2值(r2=0.98)。

利用全基因組SNP芯片所進行的GWAS研究方法，已經(jīng)成功鑒定了多種復(fù)雜疾病的易感基因，包括青光眼、阿爾海默茨癥(AD)、以及多種惡性腫瘤等[12～15]。但是關(guān)鍵在于GWAS所發(fā)現(xiàn)的基因/位點能否適用于不同種族人群。本研究針對一項歐洲和日本人群顱內(nèi)動脈瘤GWAS Meta分析的結(jié)果[8]，在四川地區(qū)漢族人群中進行了的驗證。選取了LOC105375840基因內(nèi)含子區(qū)的2個SNP位點(rs6473928和rs4738837)，在279例IA患者和670例正常對照中進行病例-對照關(guān)聯(lián)研究，分析其與IA發(fā)病的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，這3個SNP位點與IA發(fā)病具有相關(guān)性，其小等位基因可以降低IA的發(fā)病風(fēng)險，我們的結(jié)果也證實了歐洲和日本人群的發(fā)現(xiàn)。

LOC105375840基因位于染色體8q12.1區(qū)域，屬于長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的非編碼RNA分子，其長度一般介于200～100 000 nt之間，具有高度保守的序列元件和特定的空間二級結(jié)構(gòu)[16]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA作為一類重要的基因表達調(diào)控因子，本身并不具備編碼蛋白的功能，但能以RNA的形式在多個層面上(表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達，與生長發(fā)育、細胞分化及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)功能密切相關(guān)[17]。目前，lncRNA已成為繼microRNA之后又一個熱門研究的非編碼RNA分子。隨著近年來對lncRNA研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明lncRNA參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[18]。

歐洲人群、日本人群以及我們的研究結(jié)果都表明，LOC105375840基因SNP位點與IA發(fā)病相關(guān)，有作為IA早期診斷分子標(biāo)記物的潛力。而LOC105375840如何在IA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，及其調(diào)控的靶基因和調(diào)控方式還有待于進一步的研究，這些研究也將有助于顱內(nèi)動脈瘤的早期診斷、預(yù)防和治療。

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AssociationStudybetweenSNPsintheLOC105375840GeneandIntracranialAneurysminaSichuanHanChinesePopulation

YANGYu-mei1，LIXin-li1，ZHANGKe1，MAOYuan-ying1

(ClinicalLaboratory，No.6People’sHospitalofChengdu，Chengdu610051，China)

LIXin-li

ObjectiveTo investigate the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the LOC105375840 gene and intracranial aneurysm (IA) in a Sichuan Han Chinese population.MethodsGenomic DNA samples from 279 patients with IA and 670 normal controls were collected.Two SNPs (rs6473928 and rs4738837) in the intron of LOC105375840 gene were genotyped by using SNaPshot method.ResultsAll the genotype frequencies of these two SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P> 0.05).Significant differences were found in both genotype and allele frequency distribution of these SNPs between IA group and control group (P< 0.05).These two SNPs were in the same linkage disequilibrium (LD) block located in Chromosome 8.The risk haplotype AG could increase the susceptibility to IA by 54% (P= 0.0133)，and the protective haplotype GA could decrease the susceptibility to IA by 34% (P= 0.0274).ConclusionOur results suggest that SNPs in the LOC105375840 gene were significantly associated with IA in the Sichuan Han Chinese population.

LOC105375840 gene；Single nucleotide polymorphism；Intracranial aneurysm；Case-control association study

四川省衛(wèi)生計生委科研基金資助項目(編號：130152)

李新麗

R651.1

A

1672-6170(2017)06-0037-04

2017-10-10)