馮 暄，孟照琰，閆有圣，郝勝菊，張慶華，陳 雪，梁濟慈

(1.甘肅省婦幼保健院產(chǎn)科；2.醫(yī)學遺傳中心，甘肅 蘭州 730050)

特殊特納綜合征1例孕婦的遺傳學分析

馮 暄2，孟照琰1，閆有圣2，郝勝菊2，張慶華2，陳 雪2，梁濟慈2

(1.甘肅省婦幼保健院產(chǎn)科；2.醫(yī)學遺傳中心，甘肅 蘭州 730050)

目的通過1例特殊特納綜合征孕婦的多種遺傳學檢測分析，探討特納綜合征的臨床表型及遺傳學特點，為該類遺傳咨詢和臨床治療提供依據(jù)。方法對1例無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)(NIPT)檢測X染色體異常的孕婦進行遺傳學分析，羊水穿刺采用羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備技術(shù)及熒光原位雜交(FISH)技術(shù)分析胎兒染色體；采用染色體核型分析技術(shù)及熒光原位雜交技術(shù)分析孕婦外周血及口腔脫落細胞。結(jié)果NIPT檢測結(jié)果顯示母體X染色體有缺失；經(jīng)羊水核型分析，胎兒染色體正常；孕婦外周血染色體核型結(jié)果：45，XO；孕婦口腔黏膜脫落細胞FISH結(jié)果：47，XXX(65%)/45，XO(23%)/46，XX(12%)。結(jié)論將細胞遺傳學、分子遺傳學以及分子細胞遺傳學技術(shù)結(jié)合使用后能夠有效提升特納綜合征診查的準確性，精準的診斷能夠為患有該癥患者的遺傳咨詢以及臨床診治提供參考依據(jù)。

特納綜合征；高通量測序技術(shù)；口腔黏膜脫落細胞；無創(chuàng)基因產(chǎn)前檢測

特納綜合征又稱先天性卵巢發(fā)育不全，屬于一種比較多見的性染色體疾病，占據(jù)女性新生兒的1/5 000，在染色體異常中的發(fā)病率比較高[1]。該綜合征一般均具備以下幾點特征，即女性表型、原發(fā)性閉經(jīng)、身體發(fā)育遲緩、第二性征發(fā)育不明顯等，與此同時也會產(chǎn)生發(fā)際低以及頭面部多色素痣等多種癥狀。其染色體核型一般均為45，X，其中可包含以45，X核型為主體共同存在的46，X，i(Xq)、46，X，i(Xp)以及46，X，r(X)等多種類型的Turner綜合征嵌合體核型[2]。本文對甘肅省婦幼保健院1例特殊的特納綜合征患者進行遺傳學分析。

1病例資料

1.1資料

孕婦：31歲，孕13周，G1P0，單胎妊娠，自然受孕?；颊?6歲月經(jīng)初潮，周期規(guī)則，非近親結(jié)婚。體格檢查：外貌健康，身高1.47米，智力正常，無特納綜合征體征，乳房、外陰發(fā)育正常，內(nèi)分泌激素水平正常，子宮及附件正常。因無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)(non-invasive prenatal，NIPT)篩查結(jié)果提示母親X染色體有缺失，抽取孕婦羊水及孕婦外周血，通過不同的遺傳學檢測方法對此病例進行確診。

1.2方法

1.2.1無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)

用streck采血管采集孕婦外周血10mL，用兩步離心法將分離好的血漿用磁珠法進行血漿游離DNA的提取。提取獲得的DNA采用Invitrogen Qubit核酸定量計檢測血漿游離DNA濃度。采用高通量測序文庫構(gòu)建試劑盒完成NIPT文庫構(gòu)建，主要步驟包括：DNA末端修復，通用測序引物及樣本識別標簽(Barcodes)連接，文庫構(gòu)建產(chǎn)物純化。構(gòu)建完成的文庫采用KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒對文庫進行準確定量。構(gòu)建成功的文庫根據(jù)每個樣本文庫的濃度進行混合(Pooling)，將混合的文庫在NextSeq CN 500高通量測序儀平臺上進行大規(guī)模并行測序(massively parallel sequencing，MPS)，測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，計算出每條染色體的Z值。以Z值=3為切割值，當13、18或21號染色體其中之一的Z值gt;3時，提示胎兒存在該染色體三體綜合征高風險。

1.2.2羊水及外周血染色體核型分析

此樣本NIPT結(jié)果提示該孕婦性染色體異常，通知孕婦進行遺傳咨詢并告知相關(guān)風險，該患者同意進行產(chǎn)前診斷并簽訂知情同意書，羊膜腔穿刺術(shù)在甘肅省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心B超引導下進行。羊水樣本送至醫(yī)學遺傳中心細胞遺傳實驗室，依照規(guī)范化的操作要求與流程進行細胞培養(yǎng)。

常規(guī)采集孕婦的外周血樣本，肝素抗凝，使用普通的中期染色體標本制片方式準備染色體以及G顯帶。當顯帶處于350～500G狀態(tài)時，使用Zeiss全自動染色體核型分析設備以及metafer4分析軟件對其染色體實行采集與探究。

1.2.3口腔黏膜脫落細胞標本采集及處理

選擇應用無菌棉簽收集兩側(cè)的頰黏膜拭子，將其放置在干燥且無菌的離心管中。在此過程中，應收集規(guī)格含量為2mL的肝素鈉抗凝靜脈血進行檢驗。具體方法參考文獻[3]，通過對標本進行消化、低滲以及固定處理滴片之后，對其采取熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測。

1.2.4熒光原位雜交檢測

選擇應用FISH探針(由金菩嘉企業(yè)所生產(chǎn)的試劑盒)。FISH檢測步驟：①樣本玻片制備；②玻片預處理；③變性雜交；④玻片洗滌；⑤復染；⑥結(jié)果分析及評定。無規(guī)律性選擇100個羊水細胞進行計數(shù)處理，且判斷要求主要包括以下幾點，即：超過90%符合常規(guī)的細胞呈現(xiàn)正常狀態(tài)；超出60%出現(xiàn)異常的細胞呈現(xiàn)異常狀態(tài)；處于15%～60%這一范圍或者超過60%的細胞呈現(xiàn)異常狀態(tài)，計數(shù)增加到200個細胞，判定嵌合體信號形式。

1.2.5多重探針連接依賴式擴增

實驗采用多重探針連接依賴式擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)非整倍體檢測試劑盒(SALSA MLPA P095，荷蘭MRC公司) ，該試劑盒包括36條探針，其中13、18、21 和X染色體上分別有8條，另4條位于Y染色體，實驗經(jīng)過DNA的變性、探針雜交、連接反應、擴增、及產(chǎn)物分析可檢測這5種染色體拷貝數(shù)的變化。

2結(jié)果

NIPT結(jié)果提示：該樣本X染色體有缺失，而這個異常大多考慮來自于母體。孕婦經(jīng)遺傳咨詢，同意行羊水穿刺，對胎兒的結(jié)果進行確診，并同時抽取外周血，進行染色體核型分析。將抽取得羊水同時進行羊水細胞培養(yǎng)，核型分析以及多重連接探針擴增技術(shù)進行檢測，胎兒染色體結(jié)果：46，XY(見圖1、圖2)。孕婦外周血核型分析結(jié)果：45，XO(見圖3)。由于非嵌合型特納患者生育正常胎兒十分罕見，為避免孕婦為低比例嵌合，我們又對孕婦外周血進行了FISH檢測。結(jié)果依然顯示為：45，XO(見圖4)。加大細胞計數(shù)后，結(jié)果同樣為45，XO。為了確定這一結(jié)果，我們又將孕婦召回，對其口腔黏膜細胞進行FISH檢測，結(jié)果顯示：該樣本為47，XXX(65%)/45，XO(23%)/46，XX(12%)的嵌合體(見圖5)。

圖1胎兒羊水染色體G顯帶核型：46，XY

Fig. 1 Karyotype of G-banding of fetal amniotic fluid chromosome: 46,XY

圖2胎兒羊水MLPA結(jié)果

Fig.2 MLPA result of fetal amniotic fluid

圖3孕婦外周血染色體G顯帶核型：45，XO

Fig.3 Karyotype of G-banding of maternal peripheral blood: 45, XO

圖4孕婦外周血FISH結(jié)果：45，XO

Fig.4 FISH results of maternal peripheral blood: 45, XO

圖5孕婦口腔黏膜FISH結(jié)果：47，XXX/45，XO/46，XX

Fig.5 FISH results of maternal mouth desquamated cell: 47, XXX/45, XO/46, XX

3討論

3.1特納綜合征的遺傳學分析

特納綜合征也可以稱為先天性卵巢發(fā)育不全，此種疾病的主要原因為所有或者少量體細胞中1條X染色體完全缺失或者部分缺失。在人類的眾多單體綜合征中，屬于唯一可以生存的一種，其在性染色體疾病中比較常見，并且在女性的發(fā)病率中大約占據(jù)1/2 500[4]。

在普通女性的體細胞中一般均具備兩條X染色體，且卵巢發(fā)育功能的體現(xiàn)均源自于這兩條X染色體。如果X染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)體系出現(xiàn)異常狀態(tài)時，會對女性性腺發(fā)育產(chǎn)生嚴重的不良影響，進而產(chǎn)生與其相對的臨床癥狀。通常情況下其核型可包括以下幾種類型，即：X單體、嵌合體、結(jié)構(gòu)異常體積含Y等，患有此種疾病的患者即使有著相似的表型，但是各種核型的差異性導致個體之間的表型仍有很多不同之處，雖然核型相同也能夠呈現(xiàn)出較大的差異性，產(chǎn)生此種情況的主要原因為遺傳性疾病特殊癥狀體征的體現(xiàn)是在環(huán)境因素的影響下所產(chǎn)生的，屬于遺傳底物的結(jié)果產(chǎn)物，即便是相同的核型與基因型，但是在環(huán)境因素以及基因外顯率等多個方面的作用下，導致患者表型也會呈現(xiàn)出變異反應[5]。

特納綜合征屬于一類由X染色體缺失或者結(jié)構(gòu)異常而引起的染色體異常性病癥。正常女性有2條X染色體，但Turner綜合征患者其中的1條X染色體出了問題。一類是臨床中最常見的X染色體缺失(即核型45，X，約占50%)，45，X 是常見的核型，主要是由于親代之一生殖細胞的性染色體在減數(shù)分裂Ⅰ期時不分離所致，單一的X 染色體2/3來自于母親[6]，這些患者體內(nèi)的細胞僅含有一條X染色體。還有一類患者屬于嵌合型，意思是人體內(nèi)有一部分細胞是X染色體缺失，而另一部分細胞染色體是正常的。嵌合體形成的原因可能是由于受精卵卵裂時有絲分裂后期染色單體遲留，導致了X染色體的隨機丟失。對于攜帶有45，X/46，XX 嵌合患者而言，正常細胞系比例越大，患者的臨床癥狀就越輕[7]。另外還有一部分患者的X染色體數(shù)目正常，但結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。根據(jù)染色體病變的程度不同，患者發(fā)生第二性征不發(fā)育及不孕的表現(xiàn)也是輕重不一的。據(jù)統(tǒng)計20%～30%患者可以和正常同齡人一樣青春發(fā)育，2%可月經(jīng)來潮，1.8%～7.6%可以自然生育，但其中僅有30%～40%的人可以生出健康的寶寶[8]。

本病例孕婦身高1.47米，體重56公斤。智力及生殖系統(tǒng)正常，女性第二性征正常，月經(jīng)初潮年齡為15歲，月經(jīng)周期25～28天，經(jīng)期6～7天。因無創(chuàng)產(chǎn)篩提示性染色體異常才發(fā)現(xiàn)孕婦性染色體異常。大約2%的特納綜合征的成年女性可有自然懷孕，此種情況原因有二：其一即為嵌合型特納綜合征，所表示的是部分細胞的染色體體現(xiàn)為常規(guī)的23對46條，少量細胞的染色體只有45條，缺失了一條X染色體，并且假設常規(guī)細胞的比重較高，性腺功能不足的表現(xiàn)越輕；其二是染色體數(shù)目雖然正常，但染色體結(jié)構(gòu)有異常，碰巧的是控制卵巢功能的基因(在Xq13-q26區(qū)域)尚且還是正常的，因此保留了卵巢的功能。此孕婦進行了外周血核型分析和FISH檢測后均顯示核型為45，XO，胎兒羊水行核型分析及MLPA技術(shù)檢測均顯示正常。

3.2特納綜合征的遺傳效應

在傳統(tǒng)化的細胞遺傳學中，一般情況下均選用患者外周血實行淋巴細胞染色體分析，大多時候進行分析的核型能夠?qū)π匀旧w異?；颊咦龀鲈\斷?？谇火つぜ毎麘帽憬?，患者容易接受，培養(yǎng)方式與制片水平相對完善，臨床上均被用來對外周血不同胚層來源組織進行遺傳學分析。

由于非嵌合型的特納綜合征患者能夠生育正常胎兒是極其罕見的，為此我們又將孕婦召回，對她的口腔黏膜脫落細胞進行了FISH檢測。口腔黏膜上皮屬于復層鱗狀上皮，并有著代謝旺盛、更新速度快及容易脫落的特征。其是由多層細胞構(gòu)成，基底層分裂旺盛，表層部分的角化層逐漸衰退、脫落。此種細胞源自于胚胎外胚層細胞，和機體組織細胞進行對比后可發(fā)現(xiàn)，二者之間有著同樣的遺傳物質(zhì)，結(jié)果顯示此孕婦是一個嵌合型的特納綜合征患者。依此推測，口腔黏膜發(fā)育的胚層可能與卵巢發(fā)育的胚層來源相似。這也更一步證實了Bisat等[9]的研究，口腔黏膜脫落細胞更能反映生殖腺嵌合的狀況。最終還要確定這例孕婦卵巢嵌合比例的結(jié)果，還需要做進一步的卵巢組織活檢。

綜上所述，在出生時被診查為特納綜合征的大約占15%，少年時被診查為特納綜合征的大約占26%，成年之后被診查為特納綜合征的大約占據(jù)38%，其他均診查于兒童時期。此種疾病的診斷主要源自于染色體核型分析，當對其進行分析的過程中，遇嵌合體眾數(shù)分析時應當增加計數(shù)，避免出現(xiàn)漏診的情況。也可以對口腔黏膜脫落細胞進行染色體檢驗，并充分掌握性腺核型嵌合狀況。

[1]李艷娟,王鳳榮.特納綜合征合并冠心病1例報告并文獻復習[J].中國實用內(nèi)科雜志,2014,34(4):403-405.

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[專業(yè)責任編輯：游 川]

GeneticanalysisofapregnantwomanwithspecialTurner’ssyndrome

FENG Xuan2, MENG Zhao-yan1, YAN You-sheng2, HAO Sheng-ju2, ZHANG Qing-hua2, CHEN Xue2, LIANG Ji-ci2

(1.DepartmentofObstetrics; 2.MedicalHeredityResearchCenter,GansuMaternalandChildHealthCareHospital,GansuLanzhou730050,China)

ObjectiveTo explore clinical manifestation and genetic characterisitcs of Turner's syndrome through various genetic testing and analysis of a pregnant woman with special Turner’s syndrome, so as to provide basis for consultation and treatment of such genetic disease.MethodsGenetic analysis was carried out on a pregnant woman with X chromosome abnormality detected by non-invasive prenatal test (NIPT). Fetal chromosomal analysis was implemented by culture of amniotic cell collected through amniocentesis, chromosome preparation and fluorescence in situ hybridization (FISH). Maternal peripheral blood and mouth desquamated cells were analyzed by karyotype analysis and FISH analysis.ResultsNIPT results showed deletion in maternal X chromosome. Karyotype analysis of amniotic cell showed that fetal chromosome was normal. Maternal peripheral blood karyotyping result was 45, XO. Maternal mouth desquamated cell FISH result was 47, XXX (65%)/45, XO (23%)/46XX (12%).ConclusionCombination of cytogenetics, molecular genetics and molecular cytogenetic technology can effectively improve the diagnostic accuracy of Turner’s syndrome, and accurate diagnosis provides reference for genetic counseling and clinical treatment of this disease.

Turner’s syndrome; high throughput sequencing; mouth desquamated cell; non-invasive prenatal test (NIPT)

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.044

R711.7

A

1673-5293(2017)11-1446-04

2017-02-09

馮 暄(1983—)，女，助理研究員，碩士，主要從事醫(yī)學遺傳學的研究。

孟照琰，副主任醫(yī)師。