劉 超，汪治華

(西安市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科，陜西 西安 710003)

谷胱甘肽合成酶缺乏癥2例基因分析及文獻(xiàn)回顧

劉 超，汪治華

(西安市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科，陜西 西安 710003)

目的探討谷胱甘肽合成酶缺乏癥(GSSD)的臨床及遺傳學(xué)特點(diǎn)。方法對(duì)2014年1至12月西安市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科臨床診斷的2例5-羥脯氨酸尿癥的患兒進(jìn)行臨床特點(diǎn)分析，采用目標(biāo)序列捕獲測(cè)序方法，對(duì)患兒進(jìn)行谷胱甘肽合成酶(GSS)基因分析，再經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)高危突變基因進(jìn)行驗(yàn)證，最終確診為GSSD；并進(jìn)行相關(guān)臨床特點(diǎn)總結(jié)及基因?qū)W分析。結(jié)果GSSD臨床表現(xiàn)為代謝性酸中毒、黃疸、溶血性貧血，GSS基因檢測(cè)出致病突變，其中1例為復(fù)合雜合突變(E5 c.491Ggt;A 和 E10 c.847Cgt;T)，1例為純合突變(E5 c.491Ggt;A)。結(jié)論E5 c.491Ggt;A基因突變可能為GSSD熱點(diǎn)基因突變。

5-羥脯氨酸酶；谷胱甘肽合成酶；5-羥脯氨酸尿癥；基因分析；基因突變

谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的三肽，參與體內(nèi)游離基的清除、氧化還原反應(yīng)、脫氧核苷酸的形成、生物異源性物質(zhì)的代謝以及氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，其生物合成及代謝分解均在γ-谷胺酰循環(huán)中完成。在6種γ-谷胺酰循環(huán)酶中，已有4種酶的遺傳性缺陷見(jiàn)諸報(bào)道。其中，谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase,GSS)和5-羥脯氨酸酶(5-oxoprolinase,OPLAH)的缺陷，是造成大量5-羥脯氨酸蓄積的重要原因，致使臨床上出現(xiàn)5-羥脯氨酸尿癥(又稱為焦谷氨酸尿癥)。因此，根據(jù)致病基因不同，5-羥脯氨酸尿癥可分為谷胱甘肽合成酶缺乏癥(glutathione synthetase deficiency,GSSD)和5-羥脯氨酸酶缺乏癥兩種類型。

本研究選取2014年1至12月西安市兒童醫(yī)院2例臨床診斷5-羥脯氨酸尿癥的患兒家系，提取全血基因組DNA，依據(jù)5-羥脯氨酸尿癥致病基因GSS的基因組序列，分析測(cè)序結(jié)果尋找突變位點(diǎn)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，以期提高臨床對(duì)GSS缺乏癥的認(rèn)識(shí)。

1臨床資料

2例臨床診斷為5-羥脯氨酸尿癥的患兒體重分別為3.7kg、3.4kg，出生后不久即發(fā)病，均表現(xiàn)為氣促、精神差，無(wú)抽搐發(fā)作，查血?dú)夥治鍪敬x性酸中毒，反復(fù)給予碳酸氫鈉治療后，酸中毒不易糾正。血常規(guī)提示中度貧血，血乳酸、血氨、血同型半胱氨酸檢測(cè)及血氨基酸、酰基肉堿檢測(cè)未見(jiàn)明顯異常。尿有機(jī)酸檢測(cè)提示：5-羥脯氨酸分別為316.4μmol/L及210.5μmol /L(正常參考值：0～7.6μmol/L)。臨床診斷為5-羥脯氨酸尿癥。

經(jīng)患兒家屬同意后，留取患兒及父母外周血標(biāo)本，提取全血基因組DNA，依據(jù)GSS的基因組序列，設(shè)計(jì)引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增該基因編碼區(qū)的全部外顯子，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序后分析測(cè)序結(jié)果尋找突變位點(diǎn)。

2結(jié)果

經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中正常人GSS基因序列進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)病例1 患兒GSS基因的第5號(hào)外顯子在c.491Ggt;A和第10號(hào)外顯子在c.847Cgt;T各有一個(gè)致病突變位點(diǎn)，其類型均為雜合錯(cuò)義突變；病例2 患兒GSS基因的第5號(hào)外顯子在c.491Ggt;A有一個(gè)純合錯(cuò)義突變，見(jiàn)圖1。2例患兒最終均被確診為GSSD。難以糾正的代謝性酸中毒、黃疸、溶血性貧血、尿5-羥脯氨酸大量排泄是其重要的臨床特征。

注：A為正常對(duì)照序列；B為病例1 外顯子5(E5)c.491Ggt;A(p.Arg164Gln)錯(cuò)義突變，外顯子10(E10)c為847Cgt;T(p.Arg283Cys)錯(cuò)義突變；C為病例1父親外顯子5(E5)c.491Ggt;A(p.Arg164Gln)錯(cuò)義突變，外顯子10(E10)正常；D為病例1母親 外顯子5(E5)正常，外顯子10(E10)c.847Cgt;T(p.Arg283Cys)錯(cuò)義突變；E為病例2 外顯子5(E5)c.491Ggt;A(p.Arg164Gln)純合錯(cuò)義突變。

圖1基因測(cè)序圖

Fig.1 Gene sequencing map

3討論

3.1 γ-谷胺酰循環(huán)需多種酶共同參與完成

谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)的生物合成，是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶催化的。起始的降解步驟由γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化，它將γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移至受體，例如氨基酸，就生成γ-谷氨酰氨基酸。谷胱甘肽合成酶是典型的γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶的底物，該酶催化γ-谷氨酰剩余物如5-羥脯氨酸的釋放，而5-羥脯氨酸則在5-羥脯氨酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酸，見(jiàn)圖2。谷胱甘肽起著γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶反饋性抑制劑的作用。

注：GGCT=γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶；DP=二肽酶

圖2 γ-谷胺酰循環(huán)圖

Fig.2 Gamma-glutamyl cyclic graph

在γ-谷胺酰循環(huán)中，可存在4種酶缺陷，其中僅以5-羥脯氨酸酶和谷胱甘肽合成酶缺陷以5-羥脯氨酸(焦谷氨酸)過(guò)量為標(biāo)記。本研究中，2例患者尿有機(jī)酸檢測(cè)均表現(xiàn)為5-羥脯氨酸尿癥。

3.2谷胱甘肽合成酶缺乏癥的重要臨床特征

GSSD是一種極為罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，大多數(shù)患者于新生兒期被發(fā)現(xiàn)，分為兩種：一種只有紅細(xì)胞的改變，患者的唯一癥狀就是溶血性貧血；另一種為全身性GSSD，其癥狀包括新生兒嚴(yán)重的難易糾正的代謝性酸中毒、溶血性貧血和新生兒高膽紅素血癥，最終出現(xiàn)進(jìn)行性的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(如痙攣、抽搐、智力低下等)。Ellionor等人于2007年報(bào)道發(fā)現(xiàn)尿中5-羥脯氨酸顯著增高，紅細(xì)胞或成纖維細(xì)胞谷胱甘肽合成酶活性降低，僅為正常人群10%左右，而雜合子攜帶者酶活性約為正常人的50%～70%。Verma等[1]及Milosevic等[2]研究指出，過(guò)量生成5-羥脯氨酸(焦谷氨酸)所造成的高陰離子間隙性代謝性酸中毒是γ-谷氨酰循環(huán)反饋性調(diào)節(jié)缺陷的結(jié)果。

全世界報(bào)道的GSSD患者大約有70人，來(lái)自50余家庭。約25%的GSSD患者因感染和(或)電解質(zhì)紊亂死于新生兒期。通過(guò)其臨床表現(xiàn)，可分為3種類型，即輕型、中度、重型。輕型患兒主要有基因突變作用于酶活性的穩(wěn)定性，有核細(xì)胞有足夠高的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)來(lái)彌補(bǔ)這種穩(wěn)定缺陷。然而，谷胱甘肽對(duì)細(xì)胞膜完整性至關(guān)重要。缺乏成熟紅細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成會(huì)造成孤立的溶血性貧血。中度患兒表現(xiàn)為嚴(yán)重的代謝性酸中毒和尿液中5-羥脯氨酸的大量檢出，甚至高達(dá)0.5～1.0g·kg-1·d-1。重型患者除上述特征外，會(huì)進(jìn)一步出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能損害，包括痙攣、抽搐、智力低下及精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育障礙等。本研究中，2例患兒均為中度，尚未出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。此外，Ristoff 等曾在2007年研究證實(shí)，GSSD可引起粒細(xì)胞功能缺陷而致使細(xì)菌感染的易感性增加，一些病例會(huì)出現(xiàn)漸進(jìn)性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良和黃斑色素沉著。該病還被認(rèn)為和產(chǎn)前大腦出血、半胱氨酸、白三烯水平低下及多發(fā)畸形有關(guān)。

3.3谷胱甘肽合成酶缺乏癥的診斷及鑒別診斷

在γ-谷氨酰循環(huán)障礙中引起尿液中5-羥脯氨酸含量增高的代謝缺陷，除谷胱甘肽合成酶缺陷外，5-羥脯氨酸酶缺乏癥患者尿液中亦可檢出大量5-羥脯氨酸。但該病不出現(xiàn)酸堿平衡紊亂及溶血性貧血。

在診斷的過(guò)程中，除GSSD和5-羥脯氨酸酶缺乏癥外，還應(yīng)注意以下因素引起尿液中5-羥脯氨酸升高：①飲食，某些嬰兒配方奶含有酪蛋白，經(jīng)加熱后，可轉(zhuǎn)化為5-羥脯氨酸；在番茄經(jīng)由化學(xué)處理生產(chǎn)番茄汁的過(guò)程中，可將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為5-羥脯氨酸。②嚴(yán)重的燒傷及Stevens-Johnson綜合征的患者，包含大量5-羥脯氨酸的一些蛋白質(zhì)如纖維蛋白原和膠原蛋白等代謝增加。③除γ-谷氨酰循環(huán)障礙以外的先天遺傳代謝缺陷疾病，包括X-連鎖的鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、尿素循環(huán)障礙、酪氨酸血癥。④在肝臟、腎臟等重要器官，若缺乏ATP，5-羥脯氨酸將不能轉(zhuǎn)化為谷氨酸，可導(dǎo)致5-羥脯氨酸尿癥。⑤高胱氨酸尿癥。⑥藥物代謝如撲熱息痛、氨己烯酸和抗生素(氟氯西林)等。⑦早產(chǎn)兒，尤其在極早產(chǎn)兒中，可出現(xiàn)一過(guò)性的5-羥脯氨酸尿癥。⑧營(yíng)養(yǎng)不良、孕期限制甘氨酸的攝入。⑨胱氨酸腎病。胱氨酸腎病患者出現(xiàn)5-羥脯氨酸尿癥的原因可能是半胱氨酸的可用性降低，導(dǎo)致γ-谷氨酰循環(huán)的繼發(fā)性損傷。

GSSD臨床表現(xiàn)為難以糾正的代謝性酸中毒、溶血性貧血、黃疸、尿5-羥脯氨酸大量排泄，在排除其他繼發(fā)性因素所致尿5-羥脯氨酸大量排泄后，應(yīng)考慮5-羥脯氨酸尿癥，為進(jìn)一步明確診斷，需行基因檢測(cè)。截至2016年，國(guó)內(nèi)僅由彭薇等[3]、Li等[4]報(bào)道篩查出5-羥脯氨酸尿癥7例，其中3例經(jīng)基因檢測(cè)確診為GSSD。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，新的基因檢測(cè)方法將為患者診斷提供巨大幫助，可指導(dǎo)臨床治療，為產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢提供有力依據(jù)。

3.4谷胱甘肽合成酶缺乏癥基因?qū)W分析及熱點(diǎn)基因突變推測(cè)

人類谷胱甘肽合成酶是一個(gè)由474的氨基酸構(gòu)成的同型二聚體，它有一條單拷貝基因編碼。該基因存在于染色體20q11.2，包括13個(gè)外顯子，長(zhǎng)度約32kb。GSSD是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，目前已被證實(shí)GSSD基因有近30種不同的突變類型。由于等位基因的異質(zhì)性，GSSD患者間臨床表型多樣。Nj?lsson等人在2005年報(bào)道41例GSSD，輕型患兒突變類型以656A→G為主；中型患兒突變類型以491G→A，c129+1663A→G，77C→A 為主；重度患兒c.-9+5G→A，847C→T，374G→A為主。本研究及Li等[4]共報(bào)道5例患兒，均發(fā)現(xiàn)491G→A基因突變，其臨床表型與基因型一致。因此，可推測(cè)該基因可能為GSSD熱點(diǎn)基因突變。

3.5谷胱甘肽合成酶缺乏癥的治療進(jìn)展

GSSD是需要終身治療的。治療包括：糾正酸中毒、口服α-生育酚和甜菜堿、避免服用引起溶血的藥物。為了防止出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，大劑量的維生素C(100mg·kg-1·d-1)和維生素E(100～300mg/d)是必須的[5]。維生素E還可以防止出現(xiàn)粒細(xì)胞功能障礙，從而減少急性細(xì)菌感染的發(fā)生率。Ristoff等在2001年一項(xiàng)針對(duì)46例GSSD患者的長(zhǎng)期隨訪研究表明，維生素C和維生素E治療可能會(huì)保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免受損害。重度GSSD患者早期給予維生素C和維生素E治療尤其重要。目前沒(méi)有辦法證實(shí)這些患者何時(shí)會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損害，因此，無(wú)論GSSD患者嚴(yán)重程度如何，都應(yīng)早期給予維生素C和維生素E治療。硒通過(guò)合成硒蛋白具有強(qiáng)大的抗氧化特性，目前已有學(xué)者應(yīng)用于GSSD治療，并取得良好效果[6]。代謝性酸中毒是GSSD重要的臨床特征之一，無(wú)論是急性發(fā)作期或是臨床緩解期，都應(yīng)給予碳酸氫鈉糾正酸中毒[7]，且療效值得肯定。所有治療中應(yīng)避免在6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)缺陷中引起溶血危象的藥物和食物等觸發(fā)因子。

先前，N-乙酰半胱氨酸被用來(lái)作為治療藥物，因其可增加正常人細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平。然而，N-乙酰半胱氨酸已經(jīng)被證實(shí)可增加細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸的水平，而GSSD患者細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸含量已顯著升高，高水平的半胱氨酸具有神經(jīng)毒性，可加重GSSD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[5]。兒童使用對(duì)乙酰氨基酚的有效性及安全性是已經(jīng)被證實(shí)的。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)乙酰氨基酚的毒性反應(yīng)出現(xiàn)在年齡比較小的兒童。但是，Tokatli等人在2007年研究指出，GSSD患者即便使用治療劑量的對(duì)乙酰氨基酚仍可能出現(xiàn)毒性反應(yīng)，誘發(fā)肝毒性。因而，GSSD患者不提倡使用N-乙酰半胱氨酸及對(duì)乙酰氨基酚，應(yīng)引起臨床重視。

由于目前孕產(chǎn)婦群體對(duì)遺傳代謝性疾病篩查認(rèn)知水平較低且主動(dòng)獲知意識(shí)差[8]，因此，以醫(yī)院為主開(kāi)展多渠道、多樣化的健康教育工作以提高新生兒遺傳代謝病篩查認(rèn)知水平是很有必要的，這也將大大提高遺傳代謝性疾病的檢出率。目前本研究2例患者隨訪結(jié)果顯示，尿5-羥脯氨酸均得到良好控制，未再出現(xiàn)代謝性酸中毒、溶血性貧血、黃疸，神經(jīng)系統(tǒng)未見(jiàn)明顯異常，精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育較同齡兒無(wú)明顯落后，臨床預(yù)后良好。這主要?dú)w咎于早期的新生兒遺傳代謝性疾病篩查及對(duì)5-羥脯氨酸尿癥的早期識(shí)別、早期診斷、早期治療。因此，我們呼吁對(duì)臨床發(fā)現(xiàn)不明原因的代謝性酸中毒、溶血性貧血、黃疸，應(yīng)行尿有機(jī)酸檢測(cè)。若發(fā)現(xiàn)尿5-羥脯氨酸水平顯著升高，應(yīng)及時(shí)行GSSD相關(guān)基因?qū)W檢測(cè)，早期給予大劑量維生素C和維生素E治療，可獲得良好預(yù)后。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：肖延風(fēng)]

Geneanalysisandliteraturereviewofglutathionesynthetasedeficiencyintwocases

LIU Chao, WANG Zhi-hua

(DepartmentofGeneticMetabolicEndocrine,Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

ObjectiveTo investigate the clinical and genetic characteristics of glutathione synthase deficiency (GSSD).MethodsThe clinical characteristics of 2 infants diagnosed with 5-oxoprolinuria in Xi’an Children’s Hospital were analyzed retrospectively. The glutathione synthetase (GSS) gene was analyzed by target sequencing method. The high-risk mutations genes were verified by polymerase chain reaction (PCR). The final diagnosis was GSSD and relevant clinical features and genetics were analyzed.ResultsThe clinical manifestations of GSSD were metabolic acidosis, jaundice and hemolytic anemia. One case was detected to be compound heterozygous mutation (E5 c.491Ggt;A and E10 c.847Cgt;T) and the other was homozygous mutation (E5 c.491Ggt; A) by GSS gene analysis.ConclusionE5 c.491Ggt; A gene mutation might be an important gene mutation of GSSD.

5-oxoprolinase; glutathione synthetase (GSS); 5-oxoprolinuria; gene analysis; gene mutation

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.040

R722

A

1673-5293(2017)11-1435-04

2017-07-09

劉 超(1984—)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事兒童內(nèi)分泌及遺傳代謝性疾病診療工作。

汪治華，主任醫(yī)師。