譚淏雯，許臘英

·炮制制劑·

不同級(jí)別的厚樸飲片GC指紋圖譜對(duì)比研究

譚淏雯1，許臘英2*

目的：比較不同級(jí)別的厚樸飲片氣相指紋圖譜, 以相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 探索不同級(jí)別的厚樸飲片的GC指紋圖譜的區(qū)別。方法：將厚樸按不同質(zhì)地、厚度分為三個(gè)級(jí)別：質(zhì)地大于0.60 g/cm3、厚度4～6 mm以上的為優(yōu)級(jí)，質(zhì)地接近0.60 g/cm3、厚度2～4 mm以上的為一級(jí)，質(zhì)地小于0.60 g/cm3、厚度2 mm以下的為統(tǒng)貨。 用氣相色譜法分別對(duì)不同質(zhì)地、厚度的各4批次湖北恩施GAP示范基地的厚樸進(jìn)行分析, 建立厚樸GC指紋圖譜共有模式，比較其區(qū)別。結(jié)果：經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),不同質(zhì)地、厚度的厚樸共有模式之間相似度差別明顯，表明各級(jí)別之間有特征性。結(jié)論：此方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以直接區(qū)分各級(jí)別厚樸，為厚樸飲片分級(jí)方法提供參考依據(jù)。

厚樸飲片；GC指紋圖譜；質(zhì)地；厚度

本項(xiàng)目研究的厚樸為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalisRehd. et Wils.)的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。道地產(chǎn)區(qū)為四川、湖北等省。能行氣化濕、健脾和胃，臨床上用于濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳等癥。厚樸中的揮發(fā)油是其主要藥效成分之一,其中主要含B-桉油醇[2-3],含量＞95%。經(jīng)現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證明,厚樸揮發(fā)油能引起胃液、唾液分泌,加快腸胃蠕動(dòng),有健胃作用等藥理活性[4-9]。有關(guān)厚樸成分研究的文獻(xiàn)很多，但大多都是關(guān)于不同產(chǎn)地厚樸飲片指紋圖譜區(qū)別的研究[10-16]，對(duì)不同質(zhì)地、厚度的厚樸飲片GC指紋圖譜的研究幾乎沒有。本文通過對(duì)不同質(zhì)地、厚度的厚樸飲片,以β桉油醇為指標(biāo)，研究其GC指紋圖譜，來尋找質(zhì)地、厚度與厚樸分級(jí)的關(guān)聯(lián)。

1 儀器、試劑與藥材來源

1.1 儀器與試劑

SHIMAD2UGC -14C氣相色譜儀, HP -5色譜柱(30 m*0.32 mm*0.25 um)。BP -211D型十萬分之一分析天平(西德Sartorius產(chǎn))。所用試劑均為分析純;

β-桉油醇 對(duì)照品由中國生物制品檢驗(yàn)檢定所提供，批號(hào)：11002-201105。

1.2 藥材

實(shí)驗(yàn)用厚樸藥材購于湖北省恩施GAP示范基地,經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張林碧教授鑒定為木蘭科植物厚樸(Magnolia of fi cinalis Rehd. etW ils)的干燥樹皮、根皮和枝皮。

根據(jù)厚樸藥材的不同質(zhì)地和厚度，將厚樸藥材分為三個(gè)級(jí)別：質(zhì)地大于0.60 g.cm-3、厚度4～6 mm以上的為優(yōu)級(jí)，質(zhì)地接近0.60 g.cm-3、厚度2～4 mm以上的為一級(jí)，質(zhì)地小于0.60 g.cm-3、厚度2 mm以下的為統(tǒng)貨。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱∶ HP -5柱(30 m*0.32 mm*0.25 um); 柱前壓：50 kpa,柱流速：1.743 ml*min-1,分流比40：1，尾吹5圈，氣化室溫度：250 ℃，檢測(cè)器：280 ℃。程序升溫：起始溫度50 ℃（2 min）以6 ℃*mim-1升至116 ℃（2 min），再以1 ℃*min-1升至118 ℃（2 min）,再以10 ℃*min-1升至220 ℃（15 min）[6-8]。

2.2 樣品溶液的制備

稱取厚樸粉末各約50 g,按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則2204揮發(fā)油測(cè)定方法,加300 mL純化水浸泡30 min,自揮發(fā)油測(cè)定器上端加純化水至溢入燒瓶中止，加正己烷2 mL,加熱到沸并保持微沸5 h,停止加熱1 h后分取正己烷液,得厚樸樣品溶液備用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取0.3 mg的β桉油醇對(duì)照品溶于25 mL正已烷溶劑中，搖均備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A版)，設(shè)定匹配模板，將譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照，然后進(jìn)行譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體相似性評(píng)價(jià)，考察色譜峰相似度的一致性，結(jié)果其主要共有峰面積RSD＜2%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見圖1，表1。

表1 厚樸飲片氣相指紋圖譜精密度試驗(yàn)相似度分析結(jié)果

50.99980.9995 0.9996 0.9998 1.0000 0.9998對(duì)照0.9997 0.9997 0.9998 0.9999 0.9998 1.0000

圖1 厚樸飲片譜精密度試驗(yàn)GC圖

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在室溫下放置，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)行測(cè)定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A版)，設(shè)定匹配模板，將譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照，然后進(jìn)行譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體相似性評(píng)價(jià)，考察色譜峰相似度的一致性，結(jié)果其主要共有峰面積RSD＜2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見圖2，表2。

表2 厚樸飲片氣相指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度分析結(jié)果

圖2 厚樸飲片穩(wěn)定性試驗(yàn)GC圖

2.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一供試品，平行5份，按供試品溶液制備方法制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A版)，設(shè)定匹配模板，將譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照，然后進(jìn)行譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體相似性評(píng)價(jià)，考察色譜峰相似度的一致性，結(jié)果其主要共有峰面積RSD＜2%表明試驗(yàn)方法重現(xiàn)性較好，結(jié)果見圖3，表3。

表3 厚樸飲片氣相指紋圖譜重現(xiàn)性試驗(yàn)相似度分析結(jié)果表

50.9990 0.99850.9989 0.9980 1.0000 0.9995對(duì)照0.9993 0.9989 0.9993 0.9989 0.9995 1.0000

圖3 厚樸飲片GC指紋圖譜重現(xiàn)性試驗(yàn)色譜圖

2.5 測(cè)定法

分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，即得。

2.5.1 厚樸GC指紋圖譜和共有峰的建立 分別取不同厚度、質(zhì)地的厚樸各10個(gè)供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。記錄各樣品色譜圖。所有組分在45 min內(nèi)洗脫出柱，共計(jì)出峰數(shù)71個(gè)，其中共有峰數(shù)目為34個(gè)見圖4，經(jīng)比較從中選定15個(gè)共有峰作為構(gòu)成厚樸指紋圖譜的穩(wěn)定的特征峰。

圖4 厚樸飲片氣相指紋圖譜

共有峰定性 通過比較樣品與對(duì)照品出峰保留時(shí)間及結(jié)合文獻(xiàn)研究確認(rèn)， 21號(hào)峰為α -丁香烯，22號(hào)峰為γ-杜松烯，23號(hào)峰為α一芹子烯，24號(hào)峰為γ-芹子烯，27號(hào)峰為丁香烯氧化物，29號(hào)峰為茅蒼術(shù)醇，30號(hào)峰為β-桉醇，32號(hào)峰為均三異丙苯。見圖5、圖6、表4。

圖5 β-桉醇GC對(duì)照品圖譜

圖6 厚樸干皮揮發(fā)油總離子流圖

表4 厚樸干皮揮發(fā)油總離子流數(shù)據(jù)

2.5.2 共有模式的生成及相似度的計(jì)算 將圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A版)進(jìn)行數(shù)據(jù)，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.5 min，以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，建立共有模式（即對(duì)照?qǐng)D譜），各樣品與該共有模式比較，結(jié)果見圖7、表5。

圖7 各級(jí)別共有模式相似度及疊加圖

表5 相似度結(jié)果

2.5.3 結(jié)果 根據(jù)厚樸藥材的三個(gè)級(jí)別（ 優(yōu)級(jí) → 一級(jí) → 統(tǒng)貨）分別分析GC共有模式圖譜峰：

a組峰：A3-A4的峰面積比值0.5、0.6、0.8，呈逐漸增大趨勢(shì)。

b組峰：A6-A7-A8的峰面積比值（14：7：100）、（20：20∶100）、（14：16：100），6.7號(hào)峰峰面積比值逐漸減小趨勢(shì)2→1→(＜1)。

c組峰：A11-A12-A13-A14的峰面積比值（0.7：1.4：3.7：1）、（1.5：1.8：5.5：1）、（3：3.5：5：1）內(nèi)部比例不同，峰形不同。

d組峰：A15-A17的峰面積比值3、2、1.5 呈逐漸減小趨勢(shì)。

3 討論

分析三種級(jí)別的厚樸藥材的GC共有模式，各級(jí)別共有模式34個(gè)峰，將優(yōu)級(jí)厚樸前15個(gè)強(qiáng)峰作為特征峰，其他級(jí)別相應(yīng)的這15個(gè)峰作為分子，各共有模式34個(gè)峰面積總和作為分母算得面積的比值，數(shù)據(jù)等級(jí)明顯，符合等級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

三種等級(jí)的共有模式之間的相似度很差，區(qū)別明顯，表明各級(jí)別之間各具有特征性，可以直接區(qū)分各級(jí)別厚樸飲片。

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Comparative study on GC fingerprints of Houpo of different levels

/TAN Hao-wen1, XU La-ying2/ / (1. NO.1 Middle School Affiliated to Central China Normal University, Wuhan 430223, Hubei; 2. Pharmacy School, Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065, Hubei)

Objective:The GC fingerprints of Houpo of different levels were compared. Similarity was used as the evaluation index to explore the difference of different levels of Houpo GC fingerprints.Method:According to different texture and thickness,Houpo was divided into three levels∶ premium class with the texture greater than 0.60 g/cm3and thickness larger than 4 ～ 6mm;first class with texture close to 0.60 g/cm3and thickness of 2 ～ 4mm; fair average quality with texture less than 0.60 g/cm3, and thickness less than 2 mm. GC was applied to analyze four batches Houpo of different textures and thickness from Enshi GAP demonstration base. And the common pattern of GC fingerprints of Houpo was established to compare the difference among them.Result:The similarity of Houpo GC common pattern of different texture and thickness had significant difference which indicated that the different characteristic of Houpo existed among different levels.Conclusion:The sensitivity of this method is high and reproducibility is good. It can directly distinguish the different levels of Houpo, and can provide reference for Houpo classification method.

Houpo; GC fingerprint; texture; thickness

R283.1

A

1674-926X(2017)06-007-04

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)基金（201007012-2）

1.華中師范大學(xué)第一附屬中學(xué)，武漢，湖北，武漢430223；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢，湖北，武漢 430065

譚淏雯，（2000- ），女，學(xué)生。Tel∶13986249486 Email∶450208495@qq.com

許臘英，（1952- ），女，教授，主要從事中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化研究工作。Tel∶18971211681 Email∶xulaying@163.com

2017-3-3

(責(zé)任編輯：傅舒)