陶明寶，鄢玉芬，陳林，劉友平，陳鴻平

·品種品質(zhì)·

瓦楞子及其混偽品成分的比較分析研究

陶明寶，鄢玉芬，陳林，劉友平，陳鴻平

目的：探討瓦楞子及其混偽品在成分上的差異性，為市售瓦楞子的合理安全用藥提供依據(jù)。方法：本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)所有樣品的碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及水解后樣品中的總氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：所有樣品的碳酸鈣含量為90.55 %～99.22 %、水煎液Ca2+含量為0.101 %～0.157 %、水溶性浸出物含量為0.16%～0.59 %、水浸液pH值為9.25～9.52、總氨基酸含量為0.020 %～0.099 %。結(jié)論：瓦楞子及其混偽品碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及總氨基酸含量無(wú)明顯差異。

瓦楞子；混偽品；碳酸鈣；總氨基酸

瓦楞子為蚶科動(dòng)物毛蚶Arca subcrenataLischke、泥蚶Arca granosaLinnaeus或魁蚶Arca in fl ataReeve的貝殼。別名蚶子殼、毛蛤、瓦垅等[1]，具有消痰化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)，制酸止痛的功效，主治頑痰膠結(jié)、黏稠難咯、癭瘤、瘰疬、癥瘕痞塊、胃痛泛酸。藥材藥效明確，應(yīng)用廣泛，但其混偽品較多，質(zhì)量控制尚不完善。瓦楞子及其混偽品主要由無(wú)機(jī)成分和有機(jī)成分組成，其中以無(wú)機(jī)成分為主，主要由碳酸鈣組成，有機(jī)成分以含量不等的蛋白質(zhì)為主。文獻(xiàn)報(bào)道，瓦楞子以碳酸鈣為主[2-4]，含有14～16種氨基酸[5-6]。

目前，蚶科同屬不同種及不同屬的品種較多，由于偽品與瓦楞子極為相似，不易區(qū)別，各地經(jīng)銷使用常有混偽現(xiàn)象，從而造成了瓦楞子入藥品種的混亂。本實(shí)驗(yàn)共收集到舟蚶、密肋粗飾蚶、結(jié)蚶、異毛蚶、球蚶五種偽品，均混合在瓦楞子中銷售使用，瓦楞子用藥的安全性、有效性及合理性難以保障。因此，本研究以瓦楞子及其混偽品的主要成分為研究目標(biāo)，從碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及總氨基酸含量五個(gè)方面進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究。通過(guò)比較分析研究，以期為瓦楞子臨床用藥的安全性、合理性提供基礎(chǔ)，同時(shí)為瓦楞子擴(kuò)大藥源提供一定的依據(jù)。

1 材料

UV-2600紫外分光光度計(jì)(日本島津)；QT-1旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；85-2控溫磁力攪拌器(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；十萬(wàn)分之一BP211D電子天平，萬(wàn)分之一BP121S9電子天平（德國(guó)Sartouris股份有限公司）；SB25-12D 超聲清洗機(jī)（上海冠特超聲儀器有限公司）；UPT-I-10T 優(yōu)普系列超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

甘氨酸對(duì)照品(140689-200401)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；基準(zhǔn)氧化鋅(2016042101)、茚三酮、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、苯酚、氫氧化鉀、氯化銨、乙二胺四乙酸二鈉、鈣黃綠素、甲基紅、氯化鈉、氯化鉀、氨水(氫氧化銨)、鉻黑T均為分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

所有藥材均為市售品及產(chǎn)地收集，共收集56批，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院盧先明教授鑒定，其中分離鑒定出毛蚶8批、泥蚶18批、魁蚶8批、舟蚶3批、密肋粗飾蚶4批、結(jié)蚶4批、異毛蚶8批、球蚶3批，樣品收集信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

in fl ata Reeve）東山KH-17魁蚶（Arca in fl ata Reeve）福建省廈門市福建廈門2016/11/18

?

所收集的樣品中，瓦楞子偽品混在其中，少則一種多達(dá)五種以上，其混偽品主要有密肋粗飾蚶、結(jié)蚶、舟蚶、球蚶、異毛蚶，混偽品在樣品中比重較大，外觀性狀與瓦楞子極為相似；所收集的樣品中，魁蚶中多混有密肋粗飾蚶，毛蚶中多混有異毛蚶，泥蚶中多混有結(jié)蚶；目前市面上主要流通的偽品為異毛蚶和球蚶，其次是密肋粗飾蚶，流通較少的是結(jié)蚶和舟蚶。瓦楞子的三個(gè)基源具有明顯的地域特征，泥蚶主要產(chǎn)自福建，魁蚶主要產(chǎn)自山東、廣東，毛蚶主要產(chǎn)自廣西。

2 方法與結(jié)果

2.1 總鈣含量測(cè)定

2.1.1 EDTA-2Na滴定液標(biāo)定 取于約800 ℃灼燒至恒重的基準(zhǔn)物氧化鋅0.12 g，精密稱定5份，加稀鹽酸3 mL使溶解，加水25 mL，加0.025 %甲基紅的乙醇溶液1滴，滴加氨試液至溶液顯微黃色，加水25 mL與氨-氯化銨緩沖液（pH=10.0）10 mL，再加鉻黑T指示劑少量，用本液滴定至溶液由紫色變?yōu)榧兯{(lán)色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL EDTA-2Na（0.05 moL?L-1）相當(dāng)于4.069 mg的氧化鋅。結(jié)果表明，EDTA-2Na溶液平均消耗量為29.41 mL，經(jīng)計(jì)算本滴定液濃度為0.0503 moL?L-1，每1 mL此滴定液相當(dāng)于5.030 mg的碳酸鈣。

計(jì)算公式：C=0.05*m/[0.004069*(V1-V2)]

（C為EDTA-2Na滴定液濃度moL?L-1；m為基準(zhǔn)氧化鋅的質(zhì)量g；V1為EDTA-2Na滴定液用量mL；V2為空白試驗(yàn)EDTA-2Na滴定液用量mL）

2.1.2 含量測(cè)定 參照《中國(guó)藥典》2015年版[7]，蛤殼項(xiàng)下碳酸鈣含量測(cè)定方法，取本品細(xì)粉約0.12 g，精密稱定，置錐形瓶中，加稀鹽酸3 mL，加熱至微沸使溶解，加水100 mL與甲基紅指示液1滴，滴加氫氧化鉀試液至顯黃色，繼續(xù)多加10 mL，再加鈣黃綠素指示劑少量，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05 moL?L-1)滴定至溶液黃綠色熒光消失而顯橙色。按上述方法對(duì)收集的樣品進(jìn)行碳酸鈣含量測(cè)定，計(jì)算公式：總鈣含量（%）=（耗EDTA-2Na量（mL）*5.030）*10-3/藥材質(zhì)量（g）*100 %，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 水煎液Ca2+含量測(cè)定

將供試品粉碎過(guò)60目篩，取粉末2 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加水50 mL，回流煮沸0.5 h，冷卻后用水補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，濾液備用。精密吸取濾液10 mL于250 mL錐形瓶中，加稀鹽酸1 mL，加水50 mL，加甲基紅指示劑1滴，滴加氫氧化鉀試液呈黃色，再加氫氧化鉀試液10 mL，加鈣黃綠素指示劑少許，用乙二胺四醋酸滴定液滴定至溶液黃綠色熒光消失而顯橙色[8-9]。按上述方法對(duì)收集的樣品進(jìn)行水煎液Ca2+含量測(cè)定，計(jì)算公式：水煎液Ca2+含量（%）=水煎液Ca2+的量（g）/藥材質(zhì)量（g）*100 %，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 水溶性浸出物含量測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則浸出物測(cè)定法測(cè)定[10]，取供試品約2～4 g，精密稱定，置100～250 mL的錐形瓶中，精密加水50～100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過(guò)，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 °C干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。按上述方法對(duì)收集的樣品進(jìn)行水溶性浸出物的測(cè)定，計(jì)算公式：水溶性浸出物含量（%）=水溶性浸出物重量（g）/藥材質(zhì)量（g）*100 %，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 水浸液pH值測(cè)定

將供試品粉碎過(guò)80目篩，取粉末0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入20 mL煮沸的蒸餾水，振搖10 min，放置30 min，濾過(guò)，濾液用精密pH計(jì)測(cè)其pH值[11]。按上述方法對(duì)收集的樣品進(jìn)行水浸液pH值的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 總氨基酸測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘氨酸對(duì)照品5 mg于100 mL量瓶中，加蒸餾水適量溶解，定容至刻度，搖勻，即得(每1 mL含甘氨酸0.05 mg)。

2.5.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末0.5 g，精密稱定，加人2 mL乙醇，混勻，置磁力攪拌器上攪拌，緩慢加入稀鹽酸溶液5 mL，攪拌至反應(yīng)完全，離心，棄去上清，揮干乙醇即得殼角蛋白。將得到的殼角蛋白轉(zhuǎn)移至10 mL安瓿瓶中，加人5 mL 6 moL?L-1鹽酸溶液，加人2～3滴苯酚，充N2封口，置110 ℃烘箱中水解24 h后取出，放冷，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入6 moL?L-1氫氧化鈉溶液5 mL定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后即得。取一定量水解樣品，加入1 mL pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液混勻，加入1.5 mL 2 %茚三酮溶液，于100 ℃沸水浴中反應(yīng)20 min后，取出放冷，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，以蒸餾水洗滌試管3次后，定容至刻度，混勻，于568 nm處測(cè)定吸光度。

2.5.3 總氨基酸含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密移取不同濃度的甘氨酸對(duì)照品溶液1 mL于具塞試管中，按顯色方法顯色，于568 nm進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=229.15X-0.003，相關(guān)系數(shù)r為0.9994，甘氨酸在0.0101～0.0455 mg線性關(guān)系良好。

準(zhǔn)確度

精密移取瓦楞子樣品溶液0.5 mL于具塞試管中，平行制備6份，分別加入甘氨酸對(duì)照品溶液（0.056 mg?mL-1）0.5 mL，按顯色方法顯色，于568 nm處測(cè)定吸光度值，按公式計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，6份樣品的回收率均在95 %～105 %，平均回收率為101.8 %，RSD為3.1 %，表明該方法準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表2。

表2 總氨基酸加樣回收率

重復(fù)性試驗(yàn)

按照供試品制備方法，平行制備六份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算結(jié)果的RSD，結(jié)果顯示RSD為3.5%，表明重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)

按供試品制備方法，平行制備6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示RSD為0.09 %，表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、15、30、45、60 min時(shí)測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示RSD為0.35 %，供試品在1 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.4 樣品測(cè)定 按實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)所有樣品水解液中的總氨基酸進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式：總氨基酸含量（%）=總氨基酸的量（g）/藥材質(zhì)量（g）*100%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 所有樣品成分含量比較

JH-0196.670.101 0.369.36 0.039 JH-0697.780.106 0.389.38 0.043 JH-1895.630.104 0.259.37 0.057 JH-2197.750.101 0.169.38 0.063 YH-1896.310.123 0.229.40 0.041 YH-1995.230.136 0.289.41 0.074結(jié)蚶（Arcanodifera）

結(jié)果表明，所有樣品碳酸鈣含量為90.55%～99.22 %，水煎液Ca2+含量為0.101 %～0.157 %，水溶性浸出物含量為0.16 %～0.59 %，水浸液pH值為9.25～9.52，總氨基酸含量為0.020 %～0.099 %。所有樣品碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量及水浸液pH值之間的微小差異可能與不同的種，不同的產(chǎn)地以及購(gòu)買時(shí)藥材的清潔程度有關(guān)。所有樣品氨基酸含量的差異可能與不同的種、不同的產(chǎn)地、藥材殘肉的多少、藥材的清潔程度有關(guān)。藥材殘肉多，氨基酸含量則偏高，藥材殘肉少、清潔度低，氨基酸含量則偏低。因此，從總體上比較分析，瓦楞子及其混偽品的碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量、水浸液pH值及總氨基酸含量無(wú)明顯差異。

3 討論

樣品收集過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)瓦楞子偽品較多，且在樣品中比重較大，偽品主要有密肋粗飾蚶、結(jié)蚶、舟蚶、球蚶、異毛蚶；市面上主要流通的偽品為異毛蚶和球蚶，其次是密肋粗飾蚶，流通較少的是結(jié)蚶和舟蚶。瓦楞子的三個(gè)基源具有明顯的地域特征，泥蚶主要產(chǎn)自福建，魁蚶主要產(chǎn)自山東、廣東，毛蚶主要產(chǎn)自廣西，且有毛蚶的樣品中基本都混雜著異毛蚶。

本研究從5方面對(duì)瓦楞子及其混偽品共8個(gè)種進(jìn)行了系統(tǒng)的比較分析研究，通過(guò)對(duì)碳酸鈣含量、水煎液Ca2+含量、水溶性浸出物含量及水浸液pH值的測(cè)定，結(jié)果表明瓦楞子正品（毛蚶、泥蚶、魁蚶）與偽品（結(jié)蚶、球蚶、異毛蚶、舟蚶、密肋粗飾蚶）之間無(wú)明顯差異；通過(guò)采用茚三酮顯色法對(duì)瓦楞子及其混偽品中總氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果顯示，瓦楞子正品與偽品間也無(wú)明顯差異。

本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)瓦楞子及其混偽品的碳酸鈣和氨基酸進(jìn)行了比較分析研究，研究發(fā)現(xiàn)瓦楞子及其混偽品間在成分上無(wú)明顯差異，這為瓦楞子臨床用藥的安全性、合理性提供了一定的依據(jù)，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也將繼續(xù)借助差熱分析、X-射線衍射和X-熒光分析等手段，進(jìn)一步對(duì)瓦楞子及其混偽品的碳酸鈣晶型、元素種類等進(jìn)行比較分析研究，以確保市售瓦楞子的安全性、合理性及有效性，同時(shí)為資源的充分利用及其臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

[1] 《全國(guó)中草藥匯編》編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編 上[M ].北京∶人民衛(wèi)生出版社,1975∶181.

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Comparative analysis of composition of Walengzi and its counterfeit

/TAO Ming-bao, YAN Yu-fen, CHEN Lin, LIU You-ping, CHEN Hong-ping//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To discuss the differences in the composition of Walengzi and its counterfeit, and provide the basis for the rational use of the commercially available Walengzi.Method:The content of calcium carbonate in all samples, the content of Ca2+in water, the content of water soluble extract, the pH value of aqueous solution and the total amino acid content in the sample after hydrolysis were detected.Result:The content of calcium carbonate was 90.55 %～99.22 %. The content of Ca2+in the decoction was 0.101 %～0.157 %. The content of water soluble extract was 0.16 %～0.59 %. The pH value of the aqueous solution was 9.25～9.52. The total amino acid content was 0.020 %～0.099 %.Conclusion:No significant differences in the content of calcium carbonate, the content of Ca2+, the content of water soluble extract, the pH value and total amino acid content of water extract are found among Walengzi and its counterfeit.

Walengzi; counterfeit goods; calcium carbonate; total amino acid

R 282.6

A

1674-926X(2017)06-002-05

《全國(guó)中藥飲片炮制規(guī)范》研究項(xiàng)目(2015-YP-48)

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

陶明寶（1992-），女，在讀碩士，從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究Tel∶18728431648 Email∶2587578725@qq.com

陳鴻平（1980-），女，博士，從事中藥炮制、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究Tel∶13982283303 Email∶chenhongping@126.com

2017-07-20

（責(zé)任編輯：胡慧玲）