,,, ,,,繼棟,,*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;2.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西南寧 530004)

無(wú)黑色素普魯蘭多糖出芽短梗霉的選育

張若璇1,孫帥楠1,孫欽菊1,劉鑫1,杭方學(xué)1,2,劉繼棟1,2,*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;2.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西南寧 530004)

為選育一株高產(chǎn)無(wú)黑色素普魯蘭多糖的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans),以A.pullulansAs.40329和A.pullulansAs.3#為出發(fā)菌株,通過紫外誘變(15 W)篩選出三株正突變菌株作為親本。在此基礎(chǔ)上,對(duì)三株親本制備原生質(zhì)體并采用35%的PEG4000介導(dǎo)進(jìn)行全基因重組(Genome shuffling,GS)。隨后,經(jīng)雙親滅活篩選后獲得A.pullulans的全基因重組菌F2-6。結(jié)果表明,菌株F2-6遺傳性狀穩(wěn)定且發(fā)酵多糖產(chǎn)物中近乎無(wú)黑色素(OD654維持在0.02左右),多糖產(chǎn)量提高至(19.53±0.39) g/L,比原始菌As.3#提高119.69%,表明重組菌F2-6具有工業(yè)化生產(chǎn)普魯蘭多糖的潛能。

出芽短梗霉,普魯蘭多糖,全基因重組,黑色素

普魯蘭多糖是一種極性真菌胞外多糖,具有良好的成膜性[1]、抗菌性[2]、耐熱性[3]等特性,廣泛應(yīng)用于食品和生物制藥等領(lǐng)域[4-5]。目前,工業(yè)上多通過出芽短桿霉(Aureobasidiumpullulans)發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖,但是普遍存在產(chǎn)量低、產(chǎn)物黑色素累積等問題,提高了純化成本并限制了其應(yīng)用范圍[6]。學(xué)者曾通過控制培養(yǎng)基中碳源[7]、氮源[8]及pH[9]等方式調(diào)控A.pullulans的生產(chǎn)能力及多糖產(chǎn)物的黑色素含量,但仍未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此,選育一株高產(chǎn)普魯蘭多糖且不積累黑色素的菌株是當(dāng)前急需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。

目前,由于A.pullulans的表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建仍未完善,從普魯蘭多糖合成機(jī)理及基因遺傳機(jī)理入手改造出芽短桿霉菌株還面臨諸多困難。雖然有報(bào)道中曾將普魯蘭多糖的編碼基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)等宿主菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)[10],但其多糖產(chǎn)物在食品、藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用存在安全性爭(zhēng)議[11]。當(dāng)前,對(duì)A.pullulans的遺傳改造仍以傳統(tǒng)誘變方式為主。王雪松等[12]使用He-Ne激光對(duì)A.pullulans原生質(zhì)體進(jìn)行誘變,突變菌株普魯蘭多糖的含量增加到了26.65 g/L,是原始菌株的10.6倍,報(bào)道中并未提及誘變菌發(fā)酵產(chǎn)物的黑色素積累情況。靳建忠等[13]通過紫外誘變的方法對(duì)菌株A.pullulansNG進(jìn)行改良,獲得一株高產(chǎn)無(wú)黑色素普魯蘭多糖的突變株UVMU3-1,然其搖瓶水平的多糖產(chǎn)量在改組前后并未發(fā)生明顯變化。萬(wàn)翠香[14]等采用紫外、亞硝基胍及硫酸二乙酯對(duì)A.pullulans進(jìn)行了多輪誘變,獲得的變異菌P1012的黑色素產(chǎn)量較低,其多糖的積累量提高至28.01 g/L。然而,由于傳統(tǒng)誘變的方式需要進(jìn)行大量誘變與篩選過程,正向突變發(fā)生的幾率較小且不可控,導(dǎo)致育種效率較低。

基因改組技術(shù)基于對(duì)發(fā)菌株的遺傳信息的保守性高效定向改造,并未進(jìn)入任何外源遺傳信息,可以使研究人員在短時(shí)間內(nèi)選育到所需的菌株[15]。資料顯示,兩輪基因改組得到的結(jié)果大致相當(dāng)于傳統(tǒng)誘變方法20輪的誘變與篩選[16]。目前,在普魯蘭多糖的高產(chǎn)菌株選育方面,全基因重組(GS)得到了研究者的廣泛關(guān)注。如馮印[17]等對(duì)A.pullulans進(jìn)行全基因重組獲得的改組菌的多糖產(chǎn)量分別比出發(fā)菌株提高了71.22%,但并未提及改組菌多糖產(chǎn)物的顏色。Kang等[18]通過基因組改組處理A.pullulansN3.387,其產(chǎn)物產(chǎn)量提高至20.7 g/L,相對(duì)于野生菌株提高了179.7%,同樣的,該改組菌產(chǎn)生的多糖產(chǎn)物也含有黑色素成分。張晶[19]等通過GS,選育了2株改組菌,其多糖產(chǎn)量提高至42.38 g/L及42.6 g/L,同時(shí),其發(fā)酵液OD654值比出發(fā)菌株分別降低了17.30%和20.57%,表明其產(chǎn)物黑色素成分含量有所降低。

基于目前尚未有適合工業(yè)化應(yīng)用不積累黑色素的A.pullulans菌株,本研究擬以A.pullulansAs.40329和As.3#為出發(fā)菌,通過紫外誘變構(gòu)建親本突變庫(kù),選育性狀優(yōu)良的菌株進(jìn)行全基因重組,以期獲得一株高產(chǎn)無(wú)黑色素普魯蘭多糖的重組菌。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

出芽短桿霉(A.pullulans)As.40329和(A.pullulans)As.3# 本研究室保藏;蔗糖、無(wú)水乙醇、Tris、氯化鈉 均為常規(guī)分析純，上海國(guó)藥集團(tuán);溶菌酶 活性:>22800 U/mg,生工生物工程(上海)股份有限公司;普魯蘭標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;種子培養(yǎng)基(g/L) 磷酸氫二鉀6,磷酸二氫鉀2,硝酸鈉1.54,氯化鈉2,七水硫酸鎂0.04,四水氯化錳0.006,六水氯化鐵0.002,鹽酸硫胺素0.004,葡萄糖30,酵母膏1;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 磷酸氫二鉀7,硫酸銨0.4,氯化鈉1,硫酸鎂0.1,酵母膏1.5,蔗糖50;PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(g/L) 馬鈴薯200,瓊脂20,葡萄糖20;雙層再生培養(yǎng)基 上層培養(yǎng)基(g/L):蔗糖60,磷酸氫二鉀5,氯化鈉1,硫酸鎂0.2,硫酸銨0.6,酵母膏2.5,瓊脂粉15;下層培養(yǎng)基瓊脂粉23,其他成分與上層培養(yǎng)基相同;以上培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)初始pH為5.8,121 ℃滅菌20 min;高滲緩沖液 25 mmol/L的Tris-HCl,含85.5 g/L蔗糖,pH6.0;酶緩沖液 2.365 g/L的KCl,25 mmol/L的Tris-HCl,pH5.0;預(yù)處理溶液 0.05 mol/Lβ-巰基乙醇,pH5.0。上述緩沖液均經(jīng)無(wú)菌處理后備用。

YXQ-LS-18SI自動(dòng)型手提滅菌器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;BSD-YX(F)2600特大容量立式搖床 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;SHP-150恒溫生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司;VS-840K-U潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;5418R小型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德(Eppendorf)中國(guó)有限公司;Mettler Toledo AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;微孔濾膜針孔過濾器 德國(guó)MEMBRANA公司;OLYMPUS CX41-32C02奧林巴斯生物顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 親本突變庫(kù)的構(gòu)建 將A.pullulansAs.40329和A.pullulansAs.3#培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,分別收集菌體并用10 mL無(wú)菌ddH2O洗滌兩次,然后重懸于10 mL的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH6.0)中。隨后,取1 mL菌懸液稀釋1000倍倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中,配合無(wú)菌攪拌子,放置于磁力攪拌器上,將培養(yǎng)皿置于紫外燈下(15 W)照射,照射距離為30 cm,照射時(shí)間為0、60、90、120、150、180、210、240、270、300 s,用移液槍吸取0.1 mL菌懸液于PDA瓊脂培養(yǎng)基上涂布,每個(gè)處理使用三個(gè)平板,不進(jìn)行照射(0 s)的菌懸液涂布作為空白對(duì)照;處理后立即用紙包裹,避光倒置,28 ℃下培養(yǎng)72 h。通過統(tǒng)計(jì)平板上菌落的數(shù)量,根據(jù)公式存活率(%)=Y/X×100,其中:X為對(duì)照組的菌落數(shù)平均值,Y為誘變處理組的菌落數(shù)平均值,計(jì)算誘變存活率,并確定最適誘變條件。同時(shí),對(duì)出發(fā)菌及存活株進(jìn)行多次誘變處理,利用顯微鏡觀察誘變株的菌體形態(tài)。

1.2.2 GS的選育 GS的方法參照參考文獻(xiàn)[20]。將在紫外誘變中篩選出的優(yōu)良菌種As.302、As.406、As.401活化至對(duì)數(shù)期,向菌液中加入1%的預(yù)處理溶液搖床培養(yǎng)1 h,離心收集菌體并用高滲緩沖液洗滌兩次,隨后用等體積高滲緩沖液重懸,控制菌懸液菌體濃度在108cfu/mL左右。接下來(lái)向菌懸液中加入2 mg/mL的溶菌酶,28 ℃水浴酶解1～2 h,離心收集菌體,經(jīng)高滲穩(wěn)定液洗滌2次并重懸于高滲穩(wěn)定液中。將上述原生質(zhì)體懸浮液兩兩等量混合,55 ℃水浴熱滅活處理120 min,在35%的PEG4000介導(dǎo)下進(jìn)行全基因組隨機(jī)改組。每一輪GS結(jié)束后,選擇普魯蘭多糖產(chǎn)量增加最明顯及產(chǎn)物較明亮的改組菌進(jìn)行發(fā)酵,每株菌三個(gè)平行。根據(jù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果,篩選出性狀優(yōu)良的三株菌作為下一輪GS的出發(fā)菌株。

1.2.3 突變株的篩選

1.2.3.1 初篩 將未經(jīng)誘變的菌體和突變株或融合株制成菌懸液,分兩組,分別稀釋到同樣的倍數(shù),涂布于含有0.05%曲利苯藍(lán)的雙層再生培養(yǎng)基,28 ℃倒置培養(yǎng)72 h,以未經(jīng)誘變的一組為對(duì)照。挑取平板上菌落直徑大,顏色深,表面濕潤(rùn)的變異株。

1.2.3.2 復(fù)篩 將初篩后的菌株接種到種子培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96 h,選出多糖含量明顯提高且色素明顯減少的1～2株。

1.2.4 普魯蘭多糖的測(cè)定 向15 mL發(fā)酵上清液中添加2倍體積的95%乙醇,4 ℃靜置過夜,5000 r/min離心15 min,沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌兩次,將沉淀于70 ℃烘至恒重,稱量記錄[21]。多糖含量計(jì)算公式:

多糖含量(g/L)=(M實(shí)重-M空重)×1000/15

其中:M空重為烘至恒重稱量瓶的重量(g),M實(shí)重為烘至恒重多糖和稱量瓶的重量(g)。

1.2.5 紅外光譜檢測(cè)(FT-IR) 取普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品與干燥的多糖沉淀樣品1～2 mg分別置于瑪瑙研磨體中,加入干燥的溴化鉀粉末100～200 mg混合均勻,置于不銹鋼磨具中抽真空后,用壓片機(jī)進(jìn)行壓片處理,壓好的薄片置于傅里葉紅外光譜儀中進(jìn)行紅外掃描處理。隨后,將得到的樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)與普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì),具體方法參照文獻(xiàn)[22]。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 8.6處理和Adobe Illustrator CS5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1親本突變庫(kù)的構(gòu)建

為了達(dá)到更好的育種效果,研究者往往通過誘變處理出發(fā)菌株,并以篩選到的正突變株作為GS的出發(fā)菌株[23]。本研究以A.pullulansAs.40329和As.3#為出發(fā)菌株,采用紫外誘變處理以建立改良的親本突變庫(kù)。在存活率為20%～30%時(shí),正突變幾率更高[24],由紫外誘變存活率結(jié)果(圖1)可知,As.40329選擇紫外線誘變時(shí)間為180 s,此時(shí)存活率為28.4%,As.3#選擇紫外誘變時(shí)間為150 s,存活率為19.7%。

圖1 紫外誘變存活曲線

經(jīng)初篩、復(fù)篩后,獲得As. 301～As. 305,As. 401～As. 407共12株多糖產(chǎn)量較高且色素較少的親本突變株。其中,以As. 3#為親本得到的突變株As. 302的多糖產(chǎn)量為(14.28±0.36) g/L,以As. 40329為親本獲得的突變株As. 401和As. 406的多糖產(chǎn)量分別為(9.18±0.2) g/L和(19.57±0.42) g/L(圖2)。進(jìn)一步對(duì)As. 302、As. 401和As. 406三株菌的發(fā)酵產(chǎn)物及相應(yīng)的菌體形態(tài)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3所示,As. 302產(chǎn)物黑色素含量低于As. 406,且與As. 406相比,As. 302產(chǎn)孢子能力較低。值得注意的是,As. 401多糖產(chǎn)物黑色素含量較低,菌體形態(tài)鏡檢結(jié)果顯示,其呈現(xiàn)較明顯的類酵母形態(tài)。這個(gè)結(jié)果可能與Li等[25]的報(bào)道類似,他們發(fā)現(xiàn)新分離的A.pullulansNG的細(xì)胞形態(tài)及產(chǎn)物普魯蘭多糖中是否含有黑色素,與培養(yǎng)基的pH及氮源含量不同所導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)差異有關(guān)。綜上,選擇誘變株中兩個(gè)多糖產(chǎn)量最高的As. 302和As. 406,以及多糖產(chǎn)物黑色素產(chǎn)量低的誘變株As. 401進(jìn)行后續(xù)的GS。

圖2 A. pullulans紫外誘變突變株發(fā)酵產(chǎn)多糖情況

圖3 普魯蘭多糖(A)和出芽短梗霉細(xì)胞形態(tài)(B)

2.2A.pullulans的GS選育

將紫外誘變獲得的As. 302、As. 406及As. 401進(jìn)行首輪基因組改組。由于曲利苯藍(lán)與多糖分子進(jìn)行結(jié)合后會(huì)生成藍(lán)色復(fù)合物,且其顏色的深淺與多糖含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[26]。因此,可以通過觀察改組菌的菌落大小、顏色來(lái)衡量改組菌的多糖生產(chǎn)能力。本研究中,通過曲利苯藍(lán)平板初篩,選出了7株原生質(zhì)體較大且顏色較深的菌株,分別命名為F1-1～F1-7,并對(duì)這7株菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證,結(jié)果見圖4。其中,F1-2多糖產(chǎn)量達(dá)到(20.75±0.45) g/L,其多糖產(chǎn)物為墨綠色;F1-6所產(chǎn)多糖呈淺黃白色,產(chǎn)量為(16.75±0.41) g/L;F1-7所產(chǎn)多糖近乎為純白色,產(chǎn)量達(dá)到(15.86±0.40) g/L。通過綜合對(duì)比F1-1～F1-7的發(fā)酵性能及產(chǎn)物特征,選擇F1-2、F1-6及F1-7作為下一輪GS的出發(fā)菌株。

通過新一輪的GS,利用與上輪相同的方法進(jìn)行初篩,獲得了F2-1～F2-7共7株改組菌。發(fā)酵結(jié)果表明,F2-6多糖產(chǎn)物為純白色,多糖產(chǎn)量達(dá)到(19.53±0.39) g/L,相較于無(wú)色素出發(fā)菌As.401和淺色原始菌As.3#,其多糖產(chǎn)量分別提高了112.75%、119.69%(圖4)。在接下來(lái)的研究中,又進(jìn)行了多輪GS,但改組菌生產(chǎn)無(wú)黑色素多糖的能力并未超過F2-6。因此,確定F2-6為獲得的目的菌株。

2.3F2-6的發(fā)酵驗(yàn)證

由圖5可知,在2%的接種條件下,菌株F2-6在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)并未呈現(xiàn)明顯的停滯,其生物量在0～60 h快速增長(zhǎng),60 h之后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期,生物量最高為(20.42±0.69) g/L。在搖瓶培養(yǎng)的前60 h,多糖產(chǎn)量無(wú)明顯增加,但在60～96 h內(nèi)迅速上升,96 h時(shí)達(dá)到最高產(chǎn)量(19.55±0.79) g/L。由于OD654值通常用來(lái)評(píng)估發(fā)酵液的顏色變化,以空白發(fā)酵液為對(duì)照,用以表征發(fā)酵液中黑色素的積累[14]。在整個(gè)發(fā)酵過程中,發(fā)酵液的OD654值一直維持在0.02左右,表明發(fā)酵液中無(wú)明顯黑色素積累。同時(shí),根據(jù)菌體F2-6的生物量和普魯蘭多糖產(chǎn)量綜合確定最適發(fā)酵時(shí)間為96 h。

表1 菌株F2-6的遺傳穩(wěn)定性

圖4 A. pullulans的全基因重組后普魯蘭糖的產(chǎn)量

圖5 出芽短梗霉F2-6的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為考察改組菌的遺傳穩(wěn)定性,對(duì)獲得的高產(chǎn)無(wú)色素普魯蘭多糖菌株F2-6進(jìn)行傳代分析,表1結(jié)果表明,經(jīng)過8代多糖產(chǎn)量浮動(dòng)較小,說明菌株F2-6的遺傳性狀較為穩(wěn)定,并未出現(xiàn)大幅度降低。

2.4多糖產(chǎn)物的紅外光譜分析

為考察產(chǎn)品是否為普魯蘭多糖,對(duì)普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品和F2-6發(fā)酵提取的粗多糖進(jìn)行了紅外光譜分析,結(jié)果見圖6。在普魯蘭多糖的特征吸收區(qū)域(1750～750 cm-1),二者顯示出相似的吸收特征,表明F2-6發(fā)酵產(chǎn)生的多糖與標(biāo)準(zhǔn)品普魯蘭多糖呈現(xiàn)相同或相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。其中,3500～3200 cm-1的吸收為O-H的伸縮振動(dòng),與樣品的含水量有關(guān)[27]。

圖6 普魯蘭多糖紅外光譜圖

3 結(jié)論與討論

本文以A.pullulansAs.40329和A.pullulansAs.3#為出發(fā)菌株,獲得了As. 302、As. 406及As. 401三株親本正突變株。隨后,對(duì)三株親本制備原生質(zhì)體并采用35% PEG4000介導(dǎo)進(jìn)行了兩輪全基因改組后,成功選育出一株高產(chǎn)普魯蘭糖且?guī)缀醪划a(chǎn)黑色素的菌株F2-6。菌株F2-6能夠較為穩(wěn)定的遺傳,在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h后,普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)到(19.53±0.39) g/L,比黑色素積累能力弱的原始菌As.3#提高了119.69%。與萬(wàn)翠香[14]等人的報(bào)導(dǎo)相比,菌株F2-6的普魯蘭多糖的產(chǎn)量相對(duì)偏低,但其OD654維持在0.02左右,低于報(bào)道值。本研究為高產(chǎn)無(wú)黑色素普魯蘭多糖的出芽短桿霉工業(yè)生產(chǎn)候選菌株的育種提供了一種快速可行的方式,也為其他工業(yè)生產(chǎn)菌株的育種提供借鑒。

隨著A.pullulansAY4全基因組的公布[28],加強(qiáng)對(duì)其功能解析及操作系統(tǒng)構(gòu)建方面的研究,進(jìn)而從全細(xì)胞角度對(duì)A.pullulans進(jìn)行無(wú)抗性代謝途徑改造,將有助于提高A.pullulans的普魯蘭多糖產(chǎn)量。同時(shí),利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)等技術(shù)對(duì)比出發(fā)菌與無(wú)黑色素積累能力的改組菌之間的全細(xì)胞水平表達(dá)差異,將有助于從分子層面揭示黑色素在A.pullulans體內(nèi)的形成機(jī)理。

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Breedingofapigment-freepullulanproductionmutantstrainofAureobasidiumpullulans

ZHANGRuo-xuan1,SUNShuai-nan1,SUNQin-ju1,LIUXin1,HANGFang-xue1,2,LIUJi-dong1,2,*

(1.Light Industry and Food Engineering Institute of Guangxi University,Nanning 530004,China;2.Guangxi Sugar Industry Collaborative Innovation Center,Nanning 530004,China)

To screen anAureobasidiumpullulansthat could be used for the production of pigment-free pullulan,A.pullulansAs.40329 andA.pullulansAs.3# were used as hosts in the present study. Three positive mutants were obtained as parents after ultraviolet(15 W)induced mutation of the two hosts,followed with genome shuffling(GS)that mediated by 35% PEG 4000,and a s

TableA.pullulansstrain F2-6 was obtained after parental inactivation. Nearly no pigment was detected in the culture ofA.pullulansF2-6,and pullulan production reached to(19.53±0.39) g/L,119.69% higher than that ofA.pullulansAs.3#. The results indicated thatA.pullulansF2-6 could be used as a potential strain in industrial production process.

Aureobasidiumpullulans;pullulan;genome shuffling;pigment

2017-04-25

張若璇(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)，E-mail：genus_rosa@163.com。

*

劉繼棟(1980-)，男，博士，講師，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)，E-mail：liujd@gxu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460026)；廣西壯族自治區(qū)教育廳科研(重點(diǎn))項(xiàng)目基金(ZD2014001)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)22-0109-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.022