戶(hù) 勛,袁素素,葉秀娟,鄒華松

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

紅花羊蹄甲種子活性物質(zhì)提取及其抑菌作用研究

戶(hù) 勛,袁素素,葉秀娟,鄒華松?

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

為了驗(yàn)證紅花羊蹄甲種子提取物是否有抑菌活性,通過(guò)超聲波破碎提取紅花羊蹄甲種子的活性物質(zhì),再由超濾離心管分離其中的蛋白。平板抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果表明,該活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、番茄青枯菌、柑橘潰瘍病菌和煙草野火細(xì)菌6種病原菌均有抑制作用。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,抑菌物質(zhì)不是蛋白質(zhì)組分。

紅花羊蹄甲；抑菌活性；提??；植物病原菌

在藥理學(xué)研究和藥用價(jià)值上,羊蹄甲是一個(gè)非常好的研究對(duì)象。羊蹄甲的樹(shù)皮、根、葉可做藥用,具有補(bǔ)腎氣,提神,止血,鎮(zhèn)咳等功效,我國(guó)西南民間把羊蹄甲用于治療糖尿病(尚小雅等,2006)。從羊蹄甲植物中分離鑒定的有效化合成分主要是黃酮類(lèi)化合物。查爾酮苷和二氫黃酮苷是最早從羊蹄甲中分離得到的活性物質(zhì),隨后陸續(xù)分離得到含有亞甲二氧基的黃酮類(lèi)化合物,并明確了其合成化學(xué)途徑(湯迎湛等,2014)。我國(guó)的科學(xué)家從羊蹄甲中分離了至少10個(gè)黃酮化合物,并研究了這些化合物在抑制血小板聚集活性和抗糖尿病中的作用(尚小雅等,2006；湯迎湛等,2014)。

開(kāi)發(fā)植物源抑菌活性物質(zhì)是新農(nóng)藥創(chuàng)制的一個(gè)重要途徑。目前對(duì)羊蹄甲的研究主要集中于葉、花的微量元素和化學(xué)成分研究,對(duì)種子中的成分研究相對(duì)缺失。由于我國(guó)南方羊蹄甲資源豐富,為了對(duì)羊蹄甲進(jìn)行多方面開(kāi)發(fā),我們選取易得的紅花羊蹄甲種子為實(shí)驗(yàn)材料,從中提取粗提物,研究其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、番茄青枯菌、柑橘潰瘍病菌和煙草野火細(xì)菌的抑菌活性；進(jìn)一步利用超濾離心管分離粗提物中的蛋白,分析蛋白組分是否有抑菌活性,為何種蛋白,以期從蛋白合成途徑人工合成此類(lèi)抑菌活性蛋白,應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 羊蹄甲種子為網(wǎng)購(gòu)的紅花羊蹄甲種子。

1.1.2 菌株 大腸桿菌(Escherichia coli)、番茄青枯菌(Ralstonia solanacearum)、柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)和煙草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tobaci)來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)植物病原細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)教育部生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要儀器 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司),低溫離心機(jī)(Eppendorf公司),超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物質(zhì)的提取 取飽滿(mǎn)、無(wú)病變的紅花羊蹄甲種子,用九陽(yáng)豆?jié){機(jī)粉碎,準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g粉末,加入60 mL PBS緩沖液(pH 7.0)(唐根源等,2000),置于冰浴中用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎4 min(破碎7 s,間歇4 s)(王雪等,2011)。破碎后的樣品在4℃條件下12 000 rpm離心2 min,取上清液過(guò)一次性過(guò)濾滅菌器(0.2 μm),濾液(即粗提物)保存于－20℃,用于抑菌活性分析和蛋白分離。

1.2.2 粗提物的平板抑菌檢測(cè) 將新鮮活化的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、番茄青枯菌(Ralstonia solanacearum)、柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)和煙草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tobaci)分別接種到3 mL牛肉浸膏液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),再按1∶100接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的4 mL牛肉浸膏液體培養(yǎng)基,待培養(yǎng)液OD600約為2.0時(shí),將培養(yǎng)液的OD600調(diào)整到1.0。在融化的固體培養(yǎng)基冷卻至40－50℃時(shí),按每25 mL固體培養(yǎng)基加1 mL菌液(OD600＝1.0)的配比加入菌液,迅速搖勻倒入干凈的培養(yǎng)皿(徐玲等,2006),冷卻后即成含菌平板。在含菌平板上放置直徑為6 mm的滅菌濾紙,滴加－20℃保存的紅花羊蹄甲種子粗提物40 μL檢測(cè),正置培養(yǎng)24 h后,觀察并測(cè)量抑菌圈大小(潘俊等,2011)。以上操作均在超凈臺(tái)中完成。

1.2.3 粗提物中蛋白成分的分離 ?。?0℃保存的紅花羊蹄甲種子粗提物500 μL,加至超濾離心管(Prodipta,2012)(Microsep Advance Centrifugal Devices Incorporate 10K Omega Membrane),該離心管分為濃縮柱、收集管兩部分。在4℃條件下,12 000 rpm離心15 min,保留收集管中的廢液。加入等體積PBS緩沖液漂洗濃縮柱膜上的蛋白濃縮樣品,再次離心,保留收集管中的漂洗液,與廢液合并,用于蛋白組分分析。重復(fù)漂洗濃縮柱2－3次,最后用等體積PBS緩沖液懸浮濃縮柱的蛋白樣品,即得到分離的蛋白成分,保存于－20℃,用于SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)和抑菌活性分析。

1.2.4 粗提物、蛋白成分、漂洗廢液的SDS-PAGE電泳試驗(yàn) 為明確粗提物、蛋白分離液和漂洗廢液中蛋白組分的差異,以便結(jié)合后續(xù)蛋白分離液和漂洗廢液的平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果來(lái)分析紅花羊蹄甲種子活性提取物抑菌成分是否為蛋白成分,分別取20 μL粗提物、蛋白分離液和漂洗廢液,加入5×SDS上樣緩沖液,100℃煮沸5 min后,采用5%濃縮膠及15%分離膠進(jìn)行不連續(xù)垂直平板電泳。電泳時(shí)電壓先設(shè)定在80 V,待樣品進(jìn)入分離膠后再調(diào)至120 V。電泳完畢后,將凝膠剝離后放入染色液中振蕩染色3 h,然后用蒸餾水漂洗后加入脫色液,在搖床上振蕩脫色,直至蛋白質(zhì)條帶清晰為止(梁梓強(qiáng)等,2015)。

1.2.5 粗提物中蛋白成分的平板抑菌檢測(cè) 參照1.2.2方法分別制成本文6種含菌平板。在含菌平板上放置直徑為6 mm的滅菌濾紙,滴加－20℃保存的蛋白分離液40 μL檢測(cè),正置培養(yǎng)24 h后,觀察并測(cè)量抑菌圈大小(潘俊等,2011)。以上操作均在超凈臺(tái)中完成。

1.2.6 粗提物的漂洗廢液的平板抑菌檢測(cè) 參照1.2.2方法分別制成本文6種含菌平板。在含菌平板上放置直徑為6 mm的滅菌濾紙,滴加－20℃保存的漂洗廢液40 μL檢測(cè),正置培養(yǎng)24 h后,觀察并測(cè)量抑菌圈大小(潘俊等,2011)。以上操作均在超凈臺(tái)中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗提物的平板抑菌檢測(cè)

按2 g種子粉末加PBS緩沖液60 mL的比例,通過(guò)超聲波獲得的粗提物,對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、番茄青枯菌、柑橘潰瘍病菌和煙草野火病菌都有抑菌活性。結(jié)果顯示:粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最高,抑菌圈的大小可達(dá)到2.1 cm,對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、番茄青枯菌、柑橘潰瘍病菌和煙草野火病菌的抑菌活性稍低,抑菌圈大小分別是1.5、1.6、1.6、1.7 和 1.8 cm(圖 1)。

圖1 粗提物平板抑菌檢測(cè)Figure 1 The inhibitory effect of crude extract from B.blakeana seeds on six microbes

2.2 粗提物、蛋白成分、漂洗廢液的SDS-PAGE電泳試驗(yàn)

為了考察粗提物、蛋白分離液和漂洗廢液中的蛋白組分是否有區(qū)別,我們對(duì)粗提物、蛋白分離液和漂洗廢液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示:粗提物和蛋白分離液樣品中都約有25條主要的蛋白帶,其中在45 kDa和16 kDa位置的2個(gè)蛋白條帶的量最大。從電泳的蛋白條帶來(lái)看,蛋白分離液中的蛋白組分與粗提物相比,蛋白條帶數(shù)都保持一致,表明濃縮后的蛋白組分沒(méi)有發(fā)生明顯變化,且濃度更高。在漂洗廢液的泳道中,沒(méi)有觀察到蛋白條帶的出現(xiàn),漂洗廢液中不含有蛋白組分(圖2)。

2.3 粗提物中蛋白成分的平板抑菌檢測(cè)

將粗提物經(jīng)超濾離心管離心后,取40 μL蛋白分離液滴加到含菌平板,觀察對(duì)病原細(xì)菌的抑菌作用。結(jié)果顯示,所獲得的蛋白分離液,對(duì)6種測(cè)試細(xì)菌都沒(méi)有抑菌作用(圖3)。

2.4 提物的漂洗廢液的平板抑菌檢測(cè)

將粗提物經(jīng)超濾離心管離心后,取40 μL漂洗廢液滴加到含菌平板,觀察對(duì)病原細(xì)菌的抑菌作用。結(jié)果顯示,所獲得的漂洗廢液仍然保留著對(duì)細(xì)菌的抑菌活性,但抑菌圈較粗提物的抑菌圈小,推測(cè)應(yīng)該是分離出來(lái)的廢液和PBS漂洗液混合后,有效成分相對(duì)于粗提物來(lái)說(shuō),濃度更小(圖4)。

結(jié)合2.2 SDS-PAGE電泳試驗(yàn)結(jié)果,蛋白組分與粗提物一致且濃度更高,而漂洗廢液中沒(méi)有蛋白組分。綜上所述推測(cè),用PBS緩沖液提取的紅花羊蹄甲種子粗提物,經(jīng)超濾離心管離心過(guò)濾后,蛋白分離液中的蛋白組分對(duì)供試6種菌株沒(méi)有抑菌活性,抑菌活性物質(zhì)存在于漂洗廢液中,粗提物中對(duì)6種供試菌株起到抑菌作用的物質(zhì)應(yīng)該不是其中的蛋白組分,至于漂洗廢液中起到抑菌作用的成分有待繼續(xù)試驗(yàn)分析。

圖2 紅花羊蹄甲種子提取物的SDS-PAGE電泳分析Figure 2 SDS-PAGE analysis of extract from B.purpurea seeds

圖3 粗提物中蛋白成分的平板抑菌檢測(cè)Figure 3 The inhibitory effect of extract proteins from B.blakeana seeds on six microbes

圖4 粗提物的漂洗廢液的平板抑菌檢測(cè)Figure 4 The inhibitory effect of extract wash buffer from B.blakeana seeds on six microbes

3 討論

紅花羊蹄甲植物種子與葉片、莖枝一樣,含有抑菌活性物質(zhì)。羊蹄甲是豆科羊蹄甲屬植物,含有多個(gè)植物品種。前期研究從顯脈、紅絨和大葉羊蹄甲莖枝和葉片中分離到抑菌活性物質(zhì),利用甲醇、乙醇、己烷、丙酮和二氯甲烷等為溶劑,均可超聲萃取活性物質(zhì)(Boonphong et al.,2007；Negi et al.,2012)。Fang等人(2012)從羊蹄甲種子分離出一個(gè)20 kDa大小的胰蛋白酶抑制物,可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死,顯示在肝癌防治中的應(yīng)用前景。本文用PBS緩沖液作為萃取載體,從紅花羊蹄甲的種子中分離出對(duì)幾種微生物有抑菌活性的粗提物,表明羊蹄甲的種子組織中也含有抑菌的活性成分。

羊蹄甲種子植物的抑菌物質(zhì)可用于植物病原細(xì)菌的防控。前期的研究結(jié)果表明:羊蹄甲的樹(shù)皮、根、葉可作為藥用,具有補(bǔ)腎氣,提神,止血,鎮(zhèn)咳等功效,所獲得提取物對(duì)真菌也有生物學(xué)抑菌活性,但對(duì)植物病原菌的作用效果還不明確。我們以羊蹄甲種子為實(shí)驗(yàn)材料獲得超聲提取物,并檢測(cè)對(duì)6種微生物的抑制作用。在平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中,粗提物不僅對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用,而且對(duì)番茄青枯菌、柑橘潰瘍病菌和煙草野火病菌3種植物病原細(xì)菌也有顯著的抑菌活性。

報(bào)道羊蹄甲中的活性物質(zhì)以黃酮類(lèi)化合物為主的文獻(xiàn)已經(jīng)很多,也有文獻(xiàn)報(bào)道利用色譜分析出的有效成分達(dá)十幾種之多,研究比較成熟,本文不再贅述。本文研究發(fā)現(xiàn)種子粗提物對(duì)植物病原細(xì)菌有抑菌活性以后,利用蛋白濃縮柱對(duì)粗提物中的蛋白組分進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)蛋白組分對(duì)病原菌沒(méi)有抑菌活性,而經(jīng)超濾離心管過(guò)濾的漂洗廢液仍然保留了抑菌活性,說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)不是蛋白,故猜測(cè)對(duì)植物病原細(xì)菌有抑菌活性的主要有效成分可能還是黃酮類(lèi)化合物。后續(xù)研究可對(duì)漂洗廢液是否含有黃酮類(lèi)化合物以及是否起抑菌作用進(jìn)行分析,并明確其對(duì)病原菌的抑菌機(jī)理。

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Study on extraction and antimicrobial constituents from Bauhinia blakeana seeds

HU Xun,YUAN Su-Su,YE Xiu-Juan,ZOU Hua-Song?
(College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China)

For validating the antimicrobial activity of extraction from Bauhinia blakeana seeds,the paper chose ultrasonic to crush the seeds,and centrifuge tube to separate the proteins from extracts.The results of plate inhibitory experiments showed that the extracts had inhibitory effects on Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Bacillus subtilis,Ralstonia solanacearum,Xanthomonas citri subsp.citri and Pseudomonas syringae pv.tobaci.The results of SDSPAGE showed that antimicrobial substances in the extracts were not protein components.

Bauhinia blakeana； antimicrobial activity； extract； plant pathogenic bacteria

S432.1

A

1001－4276－(2017)01－0101－05

戶(hù) 勛，袁素素，葉秀娟，等，2017.紅花羊蹄甲種子活性物質(zhì)提取及其抑菌作用研究[J].武夷科學(xué)，33:101-105.

2017－07－08。

福建省科技廳引導(dǎo)項(xiàng)目(2016N0006)；福建農(nóng)林大學(xué)青年教師科研基金項(xiàng)目(2013xjj07)。

戶(hù)勛(1982－)，女，碩士研究生。研究方向:生物大分子。Email:215226648＠qq.com。?

鄒華松(1972－)，男，教授。研究方向:微生物－植物相互作用的分子遺傳學(xué)。Email:hszou＠fafu.edu.cn。

(責(zé)任編輯:陳曉雯)