郝禮森，宋小杰，王玉蘭，劉玉齡，宋潔，張明婷，靳麗敏，張朋壘

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，河北 唐山 063000）

野生型PTEN過表達(dá)對體外活化肝星狀細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影*

郝禮森，宋小杰，王玉蘭，劉玉齡，宋潔，張明婷，靳麗敏，張朋壘

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，河北 唐山 063000）

目的探討野生型第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因（PTEN）過表達(dá)對體外活化肝星狀細(xì)胞（HSC）內(nèi)鈣離子濃度的影響。方法體外培養(yǎng)活化大鼠肝星狀細(xì)胞系（HSC-T6），利用腺病毒載體，將野生型PTEN基因轉(zhuǎn)染活化HSC；Western blot及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測HSC的PTEN蛋白及mRNA表達(dá)；采用鈣離子熒光探針Rhod-2/AM，于激光掃描共聚焦顯微鏡下檢測HSC內(nèi)鈣離子濃度變化。實(shí)驗(yàn)分組：①Control組：腺病毒轉(zhuǎn)染時以DMEM代替病毒液；②Ad-GFP組：轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的對照空病毒Ad-GFP；③Ad-PTEN組：轉(zhuǎn)染攜帶野生型PTEN基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒Ad-PTEN。結(jié)果野生型PTEN在活化大鼠HSC大量表達(dá)，3組HSC內(nèi)鈣離子濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ad-PTEN組HSC內(nèi)鈣離子濃度（251.60±90.88）低于Control組（1 953.95±132.99）及Ad-GFP組（1 937.57±115.17），而Control組與Ad-GFP組之間HSC內(nèi)鈣離子濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論野生型PTEN過表達(dá)可降低體外活化大鼠HSC內(nèi)鈣離子濃度。

肝星狀細(xì)胞；第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因；細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

鈣離子（Ca2+）作為細(xì)胞內(nèi)第2信使，在細(xì)胞興奮、增殖、收縮等一系列細(xì)胞生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[1]。第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，它的異常表達(dá)與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來對PTEN的研究已從腫瘤領(lǐng)域逐漸延伸到非腫瘤領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)[2]，PTEN過表達(dá)可通過下調(diào)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度阻滯來血管緊張素Ⅱ引起的心肌細(xì)胞肥大。而在PTEN與肝纖維化的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)[3]，過表達(dá)的野生型PTEN可抑制體外活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的增殖。但PTEN過表達(dá)對HSC內(nèi)Ca2+濃度的影響仍不清楚。為此，本研究利用腺病毒載體，將野生型PTEN基因轉(zhuǎn)染體外活化HSC，構(gòu)建體外HSC的PTEN過表達(dá)模型，探討PTEN過表達(dá)對活化HSC內(nèi)Ca2+濃度的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的空病毒Ad-GFP、攜帶野生型PTEN基因并表達(dá)GFP的腺病毒Ad-PTEN均由第三軍醫(yī)大學(xué)祝善俊教授惠贈，通過反復(fù)感染293A細(xì)胞的方法擴(kuò)增腺病毒，并測定其滴度。胎牛血清購于以色列BI公司，DMEM培養(yǎng)基及HBSS購于美國Gibco公司，鈣離子熒光探針Rhod-2/AM購于美國Invitrogen公司，活化大鼠肝星狀細(xì)胞系（HSC-T6）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，小鼠抗PTEN單克隆抗體購于英國Abcam公司，兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購于美國Affinity公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG購于美國KRL公司。

1.2 腺病毒轉(zhuǎn)染活化HSC

腺病毒轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，用DMEM洗滌2次；按感染倍數(shù)100確定轉(zhuǎn)染所需病毒量（病毒量=細(xì)胞數(shù)×感染倍數(shù)），用少量DMEM稀釋病毒液（能覆蓋細(xì)胞表面即可）；輕輕傾斜并晃動培養(yǎng)皿，以保持病毒液均勻，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，每隔15 min晃動培養(yǎng)皿1次，以促進(jìn)感染；補(bǔ)充培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至所需時間，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，測得表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例（轉(zhuǎn)染效率）在80%以上。實(shí)驗(yàn)分組：①Control組，腺病毒轉(zhuǎn)染時以DMEM代替病毒液；②Ad-GFP組，轉(zhuǎn)染表達(dá)GFP的對照空病毒Ad-GFP；③Ad-PTEN組，轉(zhuǎn)染攜帶野生型PTEN基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒Ad-PTEN。

1.3 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測HSC中PTEN mRNA表達(dá)

按上述分組要求處理HSC后48 h，收集各組HSC，按照Trizol試劑盒說明書提供的方法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；目的基因PTEN及內(nèi)參照基因GAPDH引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。引物序列：PTEN正向引物5'-TCCTGCAGA AAGACTTGAAGGT-3'，反向引物5'-GCTGTGGTGGG TTATGGTCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為182 bp；GAPDH正向引物5'-GGCTCATGACCACAGTCCAT-3'，反向引物5'-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為202 bp。在Master cycler ep Real Plex4 qRT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。各反應(yīng)體系擴(kuò)增后，PCR儀顯示S形擴(kuò)增曲線平滑完整，上升迅速陡峭并很快到達(dá)平臺期，熔解曲線單峰，提示擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增。采用相對定量2-△△Ct法比較各組HSC的PTEN mRNA表達(dá)[4]。

1.4 Western blot檢測HSC中PTEN蛋白表達(dá)

按上述分組要求處理HSC后48 h，收集各組細(xì)胞并提取蛋白，BCA法測定蛋白含量。一抗小鼠抗PTEN多克隆抗體以1∶100稀釋、兔抗GAPDH單克隆抗體以1∶1 000稀釋，二抗HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG均以1∶5 000稀釋，采用Image JV1.47H軟件對圖像結(jié)果進(jìn)行定量分析，圖像灰度值以積分光密度（IOD）值表示，結(jié)果以目的蛋白與GAPDH的IOD比值表示。

1.5 Ca2+熒光探針Rhod-2/AM檢測HSC內(nèi)Ca2+濃度

將HSC以4×104個接種于激光掃描共聚焦顯微鏡專用皿中，生長24 h后，按照上述分組處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以HBSS溶液沖洗細(xì)胞3次；加入配制的濃度為5μmol/L的Rhod-2/AM工作液，充分覆蓋培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育30 min，除去Rhod-2/AM工作液，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下，用557 和581 nm波長的激發(fā)光激發(fā)Ca2+熒光探針Rhod-2/AM發(fā)射熒光，隨機(jī)選取6個視野進(jìn)行觀察，利用激光掃描共聚焦顯微鏡的圖像量化分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，得出HSC平均Ca2+熒光強(qiáng)度。由于細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度呈正比，因此本實(shí)驗(yàn)中用熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度[5]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野生型PTEN基因在活化HSC大量表達(dá)

腺病毒感染HSC 48 h，qRT-PCR檢測HSC的PTEN mRNA表達(dá)，Ad-GFP組、Ad-PTEN組HSC的PTEN mRNA表達(dá)量相對于Control組（Control組HSC的PTEN mRNA表達(dá)量確定為1）分別為1.03和1.90倍，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ad-PTEN組HSC的PTEN mRNA表達(dá)高于Control組及Ad-GFP組，而Control組與Ad-GFP組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。進(jìn)一步用Western blot檢測顯示，3組HSC的 PTEN蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ad-PTEN組HSC的PTEN蛋白表達(dá)較Control組及Ad-GFP組升高，Control組與Ad-GFP組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

2.2 過表達(dá)的野生型PTEN降低HSC內(nèi)Ca2+濃度

各組HSC內(nèi)Ca2+濃度檢測顯示，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ad-PTEN組較Control組及Ad-GFP組降低，而Control組與Ad-GFP組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

表1 3組活化HSC的PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 （n =6，±s）

表1 3組活化HSC的PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 （n =6，±s）

注：△△Ct=腺病毒轉(zhuǎn)染組△Ct（Ct PTEN-CtGAPDH）-Control組△Ct（Ct PTEN-Ct GAPDH）；?與Control組及Ad-GFP組比較，P ＜0.05

PTEN mRNA ΔCt（±s）ΔΔC t2-ΔΔCt Control組 7.04±0.04 0.00 1.00 0.56±0.05 Ad-GFP 組 6.99±0.04 -0.05 1.03 0.69±0.07 Ad-PTEN組 6.11±0.07 -0.93 1.90? 1.08±0.07?組別PTEN蛋白（±s）

圖1 腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的PTEN蛋白表達(dá)

表2 腺病毒感染HSC 48 h各組HSC內(nèi)Ca2+的平均熒光強(qiáng)度 （n =6，±s）

表2 腺病毒感染HSC 48 h各組HSC內(nèi)Ca2+的平均熒光強(qiáng)度 （n =6，±s）

注：?與Control組及Ad-GFP組比較，P ＜0.05

組別 Ca2+熒光強(qiáng)度Control組 1 953.95±132.99 Ad-GFP組 1 937.57±115.17 Ad-PTEN 組 251.60±90.88?

圖2 腺病毒感染HSC 48 h各組HSC內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度 （激光掃描共聚焦顯微鏡×100）

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病演變?yōu)楦斡不牟±磉^程，而HSC則是參與此過程的主要細(xì)胞。HSC的活化、增殖，以及在肝臟損傷部位黏附、遷移，并進(jìn)一步合成大量細(xì)胞外間質(zhì)是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[6-7]。Ca2+作為重要的細(xì)胞內(nèi)第2信使，在細(xì)胞興奮、增殖、收縮等一系列細(xì)胞生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[1]，而細(xì)胞收縮又與細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)。并且，已有研究顯示[8]大鼠HSC內(nèi)鈣離子增加可引起HSC收縮。因此HSC內(nèi)Ca2+濃度變化與HSC黏附遷移等生物學(xué)行為有關(guān)。

PTEN蛋白是一個具有脂質(zhì)磷酸酶活性及蛋白磷酸酶活性的雙重特異性磷酸酶。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PTEN不僅與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也參與了一些非腫瘤性疾病的病理過程。研究顯示[9]，膽總管結(jié)扎大鼠纖維化肝組織及在體外HSC的PTEN表達(dá)下降，但PTEN對活化HSC內(nèi)Ca2+濃度的影響仍不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)將腺病毒介導(dǎo)的野生型PTEN基因轉(zhuǎn)染體外活化HSC，在證實(shí)野生型PTEN基因成功轉(zhuǎn)染HSC并上調(diào)PTEN表達(dá)后，應(yīng)用Ca2+熒光探針Rhod-2/AM及激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察了HSC內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果表明，野生型PTEN過表達(dá)可降低活化HSC內(nèi)Ca2+濃度。這與上述研究結(jié)果相一致，提示PTEN過表達(dá)不僅可下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，也下調(diào)活化HSC內(nèi)Ca2+濃度，HSC內(nèi)Ca2+濃度的降低可能參與了PTEN過表達(dá)對活化HSC增殖的抑制。至于PTEN過表達(dá)是否能通過降低活化HSC內(nèi)Ca2+濃度，進(jìn)而抑制活化HSC黏附、遷移，尚待進(jìn)一步研究。

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（張蕾 編輯）

Effect of wild-type PTEN over-expression on intracellular calcium ion concentration in activated hepatic stellate cells in vitro*

Li-sen Hao, Xiao-jie Song, Yu-lan Wang, Yu-ling Liu, Jie Song, Ming-ting Zhang,Li-min Jin, Peng-lei Zhang
(Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of over-expression of wild-type phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten (PTEN) on the intracellular calcium ion concentration in activated hepatic stellate cells (HSCs)in vitro.MethodsUsing adenoviral vector, wild-typePTENgene was transduced into activated rat HSC (HSC-T6)in vitro, and the expressions ofPTENmRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot. Then with the help of laser scanning confocal microscope (LSCM), the changes of intracellular calcium ion concentration in HSCs were detected using calcium ion fluorescence probe Rhod-2/AM. The cells were grouped as follows： control group, in which the viral medium was replaced by DMEM when HSCs were transfected with adenovirus; Ad-GFP group, in which HSCs were transfected with adenovirus expressing green fluorescent protein (GFP) alone; and Ad-PTEN group, in which HSCs were transfected with adenovirus harboring both wildtypePTENandGFPgenes.ResultsThe wild-typePTENwas successfully transduced into activated HSCs by adenoviral vector. The intracellular calcium ion concentration of the HSCs in the Ad-PTEN group significantly decreased compared with the control group and the Ad-GFP group (P＜ 0.05). However, no significant difference was observed in the intracellular calcium ion concentration of HSCs between the control group and the Ad-GFP group(P＞ 0.05).ConclusionsThe over-expression of wild-typePTENcan significantly reduce the intracellular calcium ion concentration in activated hepatic stellate cellsin vitro.

hepatic stellate cell;PTEN; intracellular calcium ion concentration

R575

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.28.003

1005-8982（2017）28-0012-04

2016-11-26

河北省自然科學(xué)基金（No：H2013209327）；中國肝炎防治基金會天晴肝病研究基金資助項(xiàng)目（No：CFHPC20132078）