南蘋(píng)瑤，王小鶯

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江西南昌330045）

14種中藥乙醇提取物對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)

南蘋(píng)瑤，王小鶯*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江西南昌330045）

目的：丁香等14味中藥對(duì)大腸埃希菌ATCC25922的體外抑菌試驗(yàn)。方法：選用14種中藥（白芍、烏梅、苦參、蒲公英、丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃、連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷），分別采用乙醇回流法制備出生藥濃度為1g/L。前4種中藥提取出膏狀物全部用無(wú)水乙醇溶解，后10種中藥精密稱(chēng)取兩份分別用無(wú)水乙醇、70%乙醇溶解，通過(guò)瓊脂打洞法測(cè)定不同中藥對(duì)大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果：連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷的中藥提取物對(duì)大腸桿菌幾乎沒(méi)有抑菌作用，白芍、烏梅、苦參、蒲公英的中藥提取物用無(wú)水乙醇溶解在瓊脂打洞法中平均抑菌圈分別為17.7mm、26.0mm、16.7mm、12.0mm，丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃的中藥提取物用無(wú)水乙醇溶解對(duì)大腸桿菌的平均抑菌圈為17.0mm、10.5mm、21.5mm、15.5mm、17.5mm；用70%乙醇溶解所測(cè)平均抑菌圈分別為21.5mm、23.5mm、23.0mm、21.5mm、21.5mm。結(jié)論：9種中藥的乙醇提取物對(duì)大腸桿菌的體外抑菌強(qiáng)度大小為烏梅＞山楂＞白芍＞大黃＞丁香＞苦參＞黃柏＞蒲公英＞黃連；中藥膏狀物提取物用70%乙醇溶解可以獲得更大的抑菌圈，說(shuō)明溶解于水中的中藥提取物也含有抑菌成分不容忽視。

中藥；大腸桿菌；乙醇提??；瓊脂打洞法

在人和家畜的生活環(huán)境中存在著各種細(xì)菌，而長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物會(huì)導(dǎo)致藥物毒副作用、細(xì)菌耐藥性、藥物殘留所致的畜產(chǎn)品安全等問(wèn)題，且抗生素漸漸不能滿(mǎn)足畜產(chǎn)品無(wú)公害化生產(chǎn)的要求。而中草藥是我國(guó)特有的中醫(yī)藥理論和實(shí)踐的產(chǎn)物，價(jià)格低廉，藥源廣泛，具有廣泛的發(fā)展?jié)摿Γ饕峭ㄟ^(guò)調(diào)整機(jī)體功能狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗菌作用[1]。大部分中草藥具有毒副作用小、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性的特點(diǎn)[2]，中藥作為替代化學(xué)藥物解決藥殘和抗藥性的重要途徑，越來(lái)越受到重視。為了尋求抗菌作用強(qiáng)的藥物，我們對(duì)十四種中藥進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藥材：選用白芍、烏梅、苦參、蒲公英、丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃、連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷14種中藥，均購(gòu)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院。

菌種：大腸埃希菌ATCC25922購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心。

儀器與設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE5298A,上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；粉碎機(jī)(DFT-100，溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；雙人單面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2D,蘇州凈化設(shè)備有限公司）；生化培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS,上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，國(guó)華電器有限公司）；移液槍。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：取麥康凱瓊脂粉末12.5g，加入裝有250mL蒸餾水的錐形瓶中，加熱煮沸溶解并攪拌，121℃高溫滅菌20min后備用。未冷卻凝固時(shí)分別倒入12個(gè)滅菌干燥的培養(yǎng)皿中，等待瓊脂冷卻凝固。冷卻后4℃冷藏備用。

MH肉湯培養(yǎng)液：MH肉湯粉末7.5g，加入裝有250mL蒸餾水的錐形瓶中加熱煮沸溶解并攪拌，121℃高溫滅菌20min后備用。冷卻后4℃冷藏備用。

1.2.2 菌液的制備

取冷凍保存的塑料凍存管，立即放置在38～40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇并適當(dāng)搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰完全溶解為止，一般約50～100s，開(kāi)啟塑料凍存管，吸取菌液移植于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h。挑取該麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種至另一麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種復(fù)蘇。采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，勾取平板上菌落1～2個(gè)，置于MH肉湯中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。菌液4℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用前稀釋為106CFU·mL-1。

1.2.3 中藥提取物的制備

1.2.3.1 白芍、烏梅、苦參、蒲公英藥材各稱(chēng)取10g，粉粹成粉末，70%乙醇加熱回流提取，合并提取液。取濾渣后，50～60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀物[3]，用無(wú)水乙醇以生藥濃度為1g/L在超聲波下溶解配成藥液。過(guò)濾除菌，置冰箱4℃冷藏保存。

1.2.3.2 丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃、連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷藥材各稱(chēng)取10g，分別粉粹成粉末，70%乙醇加熱回流提取，合并濾液，精密量取2份分別用無(wú)水乙醇、70%乙醇溶解，生藥濃度為1g/L。過(guò)濾除菌，置冰箱4℃冷藏保存。

1.3 體外抑菌試驗(yàn)

根據(jù)李敏珍等人的研究[4]，選用瓊脂打洞法做體外抑菌，拿滅菌棉簽將菌液均勻涂抹在平板上，室溫干燥5min后，用無(wú)菌打孔器打孔，以無(wú)菌針頭挑出孔內(nèi)瓊脂。滴少量的未凝固的瓊脂于孔內(nèi)封底，防止藥液從孔底流走。以無(wú)水乙醇為溶劑對(duì)照，每個(gè)孔滴藥液100μL，重復(fù)2或3次，放置30min后，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h后觀(guān)察抑菌圈大小，求平均值。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

打孔法：抑菌圈直徑≥20mm為極敏，抑菌圈直徑在15～19mm為高敏，抑菌圈直徑在10～14為中敏，抑菌圈直徑＜10mm為低敏，無(wú)抑菌圈為耐藥[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)水乙醇溶解中藥提取物體外抑菌試驗(yàn)

白芍、烏梅、苦參、蒲公英乙醇提取物對(duì)大腸桿菌均有抑制作用，所測(cè)的平均抑菌圈大小分別為 17.7mm、26.0mm、16.7mm、12.0mm，其中烏梅的抑菌作用最強(qiáng)，為極度敏感，蒲公英的抑菌作用最差，為中度敏感。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 無(wú)水乙醇溶解中藥提取物體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

圖1

2.2 不同濃度乙醇溶解中藥提取物體外抑菌試驗(yàn)

連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷的中藥提取物對(duì)大腸桿菌幾乎沒(méi)有抑制作用，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，表現(xiàn)為耐藥。

由表2得知，對(duì)于丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃的中藥提取的膏狀物分別用無(wú)水乙醇和70%乙醇溶解，用70%乙醇溶解的所測(cè)的平均抑菌圈均更大。其中黃連相差最大，山楂差距最相近，均為極度敏感。說(shuō)明溶解于水中的中藥提取物也有抑菌成分，且那部分抑菌成分對(duì)于不同中藥，其抑菌效果又是不同的。結(jié)合前四種中藥，同樣的生藥濃度1g/L，相同的用量每個(gè)孔100μL，9種中藥對(duì)大腸桿菌的抑制強(qiáng)度大小為烏梅＞山楂＞白芍＞大黃＞丁香＞苦參＞黃柏＞蒲公英＞黃連，用70%乙醇溶解中藥提取物抑菌強(qiáng)度大小為山楂＞大黃＞丁香＞黃柏＞黃連。

表2 不同濃度乙醇溶解中藥提取物體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

圖2

3 討論

不同中藥對(duì)大腸桿菌的抑制作用不同，而將中藥有效抑菌成分更多地提取出來(lái)并發(fā)揮它的藥效至關(guān)重要。對(duì)于不同的中藥，提取有效成分、濃縮、溶解膏狀物的條件不同，抑菌效果可能有很大不同。黃連與山楂提取出的膏狀物精密稱(chēng)取兩份分別用無(wú)水乙醇和70%乙醇溶解，配成的藥液做瓊脂擴(kuò)散法測(cè)抑菌直徑，70%乙醇溶解下兩種藥物抑菌圈大小相近，但無(wú)水乙醇溶解下兩種藥物抑菌圈相差較大。

中藥不同于西藥，中草藥提取物可以消除大腸桿菌耐藥性及耐藥質(zhì)粒，從而達(dá)到抑殺目的。耐藥質(zhì)粒是造成大腸桿菌耐藥性的主要原因[6]。臨床上使用中藥進(jìn)行治療，可對(duì)抗菌藥物耐藥和敏感的大腸桿菌產(chǎn)生相同的治療效果，這對(duì)于臨床用藥具有積極的指導(dǎo)意義[7]。

圖1、2可以看出加乙醇的孔不規(guī)則，可能是無(wú)水乙醇出現(xiàn)滲透的原因?qū)е?，由于無(wú)菌操作臺(tái)不平導(dǎo)致平板倒置不均勻，同樣是加100μL溶液，部分孔溶液會(huì)滲出，或是無(wú)菌針頭挑瓊脂不均勻?qū)е?但從圖中可以明顯看出，溶解中藥膏狀物用70%乙醇更為合適。

[1]劉榮欣,魯改儒,郭吉勇.中藥及其組方對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,04∶2265-2267.

[2]周琰冰,趙鑫薈,艾啟俊.三種中草藥對(duì)大腸桿菌的抑制作用及機(jī)理初探[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,21∶294-300.

[3]錢(qián)晶晶.鳳尾草抑菌活性成分提取及其抑菌作用的初步研究[D].江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[4]李敏珍,曹治金,劉碧鳳，等.幾種常用中藥抑菌試驗(yàn)方法比較(摘要)[J].廣西中醫(yī)藥,1985,06∶33.

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S853.74

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1003-8655（2017）05-0006-03

江西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20161BBF60088）

南蘋(píng)瑤（1995-），女，山西省，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)及毒理學(xué)，E-mail:2280425155@qq.com.

王小鶯（1969-），女，江西省，碩士，副教授，E-mail:wangxiaoying6969@126.com.