史 杰 王 芳

川楝素對TRAIL抗肝癌活性及其機(jī)制研究

史 杰1王 芳2

目的 觀察川楝素對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）抗肝癌活性影響并研究其機(jī)制。方法 將HepG2人肝癌細(xì)胞分為對照組、川楝素組、TRAIL組、川楝素+TRAIL組及川楝素+TRAIL+DR5小干擾RNA（DR5 siRNA）組，CCK-8法檢測HepG2細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞的凋亡和線粒體膜電位，Western blot實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞表面DR5表達(dá)水平及Caspase-8、Caspase-3活化水平。結(jié)果 TRAIL+川楝素組HepG2相對細(xì)胞活力（0.42±0.04），顯著低于 TRAIL 單治療組（0.84±0.07，P＜0.05）和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 組（0.76±0.06，P＜0.05）。TRAIL+川楝素組HepG2細(xì)胞凋亡率（32.7±2.4）%，顯著高于TRAIL單治療組[（9.3±0.9）%，P＜0.05]和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組[（13.8±1.1）%，P＜0.05]。川楝素處理對HepG2細(xì)胞Bcl-2家族蛋白的表達(dá)無明顯影響，但能顯著提高HepG2細(xì)胞表面DR5表達(dá)水平。TRAIL+川楝素組 HepG2細(xì)胞的相對線粒體膜電位（0.26±0.02），顯著低于 TRAIL 單治療組（0.78±0.06，P＜0.05）和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 組（0.68±0.05，P＜0.05）。TRAIL+川楝素組 HepG2細(xì)胞 Caspase-8表達(dá)水平（0.37±0.04），顯著高于 TRAIL 單治療組（0.11±0.04，P＜0.05）及川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 組（0.14±0.02，P＜0.05）；TRAIL+川楝素組 HepG2 細(xì)胞 Caspase-3 表達(dá)水平（0.42±0.04），顯著高于TRAIL 單治療組（0.13±0.02，P＜0.05）及川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 組（0.17±0.02，P＜0.05）。結(jié)論川楝素可上調(diào)肝癌細(xì)胞死亡受體5（DR5）表達(dá)，提高TRAIL抗腫瘤活性。

肝細(xì)胞肝癌；川楝素；DR5；TRAIL

肝癌是預(yù)后很差的惡性腫瘤，致死率非常高[1]。盡管手術(shù)治療是目前治療肝癌最為有效的手段，然而對于中晚期不能進(jìn)行手術(shù)的患者，化療或免疫治療是不可替代的治療手段[2]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）屬于腫瘤壞死因子超家族成員。研究[3]表明，TRAIL能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而對正常細(xì)胞的功能無明顯影響，因此TRAIL是一種非常有臨床應(yīng)用前景的腫瘤治療藥物。然而某些類型的腫瘤細(xì)胞，如肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞對TRAIL治療的敏感性較低[4]，因此輔以其它藥物提高肝癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性是提高其療效的有效方法。本研究的目的在于探討川楝素對TRAIL抗肝癌活性的影響并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料 川楝素購于南京春秋生物工程有限公司。人重組TRAIL、細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、和凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco。死亡受體5（DR5）、活化半胱天冬酶-8（cleaved caspase-8）、活化半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）和β肌動蛋白（β-actin）抗體購于美國Cell Signaling。DR5-PE流式細(xì)胞抗體購于美國Ramp;D system。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購于美國Pierce。DR5小干擾RNA（DR5 siRNA）購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。脂質(zhì)體 2000（Lipofectamine2000）購于美國 Invitrogen。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HepG2購于中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。細(xì)胞每2～3天傳代1次，傳代時，用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細(xì)胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.3 DR5基因沉默 為了抑制HepG2細(xì)胞中DR5的表達(dá)，在HepG2細(xì)胞中用Lipofectamine2000對DR5 siRNA按試劑操作說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡要步驟如下：將DR5 siRNA或?qū)φ誷iRNA（終濃度為50pmol/mL）用Lipofectamine2000進(jìn)行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的HepG2細(xì)胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6h，之后棄去無血清培養(yǎng)基加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DR5 siRNA轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞由于存在DR5干擾RNA，因此其DR5的表達(dá)受到明顯抑制。

1.4 相對細(xì)胞活力測定 將HepG2細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板中。實(shí)驗(yàn)分為對照組、川楝素組、TRAIL組、川楝素+TRAIL組及川楝素+TRAIL+DR5siRNA組。對照組、川楝素組、TRAIL組和川楝素+TRAIL組所用細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對照siRNA的HepG2細(xì)胞，川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組所用細(xì)胞為轉(zhuǎn)染DR5 siRNA的HepG2細(xì)胞。對照組為細(xì)胞不加藥物處理48h；川楝素組為細(xì)胞加入50μmol/mL川楝素處理48h；TRAIL組為細(xì)胞加入2ng/mL TRAIL培養(yǎng)48h；川楝素+TRAIL組為細(xì)胞用2ng/mL TRAIL聯(lián)合50μmol/mL川楝素處理48h；川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組為DR5 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用2ng/mL TRAIL聯(lián)合50μmol/mL川楝素處理48h。藥物處理完畢后加入20μL CCK-8試劑并在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，450nm波長下測定OD值。HepG2相對細(xì)胞活力用OD藥物處理組/OD對照組表示。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 將 HepG2細(xì)胞按 1×106/孔接種在6孔板中，按上述進(jìn)行分組。藥物處理完畢后用蛋白提取液提取HepG2細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)用12.5%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用 Bcl-2、Bcl-xl、Bax、DR5、活化 Caspase-8、活化Caspase-3和β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平用它們的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.6 HepG2細(xì)胞表面DR5表達(dá)水平 將HepG2細(xì)胞按1×106/孔接種在6孔板中，分為對照組和川楝素組處理。收集細(xì)胞并將細(xì)胞用帶PE熒光標(biāo)記的DR5抗體進(jìn)行孵育，孵育完畢后用流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞表面DR5的表達(dá)情況。

1.7 線粒體膜電位測定 將HepG2細(xì)胞按1×106/孔接種在6孔板中，按1.4所述進(jìn)行分組。處理完畢后按試劑操作說明書步驟將細(xì)胞用JC-1染料進(jìn)行孵育，孵育完畢后用流式細(xì)胞儀檢測JC-1發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，線粒體膜電位越高[5]。藥物處理組的相對線粒體膜電位為各處理組的JC-1熒光強(qiáng)度與對照組熒光強(qiáng)度的比值。

1.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞按1×106/孔接種在6孔板中，按上述進(jìn)行分組。藥物處理完畢后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin-V陽性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 各組HepG2細(xì)胞活力和凋亡率比較 CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRAIL+川楝素組HepG2的相對細(xì)胞活力顯著低于TRAIL單處理組和川楝素單處理組（見表1）。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRAIL+川楝素組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著高于TRAIL單處理組和川楝素單處理組，表明川楝素顯著增強(qiáng)TRAIL對HepG2細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，見表1。

表1 各組HepG2細(xì)胞活力和凋亡率比較（±s）

表1 各組HepG2細(xì)胞活力和凋亡率比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 TRAIL 組比較，#P＜0.05，與川楝素組比較，amp;P＜0.05；與 TRAIL+川楝素組比較，□P＜0.05；TRAIL：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，DR5 siRNA：死亡受體5小干擾RNA

組別對照組TRAIL組川楝素組TRAIL+川楝素組TRAIL+川楝素+DR5 siRNA組孔數(shù)3 3 3 3 3相對細(xì)胞活力1.0±0.08 0.84±0.07*0.92±0.07 0.42±0.04#amp;0.76±0.06□細(xì)胞凋亡率（%）2.2±0.2 9.3±0.9*3.9±0.3 32.7±2.4#amp;13.8±1.1□

2.2 各組HepG2細(xì)胞表面DR5表達(dá)水平比較

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，川楝素處理對HepG2細(xì)胞Bcl-2家族蛋白的表達(dá)無明顯影響但能顯著提高HepG2細(xì)胞DR5表達(dá)水平（見圖1，表2）。為了確定川楝素能否上調(diào)HepG2細(xì)胞表面DR5受體的表達(dá)，使用PE熒光標(biāo)記的DR5抗體進(jìn)行流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示川楝素處理能提高HepG2細(xì)胞表面DR5受體的數(shù)量（見圖2）。另外，當(dāng)轉(zhuǎn)染DR5 siRNA后，TRAIL聯(lián)合川楝素對HepG2細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性均顯著下降（見表1），表明川楝素通過上調(diào)DR5表達(dá)提高HepG2細(xì)胞對TRAIL的敏感性。

圖1 各組HepG2細(xì)胞DR5表達(dá)水平

圖2 各組HepG2細(xì)胞表面DR5數(shù)量。DR5：死亡受體5

表2 各組HepG2細(xì)胞DR5表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組HepG2細(xì)胞DR5表達(dá)水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TRAIL+川楝素組比較，□P＜0.05；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白；Bcl-xl：B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2樣蛋白 1（BCL2-like1）；Bax：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白；DR5：死亡受體5蛋白；β-actin：肌動蛋白；TRAIL：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；DR5 siRNA：死亡受體5小干擾RNA。

組別對照組TRAIL組川楝素組TRAIL+川楝素組TRAIL+川楝素+DR5 siRNA組孔數(shù)3 3 3 3 3 Bcl-2相對表達(dá)水平0.76±0.06 0.79±0.07 0.72±0.05 0.77±0.06 0.73±0.05 Bcl-xl相對表達(dá)水平0.55±0.05 0.52±0.05 0.53±0.04 0.56±0.05 0.58±0.06 Bax相對表達(dá)水平0.37±0.04 0.40±0.05 0.34±0.04 0.38±0.05 0.35±0.04 DR5相對表達(dá)水平0.28±0.03 0.32±0.04 0.68±0.07*0.70±0.07*0.25±0.03□

2.3 川楝素促進(jìn)HepG2細(xì)胞TRAIL誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡 流式細(xì)胞結(jié)果顯示，TRAIL+川楝素組HepG2細(xì)胞的相對線粒體膜電位顯著低于TRAIL單處理組和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組（見表3）。Western blot結(jié)果顯示，TRAIL+川楝素組 HepG2細(xì)胞Cleaved Caspase-8表達(dá)水平及Cleaved Caspase-3表達(dá)水平均顯著高于TRAIL單處理組和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組（見圖3，表3）。

表3 各組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位、Caspase-8、Caspase-3活化水平比較（±s）

表3 各組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位、Caspase-8、Caspase-3活化水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 TRAIL 組比較，#P＜0.05；與川楝素組比較，amp;P＜0.05；與 TRAIL+川楝素組比較，□P＜0.05；Cleaved Caspase-8：活化半胱天冬酶-8；Cleaved Caspase-3：活化半胱天冬酶-3；β-actin：肌動蛋白；TRAIL：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；DR5 siRNA為死亡受體5小干擾RNA

組別對照組TRAIL組川楝素組TRAIL+川楝素組TRAIL+川楝素+DR5 siRNA組孔數(shù)3 3 3 3 3線粒體膜電位1.00±0.07 0.78±0.06*0.97±0.07 0.26±0.02#amp;0.68±0.05□caspase-8 0.01±0.01 0.11±0.04*0.02±0.01 0.37±0.04#amp;0.14±0.02□caspase-3 0.01±0.01 0.13±0.02*0.04±0.01 0.42±0.04#amp;0.17±0.02□

圖3 各組HepG2細(xì)胞Caspase-8和Caspase-3活化

3 討論

川楝子是一味傳統(tǒng)中藥，它具有明顯的鎮(zhèn)痛作用且還可用于治療寄生蟲病，對諸如蛔蟲等有良好的殺滅作用。川楝素是川楝子中的主要活性成分，具有很強(qiáng)的藥理學(xué)活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，川楝素還具有一定的抗腫瘤作用。在肺癌的治療中，川楝素能抑制肺癌細(xì)胞對藥物誘導(dǎo)的凋亡的抵抗性[6]；在結(jié)直腸癌的治療中，川楝素能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[7]；在白血病的治療中，川楝素能通過激活脫氧胞苷激酶促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，川楝素能顯著增強(qiáng)TRAIL對肝癌細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，表明川楝素與TRAIL存在協(xié)同效應(yīng)，能提高TRAIL的抗肝癌活性。

在TRAIL信號通路中，TRAIL首先與死亡受體4（DR4）或死亡受體 5（DR5）結(jié)合形成死亡受體復(fù)合物，該復(fù)合物能募集細(xì)胞中的Caspase-8并使之發(fā)生活化。活化的Caspase-8能剪切Bid蛋白使之成為活化形式?；罨腂id能轉(zhuǎn)位到線粒體外膜上，使腫瘤細(xì)胞的線粒體發(fā)生失能并打開線粒體外膜孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位下降并使線粒體中的凋亡活性物質(zhì)（如細(xì)胞色素C）通過線粒體外膜孔道釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[9-11]。Bcl-2家族蛋白成員是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要分子[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)川楝素處理并不能顯著影響肝癌細(xì)胞Bcl-2 家族蛋白成員（Bcl-2、Bcl-xl、Bax）的表達(dá)；研究發(fā)現(xiàn)，川楝素能顯著上調(diào)TRAIL的特異性受體DR5表達(dá)水平，同時增加肝癌細(xì)胞表面DR5的數(shù)量。當(dāng)用小干擾RNA下調(diào)肝癌細(xì)胞表面DR5的表達(dá)后，川楝素對TRAIL的協(xié)同效應(yīng)受到明顯抑制，證明川楝素可能通過增加肝癌細(xì)胞表面的DR5受體數(shù)量增強(qiáng)TRAIL依賴的凋亡信號，促使肝癌細(xì)胞發(fā)生Caspase-8活化，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。

總之，本研究顯示川楝素能顯著提高肝癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性，增強(qiáng)TRAIL的抗腫瘤活性。

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Effect of Toosendanin on TRAIL Inhibiting Hepatocellular Carcinoma and the Related Mechanism

SHI Jie1,WANG Fang2.
1Clinical Laboratory,Cixi People's Hospital,Ningbo(315300),China；2Clinical Laboratory,Zhejiang Hospital,Hangzhou(310007),China

Objective To investigate the effect of toosendanin on enhancing the anti-tumor effect of TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL） on hepatocellular carcinoma and the underlying mechanism.Methods HepG2 cells were divided into control group,toosendanin group,TRAIL group,toosendanin+TRAIL group and toosendanin+TRAIL+DR5 small interfering RNA（DR5 siRNA）group.CCK-8 assays were performed to evaluate the viability of HepG2 cells.Flow cytometry analysis was performed to detect the cell apoptosis and mitochondrial membrane potential in HepG2.Western blot and flow cytometry analysis was performed to evaluate the expression of DR5 on HepG2 cell surface and the activation of caspase-8 and caspase-3.Results Relative cell viability of HepG2 in TRAIL+toosendanin group（0.42±0.04） was significantly lower than that in TRAIL group（0.84±0.07,P＜0.05） and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（0.76±0.06,P＜0.05）.Apoptotic rate of HepG2 cells in TRAIL+toosendanin group（32.7±2.4）%was significantly higher than that in TRAIL group[（9.3±0.9）%,P＜0.05]and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group[（13.8±1.1）%,P＜0.05].Treatment with toosendanin did not change the expression of Bcl-2 family proteins but significantly increased the expression of DR5 on the surface of HepG2.Relative mitochondrial membrane potential of HepG2 in TRAIL+toosendanin group（0.26±0.02） was significantly lower than that of TRAIL group（0.78±0.06,P＜0.05） and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（0.68±0.05,P＜0.05）.Relative expression of cleaved caspase-8（0.37±0.04） and cleaved caspase-3（0.42±0.04） in TRAIL+toosendanin group were both higher than the cleaved caspase-8（0.11±0.04） and cleaved caspase-3（0.13±0.02） in TRAIL group and the cleaved cas－pase-8（0.15±0.02） and cleaved caspase-3 （0.17±0.02） in TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（all P＜0.05）.Conclusion Toosendanin enhances the anti-tumor effect of TRAIL by upregulating the expression of DR5 in hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma;toosendanin;DR5;TRAIL

1浙江省慈溪市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（寧波 315300）；2浙江醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310007）

史杰，E-mail：cixishijie@163.com；Tel：15867236288

（收稿：2017-03-08 修回：2017-05-31）