田蕾 陳亞萍 劉俊 馬曉剛 王娜 楊兵 李瑩 郭海東 李娟 胡慧 張銀霞李培富

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 銀川 750021； *通訊聯(lián)系人，E-mail：peifuli@163. com)

粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)與篩選

田蕾 陳亞萍 劉俊 馬曉剛 王娜 楊兵 李瑩 郭海東 李娟 胡慧 張銀霞李培富*

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 銀川 750021；*通訊聯(lián)系人，E-mail：peifuli@163. com)

【目的】土壤鹽漬化是危害水稻生產(chǎn)的重要非生物脅迫之一。鑒定水稻種質(zhì)資源發(fā)芽期耐鹽性，篩選耐鹽指標(biāo)，培育耐鹽品種，對(duì)水稻生產(chǎn)的發(fā)展具有重要意義?！痉椒ā坷?25 mmol/L NaCl溶液對(duì)64份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行鹽脅迫，于脅迫后3 d測(cè)定發(fā)芽數(shù)；脅迫5 d、10 d后，測(cè)定發(fā)芽數(shù)、芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)，并計(jì)算相對(duì)芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、鹽害率，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)各種質(zhì)資源的芽期耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，分析典型耐鹽和鹽敏感種質(zhì)鹽脅迫條件下的發(fā)芽特征?！窘Y(jié)果】相對(duì)鹽害率與相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均極顯著負(fù)相關(guān)；除相對(duì)芽長(zhǎng)外各指標(biāo)間的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平。通過(guò)聚類(lèi)分析將64份粳稻種質(zhì)資源劃分成4個(gè)類(lèi)群。第Ⅰ、Ⅳ類(lèi)群分別為典型的鹽敏感和耐鹽類(lèi)群，第Ⅱ類(lèi)群為弱耐鹽種質(zhì)為主的混合類(lèi)群，第Ⅲ類(lèi)群主要由耐鹽種質(zhì)組成。通過(guò)主成分分析將7個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為3個(gè)主成分，應(yīng)用隸屬函數(shù)和權(quán)重，獲得了客觀(guān)評(píng)價(jià)粳稻種質(zhì)資源耐鹽性的綜合評(píng)價(jià)值 D。分別選取D值最高和最低的5份種質(zhì)資源進(jìn)行芽期耐鹽指標(biāo)的差異顯著性分析，結(jié)果表明，兩組種質(zhì)資源鹽脅迫5 d的各評(píng)價(jià)指標(biāo)差異均達(dá)到極顯著水平，10 d的評(píng)價(jià)指標(biāo)除相對(duì)芽長(zhǎng)外，均達(dá)到了顯著差異水平?！窘Y(jié)論】水稻芽期對(duì)鹽脅迫較為敏感，且耐鹽性不同的種質(zhì)間差異顯著。利用逐步回歸和主成分分析獲得發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)根長(zhǎng)和相對(duì)鹽害率3個(gè)指標(biāo)，可作為快速鑒定粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性的重要指標(biāo)，若采用多元統(tǒng)計(jì)方法評(píng)價(jià)可靠性更高。

水稻；種質(zhì)資源；芽期耐鹽性；主成分分析；綜合評(píng)價(jià)

鹽堿土在世界范圍內(nèi)分布廣泛，遍及6大洲的100多個(gè)國(guó)家，總面積已達(dá)10億hm2[1-3]。近年來(lái)隨著氣候變暖、化肥的大量施用以及不合理灌溉等農(nóng)業(yè)措施的影響，世界約20 %的農(nóng)業(yè)用地鹽堿化程度表現(xiàn)出不斷加劇的趨勢(shì)[4-5]。中國(guó)鹽堿土面積龐大，種類(lèi)豐富，總面積約為9913.3萬(wàn) hm2[6]。土壤鹽漬化已成為全球性的資源與生態(tài)問(wèn)題，對(duì)作物的生長(zhǎng)、發(fā)育造成嚴(yán)重影響，制約了我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。

水稻(Oryza sativa L.)為一年生禾本科植物，是全世界一半以上人口的主要食物來(lái)源[7]，是一種鹽敏感作物[8]，其芽期耐鹽性是鹽漬土條件下水稻穩(wěn)產(chǎn)的重要影響因素[9]。我國(guó)東北、西北和華北的內(nèi)陸干旱和半干旱地區(qū)以及長(zhǎng)江以北的濱海鹽堿稻作區(qū)，水稻秧田和直播田在種子萌發(fā)階段易受到鹽堿的危害，導(dǎo)致發(fā)芽勢(shì)降低、發(fā)芽不齊、芽尖枯黃和彎曲，甚至死亡，嚴(yán)重影響了水稻生產(chǎn)。為確保鹽堿地內(nèi)水稻的安全生產(chǎn)，創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)、對(duì)其發(fā)芽期耐鹽性的研究顯得尤為重要。

鹽脅迫對(duì)水稻發(fā)芽期的影響主要表現(xiàn)在對(duì)發(fā)芽速度、整齊度及生長(zhǎng)狀態(tài)的抑制[10]。郭望模等[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的NaCl、品種特性以及NaCl濃度和品種間的互作對(duì)發(fā)芽都有極顯著的影響。賈寶艷等[12]研究發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度的上升，水稻種子發(fā)芽率降低，發(fā)芽時(shí)間明顯推遲，且材料間差異很大。Wang等在對(duì)1個(gè)水稻重組自交系群體的芽期耐鹽性評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)，水稻種子萌發(fā)初期(0～5d)可能對(duì)鹽脅迫更加敏感[13]，各家系的耐鹽相關(guān)指標(biāo)差異較后期更大。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫會(huì)明顯降低水稻種子的發(fā)芽率，使芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)與空白對(duì)照相比顯著縮短。Hasthanasombut等[15]的研究結(jié)果也類(lèi)似。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在水稻發(fā)芽期耐鹽性鑒定方面開(kāi)展了大量工作[9-16]，提出了發(fā)芽指數(shù)法，篩選出一些耐鹽性強(qiáng)的優(yōu)異種質(zhì)，并應(yīng)用于育種實(shí)踐。但前人的研究多是對(duì)幾個(gè)水稻芽期耐鹽指標(biāo)的簡(jiǎn)單分析，在利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)價(jià)水稻芽期耐鹽性方面，多采用聚類(lèi)[12]、隸屬函數(shù)[16]等方法進(jìn)行簡(jiǎn)單分析，利用多元統(tǒng)計(jì)方法綜合評(píng)價(jià)水稻芽期耐鹽性的報(bào)道較少。本研究以國(guó)內(nèi)外具有廣泛代表性的64份粳稻種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，采用發(fā)芽指數(shù)法，應(yīng)用主成分、隸屬函數(shù)和逐步回歸等方法進(jìn)行各種質(zhì)資源芽期耐鹽性的綜合評(píng)價(jià)，以期篩選芽期耐鹽水稻種質(zhì)，初步闡明水稻發(fā)芽期的耐鹽機(jī)制，為水稻耐鹽育種提供優(yōu)異資源和理論支持。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

64份粳稻種質(zhì)資源由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室李培富教授提供，其中，源自亞洲38個(gè)、歐洲19個(gè)、大洋洲4 個(gè)、美洲2 個(gè)、非洲1 個(gè)(表1)。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于 2015年在寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將各種質(zhì)資源種子置于42℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)處理 2 d，以充分打破種子休眠。每份種子分別選取成熟度好、整齊、飽滿(mǎn)的種子 50粒，均勻地置于底部鋪有 2層無(wú)菌濾紙的黑色育苗盤(pán)(28 cm×56 cm)中，每份種質(zhì)1穴，每盤(pán)32穴，每穴直徑6 cm。用5 %次氯酸鈉溶液浸泡30 min對(duì)種子進(jìn)行消毒，蒸餾水沖洗3～5次。設(shè)置對(duì)照組(蒸餾水)和鹽脅迫組(NaCl溶液)兩個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)。黑色育苗盤(pán)用塑料盤(pán)墊底，每盤(pán)加入800 mL 處理液后用塑料保鮮膜密封，放入智能人工氣候箱(HP1500GS型，武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司)中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃下光照12 h，26℃下暗培養(yǎng)12 h。每天進(jìn)行溶液更換以保證脅迫濃度的穩(wěn)定，脅迫處理10d。

為了選擇最佳的鹽脅迫濃度，根據(jù)各種質(zhì)資源在寧夏石嘴山市平羅縣西大灘鹽堿地改良示范基地鹽堿直播田中的出苗率，選擇了3份出苗率較高的種質(zhì) OB22(漾濞光殼陸稻)、OB23(Bertone)和OB28(Galhardo)，出苗率分別為 88.9%、83.3%和81.9%，作為芽期耐鹽種質(zhì)；3份出苗率較低的種質(zhì)OB1(合江 21)、OB12(Rizzotto)和 OB18(荒木)，出苗率分別為 19.4%、25.0%和 29.2%，作為芽期鹽敏感種質(zhì)。設(shè)置NaCl濃度梯度為0、50、100、125、150、175、200 mmol/L 進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選最佳NaCl濃度用于64份種質(zhì)資源芽期耐鹽性評(píng)價(jià)。

表1 64份粳稻種質(zhì)資源名稱(chēng)、來(lái)源、綜合評(píng)價(jià)值及排名Table 1. Origin and names of 64 japonica rice germplasm and their D values,comprehensive ranking.

1.3測(cè)定指標(biāo)

以種子胚根達(dá)到 1 mm 長(zhǎng)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)[17]，在NaCl脅迫3、5、10 d時(shí)調(diào)查各處理的發(fā)芽數(shù)，脅迫5、10 d時(shí)調(diào)查各處理的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)。以相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)鹽害率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)作為發(fā)芽期耐鹽性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)各種質(zhì)資源的芽期耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中發(fā)芽指數(shù)用鹽脅迫3、5、10 d的發(fā)芽數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

發(fā)芽勢(shì)(%)=(培養(yǎng) 5 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子粒數(shù))×100

相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(%) =(NaCl處理種子發(fā)芽勢(shì)/空白對(duì)照種子發(fā)芽勢(shì))×100；

發(fā)芽率(%)=(培養(yǎng)10 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子粒數(shù))×100；

相對(duì)發(fā)芽率(%)=(NaCl處理種子發(fā)芽率/空白對(duì)照種子發(fā)芽率)×100；

相對(duì)芽長(zhǎng)(%)=(NaCl處理種子芽長(zhǎng)/空白對(duì)照種子芽長(zhǎng)) ×100；

相對(duì)根長(zhǎng)(%)=(NaCl處理種子根長(zhǎng)/空白對(duì)照種子根長(zhǎng)) ×100；

相對(duì)鹽害率(%)=[(對(duì)照發(fā)芽率－處理發(fā)芽率)/對(duì)照發(fā)芽率]× 100；

發(fā)芽指數(shù) GI=∑(Gt/Dt)，(Gt指第 t天種子發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)發(fā)芽天數(shù))；[17,18]

活力指數(shù)VI=GI×S，(S指種苗生長(zhǎng)量，為脅迫10 d的根長(zhǎng))[19]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2013整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用SPSS 19.0和SAS 9.2軟件對(duì)7個(gè)水稻芽期耐鹽相關(guān)性狀指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、相關(guān)性、差異顯著性、聚類(lèi)、主成分和逐步線(xiàn)性回歸分析，利用隸屬函數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法進(jìn)行耐鹽性的綜合評(píng)價(jià)，相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式及方法參照文獻(xiàn)[20-21]。

1.4.1 粳稻種質(zhì)資源各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：

式中Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)，Xmin、Xmax為所有參試材料某一指標(biāo)的最小值和最大值。1.4.2 各綜合指標(biāo)的權(quán)重

式中，Wj表示第j 個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度即權(quán)重；Pj代表經(jīng)主成分分析所得到各粳稻種質(zhì)資源第j 個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

1.4.3 粳稻種質(zhì)資源綜合耐鹽能力

式中，D值表示各粳稻種質(zhì)資源在鹽脅迫下由綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)所得到的發(fā)芽期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性評(píng)價(jià)鹽脅迫最適濃度篩選

對(duì)3個(gè)芽期耐鹽和3個(gè)芽期鹽敏感種質(zhì)資源進(jìn)行不同濃度NaCl溶液脅迫后發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的提高，各種質(zhì)資源的7個(gè)芽期耐鹽相關(guān)指標(biāo)均顯著降低。除100 mmol/L NaCl溶液脅迫10 d 的相對(duì)根長(zhǎng)和活力指數(shù)外，兩類(lèi)種質(zhì)資源各芽期耐鹽相關(guān)指標(biāo)在較低的NaCl濃度(0、50、100 mmol/L)和較高的濃度(175、200 mmol/L)下，差異均未達(dá)到極顯著水平；而125 mmol/L NaCl濃度下，二者之間各芽期耐鹽相關(guān)指標(biāo)差異均達(dá)到極顯著水平(表2)，故選擇該濃度對(duì)64份粳稻種質(zhì)資源的芽期耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.2粳稻種質(zhì)資源鹽脅迫條件下芽期各評(píng)價(jià)指標(biāo)表現(xiàn)

t檢驗(yàn)結(jié)果表明，各種質(zhì)資源的7個(gè)芽期耐鹽相關(guān)性狀在鹽處理?xiàng)l件下與空白對(duì)照相比，均表現(xiàn)出極顯著的差異(表3)。t值均為正值，表明與空白條件下相比，鹽脅迫嚴(yán)重影響了水稻種子的萌發(fā)，各指標(biāo)的表型值均明顯下降。除鹽脅迫10 d的相對(duì)根長(zhǎng)外，各指標(biāo)均表現(xiàn)出較大的分布范圍，表明這些指標(biāo)在各種質(zhì)資源間存在著較大的變異。其中，鹽脅迫5 d相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)鹽害率的分布范圍最廣，分別為0.8%～100.0%和0.0%～99.2%。

2.3粳稻種質(zhì)資源鹽脅迫條件下芽期各評(píng)價(jià)指標(biāo)與苗期耐鹽級(jí)別的相關(guān)分析

與正常培養(yǎng)條件相比，鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)的形態(tài)學(xué)特征有不同程度的變化，通過(guò)形態(tài)生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析可揭示指標(biāo)間是否存在依存關(guān)系及相關(guān)關(guān)系的方向與強(qiáng)度[22]。本研究前期已完成64份粳稻種質(zhì)資源苗期耐鹽性評(píng)價(jià)[23,24]，利用苗期耐鹽級(jí)別(STS)與芽期各評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。由表4可以看出，相對(duì)鹽害率與相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)，其中相對(duì)鹽害率與發(fā)芽指數(shù)的相關(guān)系數(shù)最大，為－0.860；相對(duì)芽長(zhǎng)與其他指標(biāo)間的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。苗期耐鹽級(jí)別與相對(duì)芽長(zhǎng)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均呈顯著正相關(guān)，與活力指數(shù)呈極顯著正相關(guān)。

根據(jù)芽期各指標(biāo)間相關(guān)分析，我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)間存在極顯著相關(guān)性，會(huì)使其提供的信息發(fā)生重疊，各指標(biāo)變化幅度參差不齊，且發(fā)揮作用的大小也不相同。水稻耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的綜合性狀，直接利用單項(xiàng)指標(biāo)不能準(zhǔn)確、直觀(guān)地進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，可利用主成分分析對(duì)供試粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性進(jìn)行深入的綜合評(píng)價(jià)。

2.4粳稻種質(zhì)資源鹽脅迫條件下芽期耐鹽性的綜合評(píng)價(jià)

2.4.1 主成分分析

對(duì)7個(gè)水稻芽期耐鹽單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析(表 5)，CI1、CI2兩個(gè)主成分的特征值分別為 4.37和1.20，均大于1，其貢獻(xiàn)率分別為62.5%和17.1%，表明第一主成分能夠提供原變量綜合信息的一半以上。第一、二、三主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為91.6%，已對(duì)大多數(shù)指標(biāo)作了充分的概括，因此，提取了 3個(gè)主成分，將原有的7個(gè)芽期評(píng)價(jià)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為3個(gè)新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，來(lái)代表原始指標(biāo)攜帶的絕大部分信息。

表2 典型耐鹽和鹽敏感粳稻種質(zhì)資源在不同濃度NaCl脅迫條件下芽期各評(píng)價(jià)指標(biāo)表現(xiàn)Table 2. Phenotypic values of typical salt-tolerant and sensitive rice germplasm accessions under different NaCl concentrations at seed germination stage.

表3 粳稻種質(zhì)資源鹽脅迫條件下芽期各評(píng)價(jià)指標(biāo)均值及分布范圍Table 3. Performance of salt tolerance-related traits of 64 rice germplasm accessions at seed germination stage

由表6可知，在第一主成分中，相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(X3)、相對(duì)發(fā)芽率(X4)、發(fā)芽指數(shù)(X5)和相對(duì)鹽害率(X7)的載荷絕對(duì)值較高，均在0.4以上，是第一主成分中的主要作用因子；第二主成分中，相對(duì)芽長(zhǎng)(X1)、相對(duì)根長(zhǎng)(X2)的載荷絕對(duì)值較高，分別為 0.707和0.490；相對(duì)芽長(zhǎng)(X1)、相對(duì)根長(zhǎng)(X2)和活力指數(shù)(X6)為第三主成分的主要作用因子。綜合3個(gè)主成分所攜帶的信息，可用相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及相對(duì)鹽害率4個(gè)指標(biāo)來(lái)概括7個(gè)指標(biāo)中的大部分信息。

2.4.2 隸屬函數(shù)及粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

利用綜合指標(biāo)值(CI1-CI3)和公式(1)分別計(jì)算64個(gè)粳稻種質(zhì)資源的隸屬函數(shù)值u(Xj)。對(duì)于同一綜合指標(biāo)如CI1而言，鹽脅迫處理下，OB34(Daniela)的u(X1)最大，其值為1，表明此種質(zhì)在主成分一表現(xiàn)為耐鹽性最強(qiáng)，而 OB15(寧粳 16)的u(X1)最小，其值為 0，表明該種質(zhì)在這一綜合指標(biāo)上表現(xiàn)為耐鹽性最差。依據(jù)芽期各綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率的大小利用公式(2)求出芽期3個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重，分別為0.682、0.187和0.131。利用公式(3)以隸屬函數(shù)u(X1)、u(X2)和u(X3) 結(jié)合權(quán)重處理并累加得到綜合評(píng)價(jià) D值(表1)，并依此進(jìn)行芽期耐鹽性的排名。

表4 鹽脅迫處理下水稻芽期各單項(xiàng)指標(biāo)與苗期耐鹽級(jí)別的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 4. Correlation matrix of each single index of rice seed germination and salt tolerance score under salt stress.

表5 各綜合指標(biāo)的特征值及貢獻(xiàn)率Table 5. Eigen values and proportion of comprehensive indexes [Clx].

表6 各因子載荷矩陣Table 6. Loading matrix of each component.

綜合評(píng)價(jià)值 D的大小客觀(guān)反應(yīng)了各粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽能力的大小，數(shù)值越大說(shuō)明耐鹽能力越強(qiáng)。分別選取綜合排名前5名和最后5名作為高D值種質(zhì)資源和低D值種質(zhì)資源，即OB34(Daniela)、OB37(Gostima)、 OB45(Hrborio Cyauco)、 OB35(Arborio)和OB41(Rossi)，其D值均在0.820以上，排名第一的Daniela芽期綜合耐鹽能力最強(qiáng)；低D值種質(zhì)資源為OB30(遼豐8號(hào))、OB64(ARC7042)、OB48(嘉農(nóng) 485)、OB1(合江 21)和 OB15(寧粳 16)，D值均在0.370以下，耐鹽性相對(duì)較弱。其中，寧粳16號(hào)芽期綜合耐鹽能力最弱。

2.5粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性形態(tài)指標(biāo)聚類(lèi)分析

以D值為依據(jù)將64份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行類(lèi)群劃分：D值范圍在0.211～0.510之間有10份種質(zhì)，為鹽敏感種質(zhì)；D值范圍在0.511～0.650之間有23份種質(zhì)，為弱耐鹽種質(zhì)；D 值范圍在 0.651～0.750之間有 21份種質(zhì)，為耐鹽種質(zhì)；D值范圍在0.751～0.961之間有10份種質(zhì)，為高度耐鹽種質(zhì)。為驗(yàn)證用D值評(píng)價(jià)水稻芽期耐鹽性的效果，用除相對(duì)芽長(zhǎng)以外的6個(gè)形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)，參照戴海芳等[20]的方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)在歐氏距離1.08處可劃分為兩大類(lèi)群，分別為第Ⅰ類(lèi)群和由Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組成的混合類(lèi)群；在歐氏距離0.87時(shí)可將混合類(lèi)群細(xì)劃為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3個(gè)類(lèi)群(圖1)。

圖1 基于6個(gè)芽期耐鹽指標(biāo)的64份粳稻種質(zhì)資源聚類(lèi)分析結(jié)果Fig. 1. Cluster analysis of 64 rice germplasm based on the six salt response indexes.

第Ⅰ類(lèi)群為鹽敏感類(lèi)群，包括 OB1、OB30、OB19、OB31、OB64、OB48和 OB15，這 7 份種質(zhì)資源的D值均小于0.50，皆為鹽敏感種質(zhì)，原產(chǎn)地均在亞洲，在鹽脅迫條件下，該類(lèi)群種質(zhì)受到抑制最為明顯。

第Ⅱ類(lèi)群為弱耐鹽種質(zhì)為主的混合類(lèi)群，包括8份弱耐鹽種質(zhì)和3份鹽敏感種質(zhì)，除OB27、OB18和OB5以外，均為弱耐鹽種質(zhì)，其D值分布范圍為0.484～0.548。第Ⅲ類(lèi)群為中度耐鹽類(lèi)群，由34 份種質(zhì)組成，包括2個(gè)高度耐鹽種質(zhì)，17個(gè)耐鹽種質(zhì)和15個(gè)弱耐鹽種質(zhì)，D值分布范圍在0.570～0.795之間，是耐鹽種質(zhì)相對(duì)集中的1個(gè)類(lèi)群。第Ⅳ類(lèi)群為高度耐鹽類(lèi)群，包括8個(gè)高度耐鹽種質(zhì)和4個(gè)耐鹽種質(zhì)，D值分布范圍為0.702～0.961，具有較強(qiáng)的耐鹽性。除鹽敏感類(lèi)群均來(lái)自亞洲外，未發(fā)現(xiàn)芽期耐鹽性與種質(zhì)來(lái)源、地理分布有明顯的相關(guān)性。

2.6低D值種質(zhì)資源與高D值種質(zhì)資源各指標(biāo)的差異顯著性分析

由于發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)都可表示為一定條件下第n天的發(fā)芽種子數(shù)占供試種子數(shù)的百分率，因此在對(duì)高(低)D值種質(zhì)資源各指標(biāo)差異顯著性分析時(shí)統(tǒng)一記為相對(duì)發(fā)芽率。對(duì)5份高D值種質(zhì)資源、5份低D值種質(zhì)資源的7個(gè)芽期耐鹽相關(guān)指標(biāo)分別進(jìn)行方差分析，F(xiàn)值的分布范圍為3.35～674.90；除鹽脅迫10 d的相對(duì)芽長(zhǎng)P值為0.078之外，其他各指標(biāo)P值均小于0.001。利用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明，鹽脅迫5 d后，低D值種質(zhì)資源和高D值種質(zhì)資源的各指標(biāo)均表現(xiàn)出極顯著差異(圖2)，尤其是相對(duì)鹽害率二者差異最為明顯。鹽處理10 d后，相對(duì)芽長(zhǎng)的差異未達(dá)到顯著水平，其他各指標(biāo)均表現(xiàn)為極顯著差異。表明兩類(lèi)種質(zhì)在鹽脅迫5 d時(shí)已有顯著差異，主要表現(xiàn)在發(fā)芽速度的快慢，芽和根系伸長(zhǎng)的程度等方面，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽率和芽長(zhǎng)的差異逐漸減小，主要表現(xiàn)為根系伸長(zhǎng)的差異(圖2-A～B)。

圖2 125 mmol/L NaCl 脅迫下典型耐(敏)鹽粳稻種質(zhì)資源芽期形態(tài)指標(biāo)表現(xiàn)Fig. 2. Morphology indexes of typical salt tolerant andsensitive japonica rice germplasm at germination stage under salt stress.

2.7水稻芽期和苗期高度耐鹽種質(zhì)資源篩選

芽期耐鹽性綜合排名7、8的漾濞光殼陸稻和湟羅表現(xiàn)出很強(qiáng)的芽期耐鹽性(圖3-A、表1)，其鹽脅迫10 d 的相對(duì)根長(zhǎng)分別為7.8%和8.1%，發(fā)芽指數(shù)分別為14.6和14.5，相對(duì)鹽害率分別為1.0%和2.0%；它們的苗期耐鹽性也很出色，耐鹽級(jí)別分別為6.3和6.6。此外，綜合排名14的Bertone也是一個(gè)苗期高度耐鹽種質(zhì)，耐鹽級(jí)別7.5[24]，125 mmol/L NaCl脅迫6 d，僅第1、2葉萎蔫，有3～4片完整的綠葉(圖3-B)，可作為水稻耐鹽育種的優(yōu)良供體親本。

2.8回歸模型的建立及芽期耐鹽主要評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選

利用已獲得芽期耐鹽綜合評(píng)價(jià)D值和7個(gè)芽期耐鹽相關(guān)指標(biāo)，建立可用于水稻芽期耐鹽性評(píng)價(jià)的數(shù)學(xué)模型，把D值作為因變量，把各單項(xiàng)指標(biāo)作為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，建立最優(yōu)回歸方程：D=－0.083+0.025X5+0.033X2+0.002X4+0.001X1。方程相關(guān)系數(shù)R=0.993，決定系數(shù)R2=0.985，F(xiàn)值為978.606。由方程可知，7個(gè)指標(biāo)中有4個(gè)指標(biāo)對(duì)水稻芽期耐鹽性有顯著影響，分別是X5(發(fā)芽指數(shù))、X2(相對(duì)根長(zhǎng))、X4(相對(duì)發(fā)芽率)和X1(相對(duì)芽長(zhǎng))，它們與D值均呈極顯著相關(guān)，P值除相對(duì)芽長(zhǎng)為0.007外均小于0.001。結(jié)合這4個(gè)指標(biāo)的偏回歸系數(shù)，發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)根長(zhǎng)可作為水稻芽期耐鹽性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。

3 討論

3.1鹽脅迫對(duì)不同耐鹽性水稻種子萌發(fā)的影響

植物種子在萌發(fā)期受到鹽脅迫時(shí)，發(fā)芽時(shí)間會(huì)延遲，發(fā)芽率降低，生育進(jìn)程受到抑制[11,25]。肖文斐等[10]在對(duì)31個(gè)秈稻品種的芽期耐鹽性評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)，各品種在9 g/L NaCl溶液處理下發(fā)芽起始時(shí)間明顯延遲，發(fā)芽變緩，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著降低。本研究在對(duì)64份粳稻種質(zhì)資源的芽期鹽脅迫中發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，各種質(zhì)的發(fā)芽起始時(shí)間普遍延遲了0.5～1.5 d，發(fā)芽時(shí)間均比空白對(duì)照的3～4 d延長(zhǎng)了1 d以上，該現(xiàn)象在鹽敏感種質(zhì)中更為明顯。如OB48(嘉農(nóng)485)在鹽脅迫10 d時(shí)相對(duì)發(fā)芽率僅為58.9 %，其種子萌發(fā)受到了很大程度的抑制。崔江慧等在對(duì)10份高粱材料的鹽處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，側(cè)根鹽害率的變化最大，表明側(cè)根的發(fā)生和伸長(zhǎng)對(duì)鹽脅迫最敏感[26]，水稻中也有類(lèi)似的報(bào)道[13]。本研究中，各種質(zhì)資源10 d的相對(duì)根長(zhǎng)分布范圍為0.6 %～13.4 %(表3)，根的伸長(zhǎng)受到了很?chē)?yán)重的影響，典型耐鹽種質(zhì)的相對(duì)根長(zhǎng)極顯著大于鹽敏感種質(zhì)(圖2-B)；而10 d的相對(duì)芽長(zhǎng)分布范圍為7.3 %～40.7 %，表明水稻種子萌發(fā)時(shí)根的伸長(zhǎng)對(duì)鹽脅迫最為敏感，芽次之，這與前人的研究結(jié)果一致。

圖3 125 mmol/L NaCl脅迫條件下典型耐鹽和鹽敏感水稻種質(zhì)資源的表現(xiàn)型Fig. 3. Phenotypes of two salt tolerant rice germplasm accessions and two salt sensitive rice germplasm accessions under 125 mmol/L NaCl for five and six days,respectively in germination and seedling stages.

3.2水稻芽期耐鹽性評(píng)價(jià)關(guān)鍵指標(biāo)的選擇

作物種子萌發(fā)期進(jìn)行耐鹽評(píng)價(jià)時(shí)，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等是常用的耐鹽評(píng)價(jià)指標(biāo)[27]。眾多學(xué)者利用上述指標(biāo)及其相對(duì)值對(duì)水稻[9-16]、高粱[26,28]、偃麥草[27]、小麥[29]和苜蓿[18]等作物的芽期耐鹽性開(kāi)展了大量研究，但對(duì)芽期耐鹽評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)未達(dá)成統(tǒng)一的結(jié)論。賈寶艷等[12]認(rèn)為，發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率和相對(duì)受害率是衡量水稻芽期耐鹽能力的主要指標(biāo)。馮鐘慧等[16]認(rèn)為相對(duì)芽長(zhǎng)和相對(duì)根長(zhǎng)有望成為水稻早期耐鹽性快速鑒定的主要指標(biāo)。本研究通過(guò)對(duì)綜合評(píng)價(jià)D值與7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)的逐步線(xiàn)性回歸分析，獲得了1個(gè)最優(yōu)回歸方程，結(jié)合方程中4個(gè)自變量指標(biāo)的偏回歸系數(shù)，篩選到了發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)根長(zhǎng)兩個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。同時(shí)，結(jié)合主成分分析中第一主成分的貢獻(xiàn)率及其各載荷因子的系數(shù)，以及典型耐（敏）鹽種質(zhì)各指標(biāo)的差異顯著性分析，認(rèn)為相對(duì)鹽害率也是一個(gè)很重要的水稻芽期耐鹽相關(guān)指標(biāo)。利用上述3個(gè)指標(biāo)結(jié)合相近的NaCl濃度，不同學(xué)者進(jìn)行了粳稻[11,12,16]、秈稻[9-11,13]、爪哇稻[11]的芽期耐鹽性評(píng)價(jià)，均取得了較好地鑒定結(jié)果，表明本研究所建立的粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性評(píng)價(jià)方法和重要指標(biāo)也可用于秈稻等其他類(lèi)型水稻的芽期耐鹽性評(píng)價(jià)。

3.3水稻芽期耐鹽性的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

作物耐鹽性是受諸多因素影響的復(fù)雜性狀，是外界環(huán)境與其自身基因型互作的結(jié)果，簡(jiǎn)單地使用某些單項(xiàng)指標(biāo)很難全面的反映其耐鹽本質(zhì)[20]。本研究選用7個(gè)水稻芽期耐鹽指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，并在此基礎(chǔ)上利用多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽能力進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。利用主成分分析，將7個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個(gè)彼此獨(dú)立的新指標(biāo)；結(jié)合隸屬函數(shù)及權(quán)重獲得了可以客觀(guān)反映各種質(zhì)耐鹽性的綜合評(píng)價(jià)D值，利用該指標(biāo)將64份粳稻種質(zhì)資源劃分為高度耐鹽、耐鹽、弱耐鹽和鹽敏感4種類(lèi)型。利用逐步回歸構(gòu)建了1個(gè)較為可靠的水稻芽期耐鹽性評(píng)價(jià)模型，利用該模型，可在相同的脅迫條件下預(yù)測(cè)目標(biāo)種質(zhì)耐鹽性的強(qiáng)弱，為水稻耐鹽育種及資源的鑒定提供一定的依據(jù)。

3.4水稻種質(zhì)資源芽期與苗期耐鹽的相關(guān)性分析及耐鹽種質(zhì)在育種中的應(yīng)用策略

吳家富等[30]的研究表明，水稻耐鹽性有明顯的階段發(fā)育特異性，不同發(fā)育階段的耐鹽性之間無(wú)明顯相關(guān)性。本研究通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，苗期耐鹽級(jí)別與包括D值在內(nèi)的多個(gè)芽期耐鹽相關(guān)指標(biāo)表現(xiàn)為極顯著或顯著正相關(guān)(表4)，與D值的相關(guān)系數(shù)為0.334，呈極顯著正相關(guān)，與前人的研究結(jié)果存在一定的差異，這可能與選用的種質(zhì)資源材料特性不同有關(guān)。

水稻直播對(duì)實(shí)現(xiàn)稻米生產(chǎn)的專(zhuān)業(yè)化、輕型化、規(guī)?；兄匾饬x。近年來(lái)我國(guó)水稻直播面積不斷擴(kuò)大[31]，因此較強(qiáng)的芽期耐鹽性是鹽漬地區(qū)水稻直播品種必須優(yōu)先具備的特性。這就要求我們?cè)谟N實(shí)踐中要綜合考慮種質(zhì)資源的特性并合理利用?！霸O(shè)計(jì)育種”最早由Peleman等提出，是通過(guò)有目的地聚合有利基因，培育和創(chuàng)造優(yōu)良品種或資源的育種方法。根據(jù)Li等[32]提出的分子設(shè)計(jì)育種策略，可選擇生產(chǎn)中大面積推廣的品種(如富源4號(hào))作為輪回親本，以耐鹽水稻種質(zhì)資源(如本研究篩選到的3個(gè)芽期和苗期都耐鹽的種質(zhì))為供體，培育高代回交群體，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇和客觀(guān)準(zhǔn)確的耐鹽篩選和鑒定，獲得可直接用于生產(chǎn)的優(yōu)良耐鹽滲入系。同時(shí)通過(guò)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等手段可進(jìn)行目標(biāo)基因的克隆及功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)，進(jìn)一步改良水稻品種的耐鹽性。寧粳16和合江21是芽期和苗期高度鹽敏感的種質(zhì)(圖3)，可用于水稻芽期、苗期鹽敏感基因的分離和克隆。

4 結(jié)論

在人工氣候箱中利用125 mmol/L NaCl溶液對(duì)64 份粳稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)。利用逐步回歸和主成分分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，從測(cè)定的7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)中篩選出發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)鹽害率3個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，建立了回歸方程，可用于水稻種質(zhì)資源芽期耐鹽性的快速鑒定與預(yù)測(cè)。利用綜合評(píng)價(jià)D值獲得了5份芽期高度耐鹽種質(zhì)，為水稻種質(zhì)資源篩選與鑒定，耐鹽品種的選育、推廣提供了材料和依據(jù)。

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Comprehensive Evaluation and Selection of Rice (Oryza sativa japonica) Germplasm for Saline Tolerance at Germination Stage

TIAN Lei,CHEN Yaping,LIU Jun,MA Xiaogang,WANG Na,YANG Bing,LI Ying,GUO Haidong,LI Juan,HU Hui,ZHANG Yinxia,LI Peifu*
(College of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China; *Corresponding author,E-mail: peifuli@163. com)

【Objective】Soil salinity is one of the major abiotic stresses affecting rice growth and production. Salt resistance identification at germination stage,indices screening,and cultivar breeding of rice germplasm resources are important for rice production.【Method】Seeds of sixty-four japonica rice germplasm accessions germinated in the 125 mmol L-1NaCl solution. On the third day after salt stress,germination number of the seeds was measured. After salt stress for five and ten days,germination number,shoot length and root length were measured and then the relative shoot length,relative root length,relative germination potential,relative germination rate,relative salt damage rate,germination index and vigor index were calculated. Multiple statistical methods were used to comprehensively evaluate the salt tolerance of 64 rice japonica germplasm and the germination characteristics of typical salt-tolerant and salt-sensitive rice germplasm under salt stress were analyzed. 【Result】The relative salt damage rate was significantly negatively correlated with relative root length,relative germination potential,relative germination rate,germination index and vigor index.Except for relative shoot length,these six indexes were significantly correlated with each other. Through cluster analysis,64 japonica rice germplasm were divided into four groups. The group Ⅰ and Ⅳwere typical salt-sensitive and salt-tolerant germplasm,respectively. The group Ⅱ was mainly composed of low salt-resistant rice and the group Ⅲ was moderately salt-tolerant. With the principal component analysis these seven single indexes could be converted to three principal components. An objective comprehensive evaluation value (D value) of salt tolerance was obtained using membership function with index weight method. The five highest and lowest D value germplasm resources were selected to carry on significance analysis. The results showed that except for relative shoot length,all of these seven indexes measured after stress for five and ten days were significantly different from the two types. 【Conclusion】Rice was sensitive to salt stress at germination stage and there were significant differences between different germplasm. Using stepwise regression and principal component analysis,germination index,relative root length and relative salt damage rate were selected as the key indexes for the rapid identification of salt tolerance of rice germplasm. If multivariate statistical method was used,the reliability will be improved.

rice; germplasm resource; salt tolerance at germination stage; principal component analysis; comprehensive evaluation

10.16819/j.1001-7216.2017.6168

2016-12-20；修改稿收到日期：2017-04-29。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401361)；寧夏農(nóng)業(yè)育種專(zhuān)項(xiàng)(2013NYYZ0302)。

Q945.78; S511.2+2

A

1001-7216(2017)06-0631-12