亓 旗，崔雅萍，梁文儀，李 師，梁林金，葉 婷，吳玲芳，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

多指標(biāo)正交試驗(yàn)法優(yōu)選余甘子總酚提取工藝＊

亓 旗，崔雅萍，梁文儀，李 師，梁林金，葉 婷，吳玲芳，張?zhí)m珍＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

目的：優(yōu)選余甘子總酚提取工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。方法：以總酚、訶黎勒酸、沒食子酸和粘酸-2-O-沒食子酸酯提取量為綜合評價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選提取溶劑、溶劑用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間等并進(jìn)行驗(yàn)證，確定最佳提取工藝。結(jié)果：余甘子總酚提取工藝為10倍量70%乙醇提取3次，每次90 min。結(jié)論：本文優(yōu)化獲得的余甘子總酚提取工藝穩(wěn)定可靠，簡便易行，為余甘子產(chǎn)業(yè)化研究提供依據(jù)。

余甘子 總酚 訶黎勒酸 沒食子酸 粘酸-2-O-沒食子酸酯 提取工藝

余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子（Phyllanthus emblica.L）的干燥成熟果實(shí)，又名滇橄欖、油甘子、庵摩勒、喉甘子等[1]。主產(chǎn)于印度、中國、緬甸、馬來西亞、巴基斯坦等地，我國廣東、云南、江西、廣西、福建、貴州、海南等省區(qū)都有野生余甘子林分布。余甘子主要含有鞣質(zhì)、酚酸、粘酸、苯丙素、黃酮和三萜等化學(xué)成分[2-4]。藥理作用顯示余甘子具有抗氧化、抗病原微生物、抗腫瘤、保肝、抗炎等多種功效[5]。臨床上常用于治療血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干等癥[6]。

余甘子多酚是其抗氧化的主要成分[7]，目前報(bào)道的余甘子多酚提取工藝都以多酚含量為指標(biāo)[8,9]。本研究以總酚中3個(gè)主要成分訶黎勒酸（可水解鞣質(zhì)）、沒食子酸（酚酸）、粘酸-2-O-沒食子酸酯（粘酸）為指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選余甘子總酚提取工藝，并建立HPLC法測定余甘子總酚提取物中3個(gè)成分含量，為余甘子總酚提取工藝和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計(jì)：UV 2000（尤尼科公司）；Waters 2468型高效液相色譜儀；PAD檢測器；Breeze軟件；25μL可調(diào)進(jìn)樣器；十萬分之一電子分析天平：Sartorious BT 25S型（北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）：KQ-500DE（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

余甘子藥材購自西藏，產(chǎn)地尼泊爾，由北京中醫(yī)藥大學(xué)閻玉凝教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthusemblica L.的干燥果實(shí)。訶黎勒酸、沒食子酸、粘酸-2-O-沒食子酸酯對照品均為自制，經(jīng)UV、MS、1HNMR、13CNMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC檢測，峰面積歸一化法測定純度大于98.5%，符合定量要求。

甲醇（Sigma-aldrich公司，色譜純）；屈臣氏純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC含量測定方法

2.1.1 對照品溶液制備

分別精密稱取訶黎勒酸、沒食子酸、粘酸-2-O-沒食子酸酯對照品1.82 mg、4.51 mg、2.42 mg，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為訶黎勒酸、沒食子酸、粘酸-2-O-沒食子酸酯對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

精密稱取余甘子總酚提取物約5 mg于錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱重，100 MHz超聲30 min，冷卻后，補(bǔ)足原重量，濾過。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(5 μm 250×4.6 mm)，流動(dòng)相：甲醇(A)-0.2%冰醋酸/水(B)，梯度洗脫：0-15 min，12%-30%A，15-21 min，30%-70%A，21-28 min，70%A。檢測波長：275 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。色譜圖見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取訶黎勒酸、沒食子酸、粘酸-2-O-沒食子酸酯對照品溶液 0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分別置10 mL容量瓶中，50%甲醇定容，制成不同濃度對照品溶液。進(jìn)樣20μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別計(jì)算回歸方程，訶黎勒酸：Y=2E+06X-489.43，r=0.9996；沒食子酸：Y=2E+06X+51.095，r=0.9996；粘酸-2-O-沒食子酸酯：Y=569045X-88530，r=0.9996。分別在 0.0728-0.364 μg，0.1804-0.902μg和0.3872-1.1616μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄訶黎勒酸、沒食子酸、粘酸-2-O-沒食子酸酯的峰面積，計(jì)算RSD分別為1.41%、0.77%和1.67%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取余甘子總酚提取物約5 mg，精密稱重，加50%甲醇25 mL，稱重，100 MHz超聲30 min，冷卻后，補(bǔ)足原重量，濾過，平行操作6份。分別測定訶黎勒酸、沒食子酸和粘酸-2-O-沒食子酸酯含量，RSD分別為1.15%,2.99%，2.91%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖1 余甘子總酚提取物HPLC色譜圖

余甘子總酚提取物于制備后0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h分別進(jìn)樣，記錄訶黎勒酸、沒食子酸和粘酸-2-O-沒食子酸酯的峰面積，計(jì)算RSD分別為2.31%、2.67%、2.33%，樣品溶液中3個(gè)成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率

取已知含量的余甘子總酚提取物約2.5 mg，精密稱定，平行6份，分別加入對照品溶液（訶黎勒酸0.160 mg/mL、沒食子酸0.210 mg/mL、粘酸-2-O-沒食子酸酯0.170 mg/mL）1.0 mL，50%甲醇10 mL，超聲提取30 min，冷卻后，補(bǔ)足原重量，濾過，取20μL進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算平均回收率分別,訶黎勒酸99.92%，RSD為2.45%，沒食子酸100.16%，RSD為2.35%，粘酸-2-O-沒食子酸酯99.85%，RSD為2.21%。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 分光光度測定法

2.2.1 測定方法

精密吸取沒食子酸對照品溶液和樣品溶液各0.5 ml，置25 mL容量瓶中，依次加入50%EtOH溶液5 mL、0.3%十二烷基磺酸鈉溶液1 mL，混合顯色劑（按體積比0.6%鐵氰化鉀溶液：0.9%三氯化鐵溶液=10：9配制）1 mL，搖勻暗處靜置5 min。加入0.1 mol/L的鹽酸稀釋至刻度，搖勻，暗處放置20 min，450-900 nm范圍內(nèi)掃描測定吸光度。選擇744 nm為吸收波長。

2.2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取沒食子酸對照品溶液(濃度為0.051 mg/mL)0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，置25 mL容量瓶中，依次“2.2.1”顯色測定，以沒食子酸對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到回歸方程y=0.5338X+0.0047，r=0.9992，沒食子酸在0.204～2.040 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度考察

精密吸取供試品溶液0.50 mL置25 mL容量瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，連續(xù)測定6次，RSD為1.02%，該方法精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取余甘子總酚提取物5份，每份約5 mg，置25 mL容量瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，RSD為1.54%,該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 樣品穩(wěn)定性考察

供試品溶液配制后，分別于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h精密吸取0.5 ml，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，RSD 2.23%,結(jié)果表明，樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 提取物加樣回收率

取余甘子提取物樣品（總酚含量為31.30%）6份，每份約2.5 mg，置25 mL容量瓶中，分別精密加入濃度為1.55 mg/mL的沒食子酸對照品溶液0.5 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算酚類成分的含量，平均回收率為101.57%，RSD為2.65%。

2.3 總酚提取工藝

2.3.1 藥材粒度考察

稱取余甘子藥材6份，每份約5 g,，分別為a：未經(jīng)處理原藥材，b：5目藥材粉末，c：10目藥材粉末，以10倍量70%乙醇回流提取兩次，每次1.5 h，合并濾液并濃縮，真空干燥，平行操作兩份。按照“2.2.1”項(xiàng)下測定提取物總酚量，結(jié)果顯示5-20目藥材總酚提取率達(dá)90%以上，考慮工業(yè)生產(chǎn)粒度選取5-10目。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

精密稱取余甘子藥材18份，每份約5 g，按L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)制備相應(yīng)提取物，按照“2.2.1”項(xiàng)下測定總酚含量,“2.1.2”項(xiàng)下測定總酚、訶黎勒酸、沒食子酸和粘酸-2-O-沒食子酸酯的含量，并計(jì)算得率。因素水平見表1。正交設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果、方差分析結(jié)果見表2和表3。

由表2、3可知，以余甘子中總酚、訶黎勒酸、沒食子酸、粘酸-2-O-沒食子酸酯的提取量為指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，再結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際、經(jīng)濟(jì)及操作簡便考慮，確定余甘子總酚提取物最佳提取工藝為A3B2C3D2，即以70%乙醇提取3次，每次90 min，溶劑用量為10倍。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

取余甘子藥材（5目）5 g，以最佳提取工藝提取，即70%乙醇提取3次，每次90 min，溶劑用量為10倍，濾過，合并濾液，40℃減壓濃縮，干燥，平行操作3份，測定。余甘子出膏率為55.06%（RSD＝2.36%，n＝3）、總酚含量為35.82%（RSD＝0.82%，n＝3），總酚提取率為89.59%（RSD＝2.66%，n＝3），訶黎勒酸含量為4.80%（RSD＝0.60%，n＝3），沒食子酸含量為5.77（RSD＝2.71%，n＝3），粘酸-2-O-沒食子酸酯含量為11.71%（RSD＝1.96%，n＝3）。

3 討論

余甘子抗氧化、抗病毒、抗癌的主要活性成分是多酚類化合物，其中含量較高的有可水解鞣質(zhì)、小分子酚酸、粘酸，本實(shí)驗(yàn)以3類代表成分訶黎勒酸、沒食子酸、粘酸-2-O-沒食子酸酯和總酚為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)，對提取溶劑、提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑用量等考察，優(yōu)選出余甘子總酚最佳提取工藝。本提取工藝簡便，穩(wěn)定，為余甘子總酚工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

1 賈敏如,李星煒.中國民族藥志要.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:456-457.

2 王輝.余甘子的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展.中國現(xiàn)代中藥,2011,13(11):52-56.

3 李兵,黃貴慶,盧汝梅,等.余甘子化學(xué)成分研究.中藥材,2015,38(2):290-293.

4 Yang B,Kortesniemi M,Liu P,et al.Analysis of hydrolyzable tannins and other phenolic compounds in emblic leafflower(Phyllanthusemblica L.)fruits by high performance liquid chromatography-electrospray ionization massspectrometry.JAgr Food ChemJ,2012,60(35):8672-83.

5 亓旗,崔雅萍,梁文儀,等.藏藥余甘子與訶子化學(xué)和藥理作用比較.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,18(7):1171-1176.

6 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:179-187.

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8 郭炳春,沈明娟,葉征美,等.余甘子總多酚提取工藝優(yōu)化研究.熱帶作物學(xué)報(bào),2013,34(12):2479-2483.

9 曹維,朱建梅,文潔,等.余甘子有效成分提取工藝研究.中藥材,2013,36(5):812-815.

Optimum Extraction Technology of Total Polyphenol from Phyllanthusemblica via Multi-Target Orthogonal Design

Qi Qi,Cui Yaping,Liang Wenyi,Li Shi,Liang Linjin,Ye Ting,Wu Lingfang,Zhang Lanzhen
(School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

This study was aimed to optimize the extraction method for total polyphenol from Phyllanthusemblica through multi-target orthogonal experiment,in order to provide data reference for its industrial production.The comprehensive evaluation indexes included the extraction yield,extraction percentage of total polyphenol,chebulagic acid,gallic acid,mucic acid-2-O-gallate,were verified.The ethanol concentration,solid-liquid ratio and extraction time were crucial indexes for orthogonal design.The results showed that the best extraction process was using 10 times dosage 70%ethanol,to extract the medical material three time,90 minutes for every time.It was concluded that the extraction technology was reliable.This method was stable,quick and simple.It laid a fundamental foundation for the extraction method exploration.

Phyllanthus emblica.L,total polyphenol,chebulagic acid,gallic acid,mucic acid-2-O-gallate,extraction technology

10.11842/wst.2017.09.024

R284

A

2017-06-11

修回日期：2017-09-20

＊ 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81274187）：基于藏藥余甘子酚酸類成分體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的抗癌藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制研究，負(fù)責(zé)人：張?zhí)m珍。

＊＊ 通訊作者：張?zhí)m珍，本刊編委，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制研究。

（責(zé)任編輯：張 靜，責(zé)任譯審：王 晶）