王 博，張 英，王林玉，江山嬌，蔡永松，周 艷，李琰清，侯衛(wèi)坤

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，西安 710061；2陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；4西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科；5西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科；6西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；7西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)病醫(yī)院骨壞死與關(guān)節(jié)重建病區(qū)；*通訊作者,E-mail:houweikun@xjtu.edu.cn)

STAT3熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的構(gòu)建及其檢測STAT3活化能力的研究

王 博1,2，張 英3，王林玉1,2，江山嬌1,2，蔡永松4，周 艷5，李琰清6，侯衛(wèi)坤7*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，西安 710061；2陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；4西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科；5西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科；6西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；7西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)病醫(yī)院骨壞死與關(guān)節(jié)重建病區(qū)；*通訊作者,E-mail:houweikun@xjtu.edu.cn)

目的 構(gòu)建STAT3熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)并檢測STAT3活化能力，為篩選STAT3活性調(diào)控相關(guān)藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 基因合成STAT3反應(yīng)元件序列，退火形成含酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA，內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ雙酶切報告基因載體pGL6-TA，T4 DNA連接酶將STAT3反應(yīng)元件插入pGL6-TA載體多克隆位點(diǎn)，將該載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，G418篩選STAT3熒光素酶報告基因穩(wěn)定表達(dá)的單克隆HeLa細(xì)胞株。5，10,20 ng/ml不同濃度激動劑IL-6和20，40,80 μmol/L抑制劑S3I-201刺激單克隆HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞，檢測熒光素酶對應(yīng)的發(fā)光值驗(yàn)證STAT3熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的檢測能力。 結(jié)果 測序和比對結(jié)果顯示，STAT3熒光素酶報告基因系統(tǒng)pGL6-STAT3-Luc中STAT3反應(yīng)元件序列正確；G418成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)STAT3熒光素酶報告基因的單克隆HeLa細(xì)胞株；5，10和20 ng/ml濃度IL-6可刺激HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞中熒光素酶的活性顯著升高(P<0.001)，且分別升高5.4，10.3和20.0倍；不同時間點(diǎn)檢測1 ng/ml和5 ng/ml濃度IL-6刺激HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞，其熒光素酶的活性呈現(xiàn)線性增長趨勢；40 μmol/L和80 μmol/L濃度的抑制劑S3I-201與10 ng/ml濃度IL-6共刺激HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞，其熒光素酶的活性顯著降低(P<0.001)，STAT3活化的抑制率分別為18.9%和43.7%。 結(jié)論 成功構(gòu)建STAT3熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有有效檢測STAT3活化水平的能力。

熒光素酶； 報告基因； JNK-STAT信號通路； STAT3

STAT3是STAT(signal transducer of activators of transcription)家族轉(zhuǎn)錄因子的重要成員，屬于JAK(Janus kinase)-STAT信號通路特異性調(diào)節(jié)因子，在免疫、炎癥、細(xì)胞自噬以及腫瘤等生理病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。酪氨酸激酶JAK磷酸化STAT3使STAT3形成二聚體，隨后磷酸化的STAT3入核參與下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。已有的研究表明，在高免疫球蛋白E綜合征中STAT3功能缺失性突變，且與復(fù)發(fā)性感染和骨骼、牙齒的發(fā)育相關(guān)[2]；STAT3基因功能獲得型(GOF)突變導(dǎo)致多器官早發(fā)性自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺疾病以及腸道炎癥[3]；同時STAT3在多種腫瘤中的活化預(yù)示著不良的預(yù)后[4]。因此，研究STAT3在不同疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用對疾病的預(yù)防和治療具有重要的意義。

報告基因(reporter gene)主要編碼易于鑒定和檢測的基因，從而起到報告和篩選性標(biāo)記物的作用。研究人員通常將報告基因與目的基因相連形成融合基因，通過檢測該報告基因的表達(dá)，定性和定量檢測對目的基因；也可以在報告基因上游插入基因調(diào)控序列形成嵌合基因，進(jìn)而通過檢測該報告基因的表達(dá)來反映基因調(diào)控序列的調(diào)控作用。目前，常見的報告基因有l(wèi)acZ、cat、gfp、rfp以及l(fā)uc等，其對應(yīng)的編碼產(chǎn)物分別為β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和熒光素酶(luciferase)[5]。本研究選擇熒光素酶作為報告基因，其可以催化蟲熒光素氧化成氧化熒光素釋放生物熒光[6]。同時以熒光素酶作為報告基因的體系檢測極其靈敏，是高效檢測基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控目的基因的常用方法。因此，構(gòu)建STAT3報告基因檢測系統(tǒng)是深入研究并快速檢測STAT3活性的基礎(chǔ)，為高通量篩選STAT3活性調(diào)控相關(guān)藥物提供關(guān)鍵的研發(fā)工具。

本研究通過對現(xiàn)有報告基因載體pGL6-TA的改造，構(gòu)建含有特異性STAT3反應(yīng)元件的STAT3報告基因載體，在通過該載體構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)STAT3報告基因的單克隆細(xì)胞，最終在該STAT3報告基因檢測系統(tǒng)中通過STAT3激動劑和抑制劑檢驗(yàn)該系統(tǒng)的有效性和檢測能力，為STAT3的活性檢測提供方法和思路，也為STAT3活性調(diào)控相關(guān)的藥物研發(fā)和篩選提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞系

報告基因質(zhì)粒pGL6-TA購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，該載體在pGL6-basic基礎(chǔ)上添加TA promoter使得luc基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平提高。宿主菌E.coliDH5α購自天根生化科技(北京)有限公司；人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa細(xì)胞)由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心保存，用含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

STAT3反應(yīng)元件基因序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國Omega公司；高保真PCR酶Buffer購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶均購自大連寶生物工程有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent購自瑞士Roche公司；遺傳霉素(G418)購自美國Sigma-Aldrich公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System購自美國Promega公司；人源白細(xì)胞介素6(IL-6)購自美國Peprotech公司；STAT3通路抑制劑S3I-201購自美國Selleck公司。

1.3 pGL6-STAT3-Luc報告基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建

在報告基因載體pGL6-TA的多克隆位點(diǎn)區(qū)插入STAT3反應(yīng)元件序列，從而形成STAT3反應(yīng)元件、TA啟動子、熒光素酶Luc基因序列和篩選抗性Neo基因的結(jié)構(gòu)(見圖1)。將基因合成的STAT3反應(yīng)元件序列(序列見表1，兩端含酶切位點(diǎn)XhoⅠ和HindⅢ)退火形成雙鏈DNA。退火反應(yīng)體系：上游和下游合成序列各2 μl，5×FastPfu Buffer 10 μl，ddH2O補(bǔ)至50 μl；退火反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，-0.1 ℃/循環(huán)，730個循環(huán)。將報告基因載體pGL6-TA質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNA凝膠回收試劑盒純化雙酶切載體產(chǎn)物。按照退火產(chǎn)物4 μl和載體100 ng的量使用T4 DNA連接酶將STAT3反應(yīng)元件序列連接在報告基因載體pGL6-TA上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，同時以ddH2O和對照質(zhì)粒作為陰性和陽性對照進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布在含有氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)14～16 h。挑取部分單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定(上游引物：5′- CTAGCAAAATAGGCTGTCCC -3′；下游引物為STAT3下游合成序列)，將菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。測序結(jié)果與合成STAT3反應(yīng)元件序列比對分析，比對系列完全相同的質(zhì)粒命名為pGL6-STAT3-Luc。

圖1 pGL6-STAT3-Luc結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic representation of the construction of pGL6-STAT3-Luc

表1STAT3反應(yīng)元件和TA啟動子序列

Table1SequenceofSTAT3responseelementandTApromoter

Sequencename大小(bp)序 列 STAT3反應(yīng)元件67CTCGAGTGCTTCCCGAACGTTGCTTCCCGAACGTTGCTTCCCGAACGTTGCTTCCGAACGTAAGCTT TA啟動子23TAGAGGGTATATAATGGAAGCTC

1.4 pGL6-STAT3-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將pGL6-STAT3-Luc對應(yīng)的菌液按照1 ∶100轉(zhuǎn)接含Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取用于轉(zhuǎn)染的高質(zhì)量pGL6-STAT3-Luc質(zhì)粒，并使用Nano Drop對其進(jìn)行定量。將人宮頸癌細(xì)胞HeLa以4×105/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，用含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。細(xì)胞接種后24 h棄培養(yǎng)基換為無抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基，按照轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent說明書將構(gòu)建的pGL6-STAT3-Luc和對照質(zhì)粒pGL6-TA分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，其中質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的質(zhì)量體積比在預(yù)實(shí)驗(yàn)后選擇轉(zhuǎn)染效果最好的1 ∶3。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后6 h棄培養(yǎng)基換為無抗生素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞的篩選

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，向HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基中加入800 μg/ml G418進(jìn)行細(xì)胞篩選。2 d換一次含G418的篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選14 d。篩選結(jié)束后將活細(xì)胞進(jìn)行消化計數(shù)，按照0.6個細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。2周后將其中的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，將其與對照單克隆細(xì)胞分別命名為HeLa-STAT3-Luc和HeLa-TA-Luc。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞有效性的檢驗(yàn)

將上述構(gòu)建好的HeLa-STAT3-Luc和HeLa-TA-Luc細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，再按照2×104/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)96孔板中，用含DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。細(xì)胞接種后24 h加入STAT3信號通路激動劑IL-6，設(shè)置不同濃度0，5，10，20 ng/ml，每組5個復(fù)孔。加入IL-6刺激后24 h，按照雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書，使用Promega發(fā)光檢測儀只檢測熒光素酶對應(yīng)的發(fā)光值。將HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞同樣按照2×104/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)96孔板中，細(xì)胞接種后24 h分別加入0.1，1，5 ng/ml的IL-6刺激分別在刺激后0，3，6，9，12，24 h按照上述方法檢測發(fā)光值。

1.7 STAT3抑制劑對穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞的抑制作用檢測

將HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞按照2×104/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)96孔板中，用含DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。細(xì)胞接種后24 h加入10 ng/ml IL-6刺激細(xì)胞6 h，再分別加入0，20，40，80 μmol/L的STAT3抑制劑S3I-201后共刺激12 h，按照上述方法檢測發(fā)光值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 報告基因載體pGL6-STAT3-Luc的構(gòu)建及鑒定

將STAT3反應(yīng)元件序列退火產(chǎn)物連接到雙酶切的報告基因質(zhì)粒pGL6-TA上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有Amp抗性的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，分別挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。使用載體上游通用引物和退火的下游序列進(jìn)行菌落PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見1條大小為138 bp與理論大小相一致的條帶(見圖2)。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒1和2號送公司測序，測序結(jié)果與合成的STAT3反應(yīng)元件序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明其序列完全一致，STAT3反應(yīng)元件序列已成功插入pGL6-TA中，故已成功構(gòu)建報告基因載體pGL6-STAT3-Luc。

M.100 bp marker;1-4.構(gòu)建的pGL6-STAT3-Luc載體單克隆菌落PCR產(chǎn)物圖2 重組pGL6-STAT3-Luc質(zhì)粒的菌落PCR鑒定Figure 2 Identification of recombinant plasmid pGL6-STAT3-Luc by colony PCR

2.2 pGL6-STAT3-Luc穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建

將已構(gòu)建的報告基因載體pGL6-STAT3-Luc和對照載體pGL6-TA分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，隨后經(jīng)過G418篩選以及單克隆細(xì)胞的分離，最終成功得到穩(wěn)定表達(dá)報告基因的單克隆細(xì)胞株，HeLa-STAT3-Luc和HeLa-TA-Luc。使用不同濃度的STAT3信號通路激動劑IL-6(0，5，10，20 ng/ml)對兩組細(xì)胞進(jìn)行刺激24 h，檢測熒光素酶的活性。結(jié)果顯示在5，10，20 ng/ml的IL-6刺激下，HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞中熒光素酶的活性顯著升高，相對0 ng/ml的IL-6刺激HeLa-STAT3-Luc組熒光素酶的活性分別升高5.4，10.3和20.0倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見表2)。其中對照細(xì)胞HeLa-TA-Luc在不同濃度IL-6刺激下熒光素酶的活性相比無顯著變化，組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。該結(jié)果說明HeLa-STAT3-Luc可以有效檢測STAT3的活化，故已成功篩選出檢測STAT3活化的熒光素酶報告基因系統(tǒng)HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞。

IL?6濃度HeLa?TA?LucHeLa?STAT3?Luc0ng/ml133．00±5．16 1．05×106±8．07×1045ng/ml136．50±5．31 5．68×106±3．14×105???10ng/ml146．17±7．65 1．08×107±8．02×105???20ng/ml140．67±8．52 2．10×107±5．10×105???

RLU(relative light unit)是相對光單位;以0 ng/ml的IL-6刺激HeLa-STAT3-Luc為對照，與其相比,***P<0.001

2.3 STAT3熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測能力的驗(yàn)證

將已篩選出檢測STAT3活化的熒光素酶報告基因系統(tǒng)HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞，選取不同濃度IL-6(0.1，1，5 ng/ml)對該細(xì)胞進(jìn)行刺激，檢測刺激后0，3，6，9，12，24 h的熒光素酶活性。結(jié)果表明，HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞在1 ng/ml和5 ng/ml濃度IL-6刺激的不同時間下，呈現(xiàn)出較好的線性增長趨勢(見圖3)。該結(jié)果表明篩選出檢測STAT3活化的熒光素酶報告基因系統(tǒng)HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞，可以在不同濃度STAT3激動劑的刺激下檢測STAT3的活性。

圖3 不同濃度IL-6對HeLa-STAT3-Luc單克隆細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的刺激作用Figure 3 Effect of different concentrations of IL-6 on HeLa-STAT3-Luc and HeLa-TA-Luc monoclonal cells at different time points

使用STAT3抑制劑S3I-201檢驗(yàn)STAT3熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測能力，將HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞加入10 ng/ml IL-6預(yù)刺激后，再分別加入0,20,40,80 μmol/L的STAT3抑制劑S3I-201后共刺激12 h檢測熒光素酶活性。結(jié)果表明，在10 ng/ml的IL-6預(yù)刺激下，各組相對未刺激組熒光素酶的活性顯著升高，其中未加入STAT3抑制劑S3I-201組熒光素酶的活性升高7.1倍，而加入不同濃度S3I-201能夠抑制STAT3活化促進(jìn)的熒光素酶活性升高，在20 μmol/L濃度S3I-201的作用下，相比未加入S3I-201組熒光素酶的活性相有所下降但無顯著性變化，組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異；在40 μmol/L和80 μmol/L濃度S3I-201組，熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見圖4)，STAT3活化的抑制率分別為18.9%和43.7%。通過檢測L-6對HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞的刺激作用和抑制劑S3I-201對其的抑制作用，結(jié)果說明STAT3熒光素酶報告基因系統(tǒng)HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞可以有效地檢測STAT3活化水平，故已成功構(gòu)建STAT3熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)。

以10 ng/ml IL-6刺激且未加抑制劑S3I-201處理的HeLa-STAT3-Luc為對照，與其相比，***P<0.001圖4 STAT3抑制劑S3I-201對HeLa-STAT3-Luc單克隆細(xì)胞的抑制作用Figure 4 Inhibition of HeLa-STAT3-Luc monoclonal cells by STAT3 inhibitor S3I-201

3 討論

JNK-STAT信號通路是一條細(xì)胞外因子調(diào)控細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及免疫調(diào)節(jié)等眾多細(xì)胞重要的生物學(xué)過程[7]。這條信號通路是細(xì)胞內(nèi)相對簡單，從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其主要由酪氨酸激酶JAK相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT組成。酪氨酸激酶JAK相關(guān)受體主要介導(dǎo)細(xì)胞外信號，包括不同的細(xì)胞因子、干擾素、生長因子和集落刺激因子等[8]。該受體的胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶JAK的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞外信號刺激后JAK磷酸化，從而磷酸化其下游靶蛋白導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)[9]。酪氨酸激酶JAK屬于非跨膜型酪氨酸激酶，該家族擁有4個成員即JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，它們雖然在結(jié)構(gòu)上具有7個JAK同源結(jié)構(gòu)域，但由于受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不同而特異性結(jié)合不同的JAK相關(guān)受體[10]。轉(zhuǎn)錄因子STAT在該信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄激活功能，其家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6，在結(jié)構(gòu)上具有N端保守序列、DNA結(jié)合區(qū)、SH2和SH3結(jié)構(gòu)域以及C端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)[11]。細(xì)胞外信號結(jié)合相應(yīng)受體，酪氨酸激酶JAK相關(guān)受體上結(jié)合的酪氨酸激酶JAK通過交互的酪氨酸磷酸化作用從而活化，催化結(jié)合在受體上的轉(zhuǎn)錄因子STAT磷酸化，磷酸化的STAT形成同源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，通過DNA結(jié)合區(qū)調(diào)節(jié)特異的靶基因轉(zhuǎn)錄[12]。

STAT3最早作為IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的急性期反應(yīng)因子被發(fā)現(xiàn)，其SH2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基(Tyr705)被氨酸激酶JAK磷酸化后，形成同源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核參與DNA結(jié)合的定位，該過程是導(dǎo)致STAT3轉(zhuǎn)錄活性激活的主要機(jī)制[13,14]。同時STAT3的絲氨酸殘基(Ser727)可以被MAPK以及mTOR信號通路磷酸化，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[15,16]。正常的STAT3轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與脊椎動物的發(fā)育以及通過調(diào)控炎癥和免疫從而影響正常組織的功能。STAT3可以通過被抑制的PI3K信號通路或EIF2AK2/PKR信號通路抑制性調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[17,18]。STAT3通過控制胚胎干細(xì)胞的增殖與穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)控線粒體相關(guān)基因的表達(dá)和線粒體的呼吸作用，且線粒體的STAT3可以調(diào)控γ谷氨酰循環(huán)以及調(diào)節(jié)谷胱甘肽和活性氧(ROS)的產(chǎn)生[19,20]。特別是線粒體的STAT3參與Ras基因介導(dǎo)的致癌性轉(zhuǎn)化過程，由于Ras功能獲得型突變刺激MEK-Erk信號通路以及STAT3的Ser727磷酸化[21,22]。同時，在Ras介導(dǎo)自發(fā)的骨髓增殖性和胰腺腫瘤動物模型中證實(shí)STAT3參與腫瘤形成[23,24]。由于STAT3在腫瘤形成過程中扮演著轉(zhuǎn)導(dǎo)促癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的重要節(jié)點(diǎn)分子，目前已研發(fā)STAT3小分子抑制劑ISIS-STAT3Rx、OPB-51062和OPB-31121并進(jìn)行臨床試驗(yàn)[7]。如前所述，研制并快速篩選出針對JAK-STAT信號通路中STAT3分子的抑制劑，在眾多疾病特別是腫瘤的治療和預(yù)防中具有重要的價值和應(yīng)用前景。

本研究通過對報告基因載體pGL6-TA進(jìn)行快速改造，在載體的多克隆位點(diǎn)插入STAT3反應(yīng)元件序列，成功構(gòu)建STAT3報告基因載體pGL6-STAT3-Luc。將載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞再通過G418進(jìn)行篩選最終得到HeLa-STAT3-Luc穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞株。5，10和20 ng/ml濃度IL-6刺激HeLa-STAT3-Luc細(xì)胞24 h，熒光素酶的活性顯著升高，分別升高5.4，10.3和20.0倍；且該細(xì)胞在IL-6刺激的不同時間下，呈現(xiàn)出較好的線性增長趨勢；在10 ng/ml的IL-6預(yù)刺激下，分別加入40和80 μmol/L濃度STAT3抑制劑S3I-201共刺激12 h，熒光素酶活性顯著降低，對STAT3活化的抑制率分別為18.9%和43.7%。該結(jié)果說明本研究成功構(gòu)建STAT3熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，且該系統(tǒng)可以在不同濃度STAT3的激動劑和抑制劑刺激下檢測STAT3的活性。本研究構(gòu)建的STAT3報告基因檢測系統(tǒng)不僅提供了一種快速準(zhǔn)確針對STAT3活性檢測的系統(tǒng)，而且為STAT3新藥抑制劑的研發(fā)和高通量篩選提供了關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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EstablishmentofSTAT3luciferasereportergeneassaysystem

WANG Bo1,2,ZHANG Ying3,WANG Linyu1,2,JIANG Shanjiao1,2,CAI Yongsong4,ZHOU Yan5,LI Yanqing6,HOU Weikun7*

(1CenterforTranslationalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2KeyLaboratoryforTumorPrecisionMedicineofShaanxiProvince;3DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;4DepartmentofOrthopaedics,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;5DepartmentofDermatology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;6DepartmentofLaboratoryMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;7OsteonecrosisandJointReconstructionWard,JointSurgery,Xi'anHonghuiHospital,HealthScienceCenter,Xi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:houweikun@xjtu.edu.cn)

ObjectiveTo construct STAT3 luciferase reporter gene assay system, and verify the capability of STAT3 activation for screening STAT3 activity-related drugs.MethodsThe sequence of STAT3 response element was synthesized, and annealed to form double-stranded DNA containing the restriction endonuclease sites. The vector pGL6-TA was digested with restriction endonucleaseXhoⅠandHindⅢ.The STAT3 response element was inserted into vector pGL6-TA with T4 DNA ligase. The vector was transfected into HeLa cells and G418 was used to screen the monoclonal cell line stably expressing STAT3 luciferase reporter gene. The monoclonal HeLa-STAT3-Luc cells were stimulated with different concentrations of agonist IL-6 and inhibitor S3I-201, and the luminescence values were detected to verify the detection capability of STAT3 luciferase reporter assay system.ResultsThe results of sequencing and alignment results showed that the sequence of STAT3 response element in vector pGL6-STAT3-Luc was correct. The monoclonal HeLa cell line, stably expressing STAT3 luciferase reporter gene, was successfully screened with G418. Compared with 0 ng/ml IL-6, the activity of luciferase in HeLa-STAT3-Luc cells treated with 5, 10, 20 ng/ml IL-6 was significantly increased by 5.4, 10.3 and 20.0 times, respectively(P<0.001).The luciferase reaction showed a linear increasing trend in HeLa-STAT3-Luc cells treated with 1 ng/ml and 5 ng/ml IL-6 at different time points.The activity of luciferase in HeLa-STAT3-Luc cells co-stimulated with 40 μmol/L or 80 μmol/L S3I-201 and 10 ng/ml IL-6 was significantly decreased compared with 10 ng/ml IL-6(P<0.001), and the inhibition rates of STAT3 activation were 18.9% and 43.7%, respectively.ConclusionThe STAT3 luciferase reporter gene assay system can be successfully constructed, and this system has the ability to effectively detect the activation level of STAT3.

luciferase; reporter gene; JNK-STAT signaling pathway; STAT3

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201373；81703130)；陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2016SF-238)；西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院院基金資助項(xiàng)目(2016QN-13)

王博，男，1987-12生，碩士，實(shí)習(xí)研究員，E-mail:realwbo@163.com

2017-08-11

Q78

A

1007-6611(2017)11-1108-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.005