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(1.浙江同濟科技職業(yè)學院， 杭州 311231； 2.貴州省草業(yè)研究所， 貴陽 550006；3.貴州大學動物科學學院草業(yè)科學系， 貴陽 550025)

高羊茅雜交后代ISSR遺傳變異研究

屈興紅1，吳佳海2，趙麗麗3，馬林3，楊春燕2，曾洪學1

(1.浙江同濟科技職業(yè)學院， 杭州 311231； 2.貴州省草業(yè)研究所， 貴陽 550006；3.貴州大學動物科學學院草業(yè)科學系， 貴陽 550025)

利用ISSR分子標記對高羊茅(Festucaarundinacea)雜交后代進行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析。19個ISSR引物共擴增出255條重復性好、清晰的條帶，其中200條是多態(tài)條帶，多態(tài)條帶比率(PPL)為78.4%，平均每個引物擴增多態(tài)條帶數(shù)為10.5條，擴增片段大小范圍為100～2 000 bp。結(jié)果表明，高羊茅雜交后代的多態(tài)性較高，遺傳多樣性較豐富。高羊茅雜交后代遺傳相似性系數(shù)為0.647 1～0.851 0，聚類分析將高羊茅雜交后代劃分為4個大類，有相同親本的雜交后代先聚類。總之，ISSR標記可以有效地對高羊茅雜交后代進行“親緣跟蹤”和定向選擇，為雜交育種提供分子依據(jù)。

高羊茅； 雜交后代； ISSR； 聚類分析

高羊茅(Festucaarundinacea)為禾本科(Poaceae)羊茅屬(Festuca)多年生冷季型草坪草和牧草，具有耐干旱、耐鹽堿、耐寒、耐澇、性喜光又耐蔭等特點[1-3]，在綠化和畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用[4-5]。

圖1 ISSR引物 UBC 834 的擴增結(jié)果

特別是在貴州，高羊茅已成為全省草業(yè)生產(chǎn)中利用較多的草種之一。貴州省立地條件特殊復雜，高溫高濕氣候特征明顯，培育適應當?shù)貧夂驐l件的優(yōu)良品種是高羊茅快速推廣利用的前提。因此，貴州相關(guān)部門開展了大量高羊茅新品種選育工作，并取得了一些成績，現(xiàn)已育成高羊茅品種2個，并利用雜交育種技術(shù)獲得優(yōu)良雜交后代多個[4]。

ISSR(inter-simple sequence repeat)是由Zietkiewicz等創(chuàng)建的一種新型DNA分子標記，能在分子水平上提供大量的遺傳信息[6]。具有無需知道DNA序列信息、顯性標記、重復性好、多態(tài)性豐富等優(yōu)點[7]，廣泛應用于植物遺傳育種和遺傳多樣性研究[8-9]。本試驗擬利用 ISSR分子標記技術(shù)分析高羊茅雜交后代間遺傳關(guān)系，以探明雜交后代遺傳變異特點，為高羊茅種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳多樣性研究和雜交后代選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試21個高羊茅種質(zhì)中包括19個雜交后代[4]，2個育成品種(水城高羊茅和黔草1號高羊茅)，編號及雜交組合詳見表1。

表1 供試高羊茅種質(zhì)材料

編號雜交編號雜交編號雜交1A9×1168A6×11315A10×1722A8×1169A9×18516A220081893黔草1號10A10×16817A3×1114A9×11211A4×7618A120081905A6×11612A4×7619A320081116水城高羊茅13A4×7320A9×1857A9×18914A4×3421A11×183

1.2 基因組DNA提取與檢測

每個種質(zhì)采集幼嫩葉片，用植物基因組試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)提取DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，將DNA稀釋至10 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR-PCR擴增體系

參照加拿大哥倫比亞大學UBC公司公布的第9套ISSR引物序列，從中選擇60條交由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。從60個ISSR引物中篩選出19個擴增條帶多、穩(wěn)定性好、背景清晰的引物(見表2)用于正式擴增。

經(jīng)摸索后確定PCR最佳擴增體系為20μL：10×Mix 10μL，引物(0.8μM) 1μL，DNA(10 ng) 2μL，ddH2O 7μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53.9～61.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 ISSR擴增產(chǎn)物的檢測

PCR反應結(jié)束后，取5μL PCR擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測，100 V恒壓電泳30 min。電泳緩沖液為1×TAE。電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)觀測、拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

選取清晰、重復性好、分辨率高的條帶用于分析，按照相同遷移位置上有擴增條帶記為1、無記為0的方法記錄每個引物的電泳條帶，構(gòu)成ISSR表型數(shù)據(jù)矩陣。用NTSYS-PC軟件[10]進行Nei-Li遺傳相似系數(shù)(GS)分析和UPGMA。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴增結(jié)果及多態(tài)性分析

觀察各引物擴增條帶的清晰度和多態(tài)性程度，從60條ISSR引物中篩選出19條擴增條帶清晰、多態(tài)性高的引物，圖1為引物UBC 834的擴增情況。19條ISSR引物共擴增出255條清晰可重復的條帶，其中200條是多態(tài)條帶，多態(tài)條帶比率(PPL)為78.4%。每條引物可擴增的多態(tài)條帶數(shù)目為2～16條，平均擴增多態(tài)條帶數(shù)為10.5條，擴增片段大小范圍為100～2 000 bp(見表2)。

2.2 聚類分析

高羊茅雜交后代的遺傳相似系數(shù)GS值的范圍在0.647 1～0.851 0之間。根據(jù)遺傳相似性系數(shù)矩陣，利用UPMGMA法進行聚類分析。在遺傳相似性系數(shù)為0.724時，供試高羊茅被分為4大類(見圖2)，第1類僅有3號，為黔草1號高羊茅品種；第2類由18(A 12008190)和19(A 32008111)號組成；第3類由15(A 10×172)、16(A 22008189)、17(A 3×111)和10(A 10×168)號組成；第4類由1(A 9×116)、2(A 8×116)、5(A 6×116)、8(A 6×113)、7(A 9×189)、9(A 9×185)、20(A 9×185)、11(A 4×76)、12(A 4×76)、13(A 4×73)、14(A 4×34)、4(A 9×112)、6(水城高羊茅)和21(A 11×183)組成。在第4類中，雜交后代9與20最先聚到一起，其次為前二者與7、11與12，再次為5與8、13與14，表明這幾份雜交后代間的親緣關(guān)系最近。

圖2 高羊茅雜交后代ISSR標記的UPGMA聚類圖

表2 19條ISSR引物擴增結(jié)果

引物序列擴增條帶多態(tài)條帶條帶大小(bp)多態(tài)條帶比率(%)UBC834(Ag)8YT106100～100060．0UBC810(gA)8T2116100～200076．2UBC855(AC)8YT118250～200072．7UBC808(Ag)8C97100～75077．8UBC812(gA)8A1612100～200075．0UBC817(CA)8A1616100～2000100．0UBC826(AC)8C1312250～200092．3UBC835(Ag)8YC72100～75028．6UBC868(gAA)688250～2000100．0UBC850(gT)8YC1311100～100084．6UBC836(Ag)8YA1311100～100084．6UBC873(gACA)41613100～200081．3UBC807(Ag)8T158100～200053．3UBC856(AC)8YA1310100～200076．9UBC820(gT)8C158100～200053．3UBC825(AC)8T1210100～100083．3UBC818(CA)8g1515100～2000100．0UBC841(gA)8YC1915100～200078．9UBC842(gA)8Yg1312100～75092．3總數(shù)255200100～200078．4平均13．410．5

3 討 論

高羊茅為異花授粉植物，其品種多為異質(zhì)雜合群體，群體內(nèi)存在的大量變異嚴重阻礙了基于表型性狀的傳統(tǒng)雜交后代鑒定與遺傳分析方法的應用[11-12]。分子標記的運用從植物DNA基因組上可以很好地解決這一難題[13]。ISSR分子標記技術(shù)采用的引物長度為16～25 bp，PCR擴增退火溫度高，且含有重復序列，使其具有較高的多態(tài)性水平及重現(xiàn)性，而且不需要預先克隆與測序，已成功應用于雜交后代鑒定分析、植物遺傳多樣性分析等眾多研究領(lǐng)域[14-15]。利用 ISSR 技術(shù)對植物雜交后代進行遺傳變異分析的關(guān)鍵在于篩選出擴增性強、穩(wěn)定性好的引物[16]。本研究對高羊茅雜交后代基因組DNA進行ISSR分析，從60條ISSR引物中篩選出19條穩(wěn)定多態(tài)性引物，擴增出255條清晰可重復的條帶，其中具有多態(tài)性的有200條，多態(tài)條帶比率達78.4%，表明高羊茅雜交后代的多態(tài)性較高，遺傳多樣性較豐富。

通過ISSR分子標記檢測出供試高羊茅雜交后代的遺傳相似系數(shù)GS值的范圍為0.647 1～0.851 0之間，結(jié)合聚類分析表明，有相同親本的雜交后代先聚到一起，表明其親緣關(guān)系相對較近，如9(A 9×185)與20(A 9×185)及7(A 9×189)、5(A 6×116)與8(A 6×113)、11(A 4×76)與12(A 4×76)、13(A 4×73)與14(A 4×34)、1(A 9×116)與2(A 8×116)等；而育成品種“黔草1號”高羊茅單獨成為一類，表明其與其余20個材料間親緣關(guān)系最遠。

總之，利用ISSR分子標記技術(shù)研究高羊茅雜交后代植物遺傳多樣性是可行的。在高羊茅雜交育種過程中，可以通過分子標記技術(shù)對雜交后代進行“親緣跟蹤”和定向選擇，為雜交育種提供理論依據(jù)。

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Genetic Variation Among Hybrids of Tall Fescue Based onISSR Molecular Markers

QUXinghong1,WUJiahai2,ZHAOLili3,MALin3,YANGChunyan2,ZENGHongxue1

(1.Zhejiang Tongji Vocational College of Science and Technology,Hangzhou 311231,China；2.Guizhou Prataculture Institute,Guiyang 550006,China；3.Department of Grassland Science,College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The genetic diversity and genus relationship of tall Fescue hybrids was investigated by the ISSR molecular markers technique.There were 255 DNA bands were amplified using 19 reliable ISSR primers, among which 200 DNA bands were polymorphic.The percentage of polymorphic bands reached 78.4%. Every primer had 10.5 polymorphic bands in average.The length of amplified DNA fragments ranged from 100 bp to 2 000 bp.The result showed that the polymorphism of ISSR marker in tall fescue hybrids was high.The genetic similarity among tall fescue hybrids were 0.647 1-0.851 0.The results of cluster analysis using the unweighted pairground method with arithmetic average (UPGMA) based on ISSR data showed that these tested resources were divided into four main groups,the hybrids with the same parent clustered,firstly.So,ISSR markers can be used as an effective molecular technique for directional selection of the interspecific hybrid and the study of tall fescue cross-breeding.

tall fescue; hybrid; ISSR; cluster analysis

2016-08-29

省優(yōu)秀青年科技人才專項(黔科合人字[2011]18號)；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)計劃項目(黔科合NY字[2008]3070號)；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)計劃項目(黔科合NY字[2014]3048號、黔科合NY字[2010]3049號)。

屈興紅(1979—)，女，河南省淅川縣人；碩士，實驗師，主要從事設施農(nóng)業(yè)技術(shù)；E-mail：xhqu2004@163.com。

吳佳海(1969—)，男，研究員；E-mail：wujiahai2003@yahoo.com.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.01.019

S 543

A

1001-4705(2017)01-0019-04