黎美琳 顧鵬

基質(zhì)交聯(lián)分子1表達(dá)下調(diào)對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響

黎美琳1顧鵬2

目的探討基質(zhì)交聯(lián)分子1（STIM1）表達(dá)下調(diào)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，并研究其分子作用機(jī)制。方法構(gòu)建攜帶STIM1基因siRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞，分為對(duì)照組、空載體組和STIM1組。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot驗(yàn)證STIM1組SW1990細(xì)胞STIM1表達(dá)下調(diào)。通過(guò)MTT增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STIM1表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖、周期和細(xì)胞凋亡的影響，采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)的變化。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果STIM1組SW1990細(xì)胞中STIM1表達(dá)mRNA（0.261±0.029）、蛋白（0.120±0.032）低于空載體組 mRNA（1.002±0.091）、蛋白（0.996±0.053），t=20.74、26.89，P均＜0.01。SW1990細(xì)胞 24、48、72 h 的 增 殖水平 STIM1 組 分 別為（0.122±0.008）、（0.252±0.031）、（0.373±0.028），相 比 空 載 體 組（0.223±0.035）、（0.618±0.017）、（0.924±0.140），t=6.48、16.90、23.99，P＜0.01，受到抑制。STIM1組中SW1990細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例（41.47±0.66）﹪高于空載體組（10.30 ± 2.24）﹪，t=23.14，P＜0.01。STIM1組中 SW1990細(xì)胞凋亡率（25.21±1.96）﹪高于空載體組（3.71±1.23）﹪，t=16.03，P＜0.01。半定量 RT-PCR 和Western blot提示，STIM1組細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）表達(dá)mRNA（0.344±0.031）、蛋白（0.776±0.042）相比空載體組mRNA（1.011±0.060）、蛋白（1.034±0.036），t=40.06、8.51，P均＜0.01 下調(diào) ；STIM1組 p21表達(dá)mRNA（1.970±0.107）、蛋白（1.315±0.093）相比空載體組 mRNA（1.025±0.044）、蛋白（0.998±0.036），t=17.10、9.52，P均＜0.01上調(diào) ；STIM1組 Bcl-2表達(dá) mRNA（0.156±0.025）、蛋白（0.381±0.028）相比空載體組 mRNA（1.010±0.072）、蛋白（0.980±0.057），t=15.46、14.63，P均＜0.01下調(diào)；STIM1組 survivin表達(dá) mRNA（0.188±0.022）、蛋白（0.022±0.019）相比空載體組 mRNA（1.016±0.090）、蛋白（0.994±0.047）t=58.08、442.58，P均＜0.01下調(diào) ；STMI1組procaspase-3表達(dá)蛋白（0.389 ±0.030）相比空載體組蛋白（1.008±0.040）下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.22，P＜0.01）。結(jié)論在胰腺癌SW1990細(xì)胞中，沉默STM1可阻滯細(xì)胞于G2/M期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有望成為胰腺癌治療的分子靶點(diǎn)。

胰腺癌； 基質(zhì)交聯(lián)分子1； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率不斷攀升，在西方國(guó)家其死亡率現(xiàn)已位居惡性腫瘤第四位。由于胰腺癌起病隱匿、缺乏早期檢測(cè)手段，惡性程度高、進(jìn)展迅速、放化療不敏感，故預(yù)后極差，五年生存率不足5﹪[1]。因此尋找有效的分子治療靶點(diǎn)是目前胰腺癌研究熱點(diǎn)。

基質(zhì)交聯(lián)分子1（stormal interaction molecule 1，STIM1）是一種主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白，具有一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)端Ca2+結(jié)合區(qū)域和多個(gè)胞質(zhì)端蛋白-蛋白相互作用區(qū)域。它不僅作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度的感受器，而且參與細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流的激活[2-4]。近年來(lái)研究表明STIM1在乳腺癌、肝癌、宮頸癌、肺癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可減弱腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成[5-8]等生物學(xué)行為。本課題組前期研究[9-11]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌PC-3細(xì)胞中抑制STIM1表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞凋亡增加；在前列腺癌DU145細(xì)胞中抑制STIM1表達(dá)后，細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯降低。而在胰腺癌中STIM1功能尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)采用小干擾RNA靶向抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990中STIM1的表達(dá)，進(jìn)一步觀察STIM1表達(dá)下調(diào)后SW1990細(xì)胞增殖、凋亡的變化及其相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

一、試劑和器材

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。STIM1基因的siRNA干擾序列，攜帶STIM1 siRNA的慢病毒載體STIM1-pGCSILGFP及空載體pGCSIL-GFP由上海吉?jiǎng)P基因公司設(shè)計(jì)與合成；STIM1基因siRNA干擾序列如下：CCGGGCTCTCCACATTTGGATTCTTTTCAAGA GAAAGAATCCAAATGTGGAGAGCTTTTTG及A ATTCAAAAAGCTCCACATTTGGATTCTTTCTCTT GAAAAGAATCCAAATGTGGAGAGC。RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）。胎牛血清（杭州四季青公司）。四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國(guó)Sigma公司）。Annexin V-FLTC/PI 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas公司）。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Western blot相關(guān)試劑（武漢碧云天公司）。PCR引物序列由上海生工設(shè)計(jì)合成。survivin、Bcl-2、caspase-3一抗（美國(guó)CST公司），STIM1一抗（美國(guó)ABGENT公司），cyclinB1一抗（美國(guó)Santa Cruz公司），P21、GAPDH一抗，羊抗兔、羊抗鼠二抗（武漢碧云天公司）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

胰腺癌SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)于含有10﹪胎牛血清RPMI 1640的培養(yǎng)基中，于37 ℃, 5﹪ CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞常規(guī)每2～3 d 傳代1次，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組：SW1990細(xì)胞以2×104/孔接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后去除培養(yǎng)基，加入含有5 μg/ml polybrene轉(zhuǎn)染增強(qiáng)液，以感染復(fù)數(shù)（MOI）=50加入相應(yīng)慢病毒載體，分組如下：（1）對(duì)照組：未感染病毒；（2）空載體組：感染空白pGCSIL-GFP ；（3）STIM1 組 ：感染 STIM1-pGCSILGFP。轉(zhuǎn)染后12 h去除病毒加入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染后72 h觀察SW1990細(xì)胞綠色熒光表達(dá)量。

2. MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞處理及分組同上，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)接種于96孔板，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，分別于24、48和72 h后，每孔加入 10 μl MTT（5 mg/L），避光孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩搖勻，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（A值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.細(xì)胞周期檢測(cè)：細(xì)胞處理及分組同上，培養(yǎng)48 h后，收集各組上清液及貼壁細(xì)胞，PBS洗滌，冰預(yù)冷的70﹪乙醇4 ℃固定過(guò)夜后，PBS洗滌3次去除固定液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求加入配置好的碘化丙啶染色液，于37 ℃避光孵育30 min，最后采用流式細(xì)胞儀分析樣品中的DNA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡—Annexin V/PI雙染色法：細(xì)胞處理及分組同上，培養(yǎng)48 h后，收集各組上清液及貼壁細(xì)胞，PBS洗滌。按凋亡試劑盒步驟進(jìn)行操作。以l×106/ml密度用1×binding buffer 1 ml 重懸細(xì)胞，取100 μl細(xì)胞懸液加入5 μl Annexin V-FLTC 和 1 μl PI（100 μg/ml），室溫避光作用 15 min，再加入 400 μl 1× binding buffer，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

5.半定量RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：轉(zhuǎn)染72 h后，Trizol充分裂解各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度和濃度。取5 μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5﹪瓊脂糖凝膠電泳。以各基因灰度與GAPDH灰度比值作為相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

6. Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：轉(zhuǎn)染72 h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12000×g高速離心10 min，取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品與5×loading buffer混合煮沸5 min，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5﹪脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗3次，ECL法顯色，壓片，曝光。應(yīng)用圖像分析軟件Quantity One對(duì)顯色條帶進(jìn)行灰度分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，STIM1的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量，細(xì)胞增殖A值，細(xì)胞周期、凋亡相對(duì)數(shù)目，細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量用± s表示。STIM1組與空載體組比較，空載體組與對(duì)照組比較采用t檢驗(yàn)。STIM1組、空載體組和對(duì)照組，三組均數(shù)比較采用方差分析F檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌細(xì)胞SW1990轉(zhuǎn)染STIM1 siRNA后STIM1表達(dá)下調(diào)

在MOI=50條件下，慢病毒載體轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞72 h后，熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)大于90﹪細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率較高（圖1）。RT-PCR和Western blot證明STIM1組與空載體組比較，SW1990細(xì)胞STIM1基因mRNA和蛋白的表達(dá)下降（P＜0.05）；空載體組與對(duì)照組比較，STIM1 mRNA和蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖 2、表 2）。

圖1 倒置熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞72 h (×100)

圖2 STIM1 siRNA 靶向干擾 SW1990細(xì)胞后STIM1的表達(dá)變化

二、STIM1表達(dá)下調(diào)抑制SW1990細(xì)胞增殖

MTT增殖實(shí)驗(yàn)示，STIM1組和空載體組比較，SW1990細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的增殖水平均受到抑制（均P＜0．05），但空載體組與對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，表3）。

三、STIM1表達(dá)下調(diào)使SW1990細(xì)胞阻滯于G2/M期

STIM1組SW1990細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)為（43.78±2.96）﹪，低于空載體組（74.04±3.51）﹪（P＜0.05）；G2/M 期 細(xì) 胞 數(shù)（41.47±0.66）﹪，高于空載體組（10.30±2.24）﹪（P＜0.05，表 4）。提示抑制STIM1表達(dá)能使SW1990細(xì)胞大量靜止于G2/M期。

四、Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

對(duì)照組和空載體組的細(xì)胞凋亡率分別為（3.51±1.19）﹪和（3.71±1.23）﹪，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但 STIMl組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（25.21±1.96）﹪，高于空載體組（P＜0.05）。

表2 STIM1 siRNA靶向干擾SW1990細(xì)胞后，STIM1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量（± s）

表2 STIM1 siRNA靶向干擾SW1990細(xì)胞后，STIM1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量（± s）

注 ：與對(duì)照組比較，aP＜0.05 ；與空載體組比較，bP＜0.05 ；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

分組 mRNA 蛋白對(duì)照組 1.000±0.064 1.000±0.071空載體組 1.002±0.091 0.996±0.053 STIM1組 0.261±0.029ab 0.120±0.032ab F值 124.286 260.614 P值 ＜0.01 ＜0.01

表3 抑制STIM1表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響（± s）

表3 抑制STIM1表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響（± s）

注 ：與對(duì)照組比較，aP＜0.05 ；與空載體組比較，aP＜0.05 ；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

分組 24 h（OD） 48 h（OD） 72 h（OD）對(duì)照組 0.221±0.023 0.603±0.009 0.900±0.137空載體組 0.223±0.035 0.618±0.017 0.924±0.140 STIM1 組 0.122±0.008ab 0.252±0.031ab 0.373±0.028ab F值 16.507 290.062 22.294 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 抑制STIM1表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞周期影響（﹪，± s）

表4 抑制STIM1表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞周期影響（﹪，± s）

注 ：與對(duì)照組比較，aP＜0.05 ；與空載體組比較，aP＜0.05 ；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

分組 G0/G1期 S期 G2/M期對(duì)照組 71.55±2.86 16.15±3.28 12.30±1.24空載體組 74.04±3.51 15.66±1.29 10.30±2.24 STIM1 組 43.78±2.96 14.75±2.49ab 41.47±0.66ab F值 0.244 391.899 173.085 P值 0.791 ＜0.01 ＜0.01

表5 抑制STIM1表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的變化（﹪，± s）

表5 抑制STIM1表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的變化（﹪，± s）

注 ：與對(duì)照組比較，aP＜0.05 ；與空載體組比較，aP＜0.05 ；實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次

cyclinB1 P21 Bcl-2 survivin caspase-3 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 蛋白對(duì)照組 1.000±0.055 1.000±0.061 1.000±0.043 1.000±0.039 1.000±0.070 1.00±0.037 1.000±0.066 1.000±0.056 1.000±0.063空載體組 1.011±0.060 1.034±0.036 1.025±0.044 0.998±0.036 1.010±0.0720.980±0.057 1.016±0.090 0.994±0.047 1.008±0.040 STIM1 組 0.344±0.031ab0.776±0.042ab1.970±0.107ab1.315±0.093ab0.156±0.025ab0.381±0.028ab0.188±0.022ab0.022±0.019ab 0.389±0.030ab F值 173.085 26.079 180.637 26.127 201.945 206.135 155.933 499.817 175.424 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01分組

五、與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化

RT-PCR結(jié)果顯示，與空載體組比較，STIM1組中與細(xì)胞周期相關(guān)的cyclinB1 mRNA表達(dá)減弱（P＜0.05），P21 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）；與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl-2、survivin mRNA表達(dá)均下調(diào)（P均＜0.05）?？蛰d體組與空白組相比較，上述基因mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，圖3a、表5）。

Western blot結(jié)果顯示，與空載體組比較，STIM1組中與細(xì)胞周期相關(guān)的cyclin B1蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），P21 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與細(xì)胞凋亡相關(guān)的caspase-3裂解激活，Bcl-2、survivin蛋白表達(dá)下調(diào)（P均＜0.05）?？蛰d體組與空白組相比較，上述基因的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均 ＞0.05，圖3b、表5）。

圖3 抑制STIM1表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡相關(guān)分子變化

討 論

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)簡(jiǎn)單的第二信使，廣泛參與、維持細(xì)胞正常生理功能如肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)和激素的釋放，基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、凋亡等。研究表明STIM1是激活細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流的重要因子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+濃度極低時(shí)，STIM1可感受此信號(hào)而活化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，通過(guò)介導(dǎo)鈣庫(kù)操縱性鈣通道蛋白Orail等結(jié)構(gòu)的改變，使鈣通道開(kāi)放，鈣離子內(nèi)流，從而提高細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的Ca2+濃度[2-3]。這一途徑是調(diào)節(jié)Ca2+進(jìn)入非興奮性細(xì)胞的主要方式，在維持細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡具有十分重要的意義。

許多研究表明鈣離子調(diào)節(jié)的失衡在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重要作用，因此作為Ca2+濃度感受器的STIM1是近年來(lái)腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。既往文獻(xiàn)報(bào)道STIM1在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)增加，靶向沉默STIM1基因可干擾腫瘤的細(xì)胞生物學(xué)行為[5-8]。El Boustany等[7]指出在人肝癌細(xì)胞中抑制STIM1表達(dá)，通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1表達(dá)，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖；2009年一篇文章指出[8]沉默STIM1可通過(guò)抑制黏著斑循環(huán)來(lái)減弱乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移的能力。由此可見(jiàn)，STIM1基因通過(guò)不同途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。目前為止，STIM1基因在胰腺癌中的功能尚不清楚。與既往研究方法類似，本實(shí)驗(yàn)采用胰腺癌細(xì)胞SW1990，利用小干擾RNA靶向抑制SW1990細(xì)胞中STIM1表達(dá)，建立有效細(xì)胞模型進(jìn)一步探索STIM1基因沉默在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的可能機(jī)制。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失衡，致細(xì)胞正常生長(zhǎng)、分化障礙，進(jìn)而引起細(xì)胞惡性增殖，是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）、周期蛋白（cyclin）與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展，啟動(dòng)細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程中起重要作用。Li等[12]在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中最新研究指出，RNA干擾技術(shù)特異性抑制U251細(xì)胞中STIM1表達(dá)后能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，其可能機(jī)制與上調(diào)p21及下調(diào)CDK4、cyclinD1的表達(dá)，阻斷DNA合成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了STIM1表達(dá)下調(diào)后胰腺癌SW1990細(xì)胞周期分布的變化，結(jié)果表明，抑制STIM1表達(dá)使SW1990細(xì)胞阻滯于G2/M期，干擾有絲分裂，抑制腫瘤的增殖。半定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示此過(guò)程伴有細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)變化，故提示SW1990細(xì)胞增殖抑制和周期阻滯可能與下調(diào)cyclinB1與上調(diào)p21有關(guān)。

早期研究指出，細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)破壞具有明顯細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡[13]。如上所述，STIM1在維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡中的關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步證明抑制STIM1的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，是否介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)抑制SW1990細(xì)胞STIM1表達(dá)，細(xì)胞凋亡情況及相關(guān)分子變化。眾所周知，caspases家族在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，當(dāng)各種信號(hào)激活caspase聯(lián)級(jí)反應(yīng)后，作為凋亡執(zhí)行者的caspase-3可激發(fā)凋亡細(xì)胞特征性表現(xiàn)形成凋亡小體，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中最主要的成員，是細(xì)胞凋亡的抑制成分。既往研究表明[14]在前列腺癌細(xì)胞中Bcl-2通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣濃度的變化，間接調(diào)節(jié)凋亡的發(fā)生。Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族的成員之一，主要通過(guò)與caspase-3和caspas-7的結(jié)合抑制caspase聯(lián)級(jí)反應(yīng)，強(qiáng)烈地抑制凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，STIM1蛋白表達(dá)下調(diào)能使胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡比例明顯增加，同時(shí)伴有Bcl-2、survivin細(xì)胞凋亡分子的表達(dá)下調(diào)及caspase-3的裂解激活。提示抑制STIM1表達(dá)，可明顯誘導(dǎo)胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡，其可能與抑制Bcl-2、survivin蛋白表達(dá)，激活caspase聯(lián)級(jí)反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，靶向抑制STIM1表達(dá)能夠抑制SW1990細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，這些細(xì)胞生物學(xué)行為的改變與相關(guān)基因的異常表達(dá)存在密切的關(guān)系。因此認(rèn)為，進(jìn)一步對(duì)胰腺癌細(xì)胞中STIM1信號(hào)途徑進(jìn)行研究，有望成為胰腺癌臨床治療的分子靶點(diǎn)。

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2016-11-03）

（本文編輯：蔡曉珍）

黎美琳,顧鵬.基質(zhì)交聯(lián)分子1表達(dá)下調(diào)對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（5）：265-270.

Effects of down-regulation of stormal interaction molecule 1 on cell cycle and apoptosis of pancreatic cancer cell line SW1990

Li Meilin1, Gu Peng2 .1Department of Hepatology, Wuxi No.5 People's Hospital, Wuxi 214000, China;2Department of Urology, Xishan People's Hospital of Wuxi,Wuxi 214000, China

Gu Peng, Email: gdp_1988@126.com

ObjectiveTo investigate effects of down-regulation of STIM1 on cell cycle and apoptosis of pancreatic cancer cell line SW1990 and explore its possible molecular mechanism.MethodsLentiviral vectors, which carrying siRNA of STIM1 gene, were contructed. Then lentiviral vectors were used to transfect the SW1990 cells and were divided into three groups:an untreated group, an empty vector group and an STIM1 group. The effects of down-regulation of STIM1 expression on cell proliferation, cell cycle and apoptosis were assessed by MTT assay and flow cytometry, respectively. Further expression changes of genes related to cell cycle and apoptosis were detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blot. All values present the mean±SD.ttest was used between the two groups.ResultsThe STIM1 expression of STIM1 group mRNA (0.261 ± 0.029), protein (0.120 ± 0.032) was down-regulated compared with the empty vector group [mRNA (1.002 ± 0.091)t=20.74,P＜0.01], [protein(0.996 ± 0.053)t=26.89,P＜0.01] in the SW1990 cells. Cell proliferation of SW1990 in the STIM1 group in 24 h, 48 h, 72 h (0.122 ± 0.008),(0.252 ± 0.031),(0.373±0.028) was significantly inhibited compared with the empty vector group[(0.223± 0.035)t=6.48,P＜0.01],[(0.618±0.017)t=16.90,P＜0.01],[(0.924 ± 0.140)t=23.99,P＜0.01]. The results of flow cytometry revealed that the percentage of cells at G2/M phase in the STIM1 group was (41.47±0.66)﹪, significantly higher than that in the empty vector group [(10.30±2.24) ﹪ ,t=23.14,P＜0.01]. In addition, the percentage of apoptotic cells in the STIM1 group was(25.21±1.96)﹪ , significantly higher than that in the empty vector group [(3.71 ±1.23) ﹪ ,t=16.03,P＜0.01]. Moreover, the results of semi-quantitative RT-PCR and Western blot showed that Cyclin B1 expression of the STIM1 group[mRNA(0.344±0.031)], [protein(0.776±0.042)]was down regulated compared with the empty vector group[mRNA (1.011±0.060)t=40.06,P=0.000][protein(1.034±0.036)t=8.51,P＜0.01],P21 expression of STIM1 group[mRNA(1.970±0.107)],[protein(1.315±0.093)]was regulated compared with the empty vector group[mRNA(1.025 ±0.044)t=17.10,P＜0.01],[protein(0.998±0.036)t=9.52,P＜0.01], Bcl-2 expression of STIM1 group[mRNA(0.156±0.025)], [protein(0.381±0.028)] was down regulated compared with the empty vector group[mRNA(1.010±0.072)t=15.46,P＜0.01],[protein(0.980±0.057)t=14.63,P＜0.01]. Survivin expression of STIM1 group[mRNA(0.188 ±0.022)],[protein(0.022±0.019)] was down regulated compared with the empty vector group[mRNA(1.016±0.090)t=58.08,P＜0.01], [protein(0.994±0.047)t=442.58,P＜0.01]. Procaspase-3 expression of STIM1 group [protein(0.389±0.030)]was down regulated compared with the empty vector group[protein(1.008± 0.040)t=19.22,P＜0.01].ConclusionSTIM1 may play a pivotal role in the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cell line SW1990, which could become a molecular target for therapy of pancreatic carcinoma.

Pancreatic cancer; Stormal interaction molecule 1; Cell cycle; Cell apoptosis

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.05.003

214000 無(wú)錫市第五人民醫(yī)院（無(wú)錫市傳染病醫(yī)院）肝病科1；214000 無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院泌尿外科2

顧鵬，Email:gdp_1988@126.com