梁程　李一鵬

摘要：在MS培養(yǎng)基上，接種煙草無菌苗的葉片，分別放在光照和黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，接種于MS分化培養(yǎng)基上，在光照下分化再生植株。結(jié)果表明：光照和植物生長調(diào)節(jié)劑對植物愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞：煙草；愈傷組織；植株再生

一、 實驗?zāi)康?/p>

1. 掌握植物組織培養(yǎng)的方法和要點。

2. 學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制方法、步驟及葉片培養(yǎng)環(huán)節(jié)中，外植體滅菌、接種、培養(yǎng)觀察等技術(shù)環(huán)節(jié)。

3. 了解外植體脫分化及再生過程。

二、 材料與器材

1. 植物材料：煙草葉片。

2. 實驗藥品：MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、升汞、NAA、6-BA、NaOH。

3. 儀器設(shè)備：高壓滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱、天平、pH計、超經(jīng)工作臺、酒精燈。

4. 器械及用具：鑷子、手術(shù)刀、記號筆等。

5. 玻璃器皿：培養(yǎng)瓶、量筒、容量瓶等。

三、 實驗步驟

（一） MS培養(yǎng)基母液配制

大量元素配成50倍母液，使用時每1L培養(yǎng)基需要從母液中取20mL。配制母液時應(yīng)做到分別稱量，充分溶解，在混合次序上應(yīng)最后加入Ca2+，混合時要邊加邊混合。

微量元素配成100倍母液，使用時每配制1L培養(yǎng)基從母液中取10mL，配制時應(yīng)注意充分溶解后再依次混合。

鐵鹽單獨配制，與其他元素混合易造成沉淀。一般采用螯合鐵，即FeSO4與EDTA鈉鹽的混合物，一般擴大100倍。EDTA鈉鹽須用溫水溶解，然后與FeSO4液混合，在75℃～80℃之間讓其螯合1h。使用螯合鐵的目的是避免沉淀，并使培養(yǎng)基能緩慢不斷地供應(yīng)Fe2+。有機物質(zhì)可配成100倍濃縮液，使用時每1L培養(yǎng)基加10mL。（本次實驗采用培養(yǎng)基粉末代替較為方便）

（二） 培養(yǎng)基的配制

取1000mL燒杯，先加入500mL的蒸餾水，然后根據(jù)培養(yǎng)基成分及用量，吸取各種母液加入燒杯，稱取蔗糖（一般用量3%）、瓊脂（一般6～8g/L），按需要的濃度加入植物激素，加水至800mL，加熱使瓊脂融化，定容到1000mL，用1NNaOH或HCl調(diào)pH至5.8。

（三） 培養(yǎng)基滅菌

將配好的培養(yǎng)基迅速分裝至50mL三角瓶中，用牛皮紙或報紙包扎封口。放入滅菌鍋121℃，滅菌20min。

（四） 外植體取材、消毒及接種

自大田或溫室取材時應(yīng)選擇無病、無蟲、生長健壯的外植體。對于難消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用自來水沖凈，在70%酒精中浸30s，再加入消毒劑。不同的材料消毒的方式和所需時間不一樣，研究者應(yīng)根據(jù)不同材料確定具體消毒方案。外植體消毒的一般順序為：外植體——自來水多次沖洗——消毒液處理（75%乙醇30s，消毒液xmin）——無菌水沖洗——無菌濾紙吸干——接種。

（五） 無菌操作

操作前把準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基、待消毒材料、無菌水、無菌燒杯及其他必需玻璃器皿、無菌操作工具、70%酒精等放到超凈工作臺上，然后打開超凈工作臺和紫外燈，讓其運行 30min 后再進行操作，在超凈工作臺上打開燒杯和無菌水瓶蓋，將HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料的燒杯中，10min后取出另一盛有無菌水的燒杯中，無菌水沖洗3～4次，然后將材料取出切割后接種在培養(yǎng)基中，封口，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。

四、 結(jié)果分析

根據(jù)不同時期的觀察圖片可發(fā)現(xiàn)煙草的組織培養(yǎng)與植株再生實驗基本上比較成功，煙草的離體組織經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，經(jīng)過一段時間的再分化形成不定芽等過程。從不同角度、類型的照片可觀察到該離體組織的再生能力較強，具有細胞全能性。

五、 心得體會

通過這次組培實驗課的機會，我基本上成功地了解開展組培實驗需要的基本條件，整個過程使我自身受益匪淺，同時我也學(xué)到了很多實用的東西。從最基礎(chǔ)的稱量藥品到比較復(fù)雜的制作培養(yǎng)基、植物接種等等，都在漸漸地學(xué)習(xí)著。雖然由于時間的緣故，我學(xué)到只是組培最基本的過程，但我希望在以后可以有機會學(xué)到更多關(guān)于植物組織培養(yǎng)的操作技術(shù)。在培養(yǎng)基的配制過程中我們攪拌要注意不能讓瓊脂黏在玻璃杯底部變黑，要不停地攪拌。而且必須使之沸騰才能在移液后使培養(yǎng)基凝固以便于下一步的操作。并且，如果沒有加入這個課程實驗，我可能不會接觸到植物的接種。在接種過程中，個人非常緊張，因為一旦外植體被污染，后續(xù)實驗會相繼失敗，但是經(jīng)歷了一次接種外植體的過程后，我認為只要我們保持冷靜的頭腦再加上具備一定基礎(chǔ)的組培實驗知識就能把這個步驟做好。

在四周的觀察期間，第一次我是懷著忐忑的心情去觀察的，因為這是我自身的第一次組培成果，當(dāng)看到我的葉片變黃變白了我趕緊請教老師是不是我的葉片被污染了，在老師細心、詳細講解這個現(xiàn)象后我才知道這個是正常的現(xiàn)象，也逐漸安心下來。接下來幾次我都及時記錄拍攝煙草離體組織的生長狀況。總而言之，我認為組培實驗?zāi)軌蛄己玫嘏囵B(yǎng)學(xué)生的動手能力和操作能力，不僅如此，在整個實驗過程中還收獲了不少樂趣，伴隨著煙草離體組織的成長歷程，我也了解并掌握了組培實驗各個過程及相關(guān)知識，收獲了很多比如每周堅持不懈觀察的毅力、細致的觀察、精確的實驗操作技術(shù)。

六、 注意事項

1. 實驗所使用的器材要嚴(yán)格滅菌，注意無菌操作，避免因染菌導(dǎo)致實驗失敗。

2. 配制貯存母液時，要算好各種成分逐次加入，等第一種成分完全溶解后再加入第二種成分，切忌“一鍋煮”。有機物質(zhì)配好以后要裝入棕色瓶放入電冰箱內(nèi)保存，其他三種母液可在常溫下保存但最多不能超過一個月。

3. pH值對培養(yǎng)基的硬度有影響，pH過高培養(yǎng)基變硬，pH過低培養(yǎng)基不能凝固，所以要調(diào)整好培養(yǎng)基的pH值。

4. 材料脫毒時不要在酒精中停留過長時間，以免材料被殺死。

5. 接種后進行培養(yǎng)時，為確保實驗成功，可以首先進行7～10d的暗培養(yǎng)，然后再進行光照培養(yǎng)。

6. 無菌操作時應(yīng)注意下面幾個問題：整個操作過程一切用具必須始終保持無菌狀態(tài)；無菌操作前必須用肥皂洗手，然后用70%酒精消毒；操作時無菌器皿一旦打開，應(yīng)盡量避免手再從其上橫過；避免強呼吸，呼吸時應(yīng)將臉移開超凈臺；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。

作者簡介：

梁程，李一鵬，浙江省金華市，浙江師范大學(xué)。endprint