張亞君 劉文利 林明明 王尚明 （山東迅達康獸藥有限公司 山東濟南 250306）鄧學(xué)兵 馬興旺 （南京日升昌生物技術(shù)有限公司 江蘇南京）

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歸芪飲安全藥理學(xué)試驗研究

張亞君 劉文利 林明明 王尚明 （山東迅達康獸藥有限公司 山東濟南 250306）鄧學(xué)兵 馬興旺 （南京日升昌生物技術(shù)有限公司 江蘇南京）

23日齡非免疫健康羅曼蛋公雞640羽，隨機均分為6個不同劑量用藥組，1個疫苗對照和1個空白對照組，另取60羽設(shè)1個疫苗對照組和1個空白對照組，30羽/組，除空白對照組外均用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、點眼免疫(3羽份/羽)，37日齡二免。在免疫的同時，6個用藥組分別飲水添加6種濃度的的歸芪飲，0.5ml/羽，1次/d，連續(xù)3d；給藥后每天觀察各組雞群精神、活動、采食、飲水和發(fā)病死亡情況；分別于免疫后第7、14、21、28、35和42天翼靜脈采血，檢測血清NDV-HI抗體效價；于首次免疫后第8周選取0.5g/ml、1g/ml、1.5g/ml、2g/ml 4個濃度組(50羽/組)，1個疫苗攻毒對照組(50羽/組)，1個空白攻毒對照組(50羽/組)，1個疫苗對照組(30羽/組)和1個空白對照組(30羽/組)進行攻毒保護試驗。同時，進行了體外刺激外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖試驗。結(jié)果顯示，各組給藥后未見任何不良反應(yīng)，各濃度組在各時間點的抗體效價多明顯或顯著高于疫苗對照組和空白對照組，1g/ml濃度組雞只末重顯著增加，1g/ml、1.5g/ml濃度組日增重顯著高于對照組，料重比顯著低于對照組，2g/ml濃度組料重比顯著低于對照組；1.5g/ml濃度組的攻毒保護率最高，其次為1g/ml濃度組；體外試驗結(jié)果也顯示，歸芪飲在合適的濃度可以刺激外周血T淋巴細胞增殖。表明歸芪飲臨床應(yīng)用安全，增強細胞免疫和體液免疫的效果確實，可以將1~2g/ml濃度作為臨床試驗應(yīng)用濃度，1g/ml濃度最佳。

歸芪飲 臨床給藥反應(yīng) 抗體效價 生長性能 攻毒保護 體外增殖

歸芪飲是以當(dāng)歸、黃茂、淫羊霍、山楂、枸杞、蒼術(shù)六味中藥經(jīng)過現(xiàn)代工藝提取制成的口服液，是一種具有免疫增強作用的復(fù)方制劑。藥效試驗已經(jīng)證實歸芪飲具有較佳的免疫增強作用，能夠有效提高雞體的體液免疫功能，顯著增強新城疫疫苗的免疫效果。本試驗進一步觀察了系列濃度的歸芪飲對雞的給藥反應(yīng)和對新城疫苗免疫效果的影響，及其在體外對T淋巴細胞增殖作用的影響，旨在確證歸芪飲的安全性和藥理作用，并為臨床試驗篩選出最佳濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 試驗藥品由山東迅達康獸藥有限公司提供(批號20150901)。分別將藥液配制成濃度為0.5g/ml、1g/ml、1.5g/ml、2g/ml、2.5g/ml、3g/ml。

1.2 疫苗和毒株 （1）新城疫IV系疫苗(LaSota株)，批號089042，南京天邦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。（2）新城疫檢測抗原，用新城疫IV系弱毒苗。（3）新城疫強毒株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實驗室提供。

1.3 主要試劑 （1）淋巴細胞分離液，天津灝洋生物制品科技有限公司，批號20090228。（2）植物血凝素(PHA)，Sigma分裝，用RPMI1640培養(yǎng)液配制成0.5mg /ml，0.22um的微孔濾膜過濾除菌，分裝-20℃保存。（3）四甲基偶氮藍(MTT)溶液(Sigma進口分裝)，用pH值7.4的PBS配成成5mg/ml的溶液，0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝，4℃避光保存。裂解液，二甲基亞颯(DMSO)，Sigma分裝。

1.4 動物分組及處理 1日齡非免疫健康羅曼蛋公雞(購自南京湯泉農(nóng)墾種雞場)飼養(yǎng)至23日齡(平均體重161g/羽，平均母源抗體效價3.5Log2)時，取640羽隨機均分為8組，每個組4個重復(fù)，分別為6個不同劑量用藥組、1個疫苗對照和1個空白對照組；另取60羽設(shè)1個疫苗對照組和1個空白對照組，30羽/組，隔離飼養(yǎng)，除2個空白對照組外均用新城疫IV系苗滴鼻、點眼免疫((3羽份/羽)，37日齡二免。在首次免疫的同時，6個用藥組分別飲水添加6種濃度的的歸芪飲，0.5ml/羽，1次/d，連續(xù)3d。(即分別為每羽0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5g生藥量)，然后進行臨床觀察和免疫效果測定。分別于首次免疫后第7(D7)，14(D14)，21(D21)，28(D28)，35(D35)，42(D42)，每組隨機抽取20羽，翼下靜脈采血，分離血清，用β-微量法檢測血凝抑制(Hemagglutination inhibition，HI)抗體效價。于免疫后第2、4、6周各組隨機抽取20只稱取體重，每個重復(fù)5只。自由采食飲水，計算各組平均日增重和料肉比。

1.5 攻毒保護試驗 于首次免疫后第8周用新城疫尿囊液進行人工攻毒。試驗共設(shè)8個組：0.5、l、1.5、2g/ml，4個劑量組(50羽/組)，1個疫苗攻毒對照組(50羽/組)，1個空白攻毒對照組(50羽/組)，1個疫苗對照組(30羽/組)和1個空白對照組(30羽/組)。攻毒劑量為10-7雞胚尿囊液，0.5ml/羽。攻毒后觀察臨床癥狀和病理變化，并比較其嚴重程度，記錄發(fā)病數(shù)、存活數(shù)。待雞群死亡率穩(wěn)定后結(jié)束觀察。

1.6 體外試驗 成年雞無菌采血，分離淋巴細胞，活細胞計數(shù)后，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5x106個/ml，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，80μl/孔，分別加安全濃度范圍內(nèi)5個濃度的歸芪飲溶液100μl，協(xié)同刺激時每孔再加20μl PHA，每個濃度重復(fù)4孔，然后置于38℃，5% CO2條件下培養(yǎng)44h后取出，每孔加MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上清液，每孔加DMSO 100μl，將細胞板置于微量震蕩器上震蕩5min使沉淀完全溶解，檢測其在570nm處吸光度(A570)。

1.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用平均數(shù)士標準差表示，用SPSS軟件比較各組間的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 臨床表現(xiàn) 各濃度組給藥后，未見任何不良反應(yīng)。整個試驗期間，各組雞只精神活潑、采食、飲水和糞便正常，未出現(xiàn)發(fā)病和死亡，未見任何不良反應(yīng)。

2.2 生長性能變化

表1 各組生長性能變化 (g)

注：同列數(shù)據(jù)標注不含相同字母者差異顯著(P<0.05)，下同

表1結(jié)果顯示，0.5、0.75g/羽濃度組的第2、4周體重均顯著高于(P<0.05)疫苗對照和空白對照組。1g/羽劑量組在第4周體重顯著高于(P<0.05)疫苗組和空白對照組。第6周時，第0.5g/羽組體重顯著高于(P<0.05)疫苗對照組。而2、3組體重沒有差異；0.5、0.75濃度組的總的日增重顯著高于(P<0.05)疫苗對照組和空白對照組。0.25、1.25和1.5g/羽總?cè)赵鲋仫@著低于(P<0.05)疫苗對照組；0.5、0.75和1.0g/羽組料重比顯著高于疫苗對照組和空白對照組。所以，0.5、0.75g/羽濃度組均能顯著提高雞體重，降低料重比。但低濃度和最高濃度對生長沒有促進作用，還有一定抑制作用。

2.3 血清抗體效價的變化

表2 各組血清ND-HI抗體效價的變化 (log2)

表2結(jié)果顯示，歸芪飲各劑量組在絕大多數(shù)時間點的抗體效價均高于免疫對照組。0.75g/羽組的抗體效價在所有時間點均顯著高于免疫對照組(P<0.05)，0.5g/羽組在除第7天和第35天外均顯著高于免疫對照組(P<0.05)。1.0g/羽、1.25g/羽和1.5g/羽組的抗體效價在所有時間點均明顯或顯著低于0.75g/羽組，但這三組間則差異不顯著(P>0.05)。首免后第7天，0.75g/羽組的抗體效價最高，顯著高于免疫對照組和其他各方劑組(P<0.05)，其次為1.5g/羽組；第14天，0.5g/羽組的抗體效價最高，顯著高于免疫對照組和其他各方劑組(P<0.05)，其次為0.75g/羽組，顯著高于除1.5g/羽組外的其他各組(P<0.05)；第21天和第28天，0.75g/羽組和0.5g/羽組抗體效價相當(dāng)，顯著高于免疫對照組和其他各方劑組(P<0.05)；第35天和第42天，0.75g/羽組抗體效價最高，顯著高于免疫對照組(P< 0.05)。

2.4 攻毒保護率測定 由表3結(jié)果可以看出，中藥復(fù)方各濃度組的死亡率均低于疫苗攻毒對照組，保護率均高于疫苗攻毒對照組。0.75g/羽組的死亡率最低，保護率最高，其次為0.5、1.0g/羽組，說明該中藥復(fù)方在高、中劑量時能提高機體對新城疫病毒的抵抗力。0.25g/羽組死亡率高，保護率低，說明濃度較低時保護效果較差。

表3 攻毒保護試驗各組死亡數(shù)和死亡率 (羽、%)

2.5 體外試驗結(jié)果

表4 體外最大安全濃度側(cè)定結(jié)果A570值 (ug/ml)

表4結(jié)果顯示，歸芪飲在125~l000μg/ml.時，A570值顯著低于細胞對照組((P<0.05)，在1.95μg/ml時，A570值顯著高于細胞對照組(P<0.05)，在0.98μg/ml，3.91~62.5 μg/ml時，A570值高于細胞對照組，但和細胞對照組差異不顯著(P>0.05)。因此可以將62.5μg/ml作為歸芪飲的最大安全濃度。

表5 歸芪飲單獨和協(xié)同PHA促進T淋巴細胞的增殖作用結(jié)果(A570值)

根據(jù)最大安全濃度測定結(jié)果，進行了歸芪飲對T淋巴細胞的體外刺激試驗。由表5的結(jié)果可以看出，歸芪飲單獨作用時，在3.91~31.25μg/ml時，A570值顯著高于細胞對照組(P<0.05)，說明在3.91~31.25μg/ml時歸芪飲可以顯著促進淋巴細胞增殖。歸芪飲協(xié)同PHA共同作用時，在7.81~62.5μg/ml范圍內(nèi)，A570值高于細胞對照組，但和細胞對照組差異不顯著(P>0.05)，說明在7.81~62.5μg/ml時歸芪飲可能協(xié)同PHA促進淋巴細胞增殖，但其作用不顯著。

3 討論

（1）試驗結(jié)果表明，臨床給藥后，各濃度組未見任何不良反應(yīng)。試驗期間各濃度組雞只精神活潑、采食、飲水和排便正常，未出現(xiàn)發(fā)病和死亡。中濃度組雞只不但未見任何不良反應(yīng)，而且雞的生長最好，體重增加明顯。表明歸芪飲臨床應(yīng)用安全，且在合適的劑量能顯著提高雞只的生長性能。許多試驗研究也表明，中草藥在提高動物生長性能、增強機體免疫力、防治動物疾病等方面具有良好的效果[1-3]。孫永梅等試驗結(jié)果也表明，在日糧中添加黨參、黃芪、甘草等中草藥，可提高飼料效率，提高肉仔雞的生產(chǎn)性能[4]。（2）抗體效價測定結(jié)果顯示，歸芪飲各劑量組在絕大多數(shù)時間點的抗體效價均高于免疫對照組，1、1.5g/ml組的抗體效價最高；攻毒保護試驗結(jié)果也顯示出，歸芪飲在0.75g和1.0g時的保護率較高，表明歸芪飲在合適的劑量能顯著提高新城疫疫苗免疫雛雞的血清抗體效價，提高機體對新城疫病毒的抵抗力。邱妍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，合適劑量的多糖能顯著增強雛雞的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，提高疫苗的免疫力，使抗體產(chǎn)生早、上升速度快、高峰持續(xù)時間長。這個結(jié)果與Wang等[6]報道的中藥有效成分復(fù)方能夠增強免疫雛雞的體液免疫是一致的。本試驗結(jié)果也與這些報道相一致。（3）體外T淋巴細胞增殖結(jié)果顯示，歸芪飲在3.91~62.5μg/ml時對細胞基本無毒害作用。在3.91~31.25μg/ml單獨作用時可以顯著促進淋巴細胞增殖，協(xié)同PHA共同作用時，在7.81~62.5μg/ml范圍內(nèi)可能促進T淋巴細胞增殖。表明歸芪飲在體外有刺激淋巴細胞增殖的效果，可能提高機體的細胞免疫功能。目前已有不少研究報道了黃芪及其活性成分APS具有良好的免疫增強作用。APS等中藥成分在一定濃度既能單獨又能協(xié)同ConA或LPS刺激淋巴細胞增殖[7]。聶小華等[8]的試驗結(jié)果進一步證實了APS對于COnA誘導(dǎo)的脾臟、胸腺T淋巴細胞增殖具有顯著的促進作用。試驗結(jié)果可以表明，歸芪飲能夠顯著增強體液免疫和細胞免疫，提高機體的免疫力和生長性能。

4 結(jié)論

歸芪飲臨床應(yīng)用安全，體內(nèi)增強體液免疫和體外增強細胞免疫的效果確實。體內(nèi)每羽0.5~1g(1~2g/ml濃度組)劑量作用效果都好，從作用效果和用藥成本考慮，推薦0.5g/羽可以作為臨床試驗應(yīng)用的最佳劑量。

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（2017–08–16）

S853.75

A

1007-1733(2017)11-0010-03