褚春旭，孫雪，丁秋雨，李超，于源華

（長春理工大學 生命科學技術(shù)學院，長春 130022）

心肌損傷標志物肌酸激酶同工酶熒光檢測方法的建立

褚春旭，孫雪，丁秋雨，李超，于源華

（長春理工大學 生命科學技術(shù)學院，長春 130022）

肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme，CK-MB）是早期診斷急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的重要標志物，該研究以熒光微球為標記物研究快速、靈敏的CK-MB熒光免疫層析檢測方法。通過N-羥基琥珀酰（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）將熒光微球與市售的抗體共價偶聯(lián)，優(yōu)化抗體與熒光微球的偶聯(lián)條件，對偶聯(lián)獲得的抗體熒光標記物進行表征，制備了CK-MB的熒光免疫層析檢測卡，建立了CK-MB熒光免疫層析檢測方法。熒光微球偶聯(lián)率91.7%，CK-MB檢測卡定量檢測線性范圍為1ng/ml～1000ng/ml，靈敏度達到了1ng/ml，CV值＜8%，回收率84%～108.3%。利用間接ELISA法對市售抗體進行篩選，獲得了包被抗體以及標記抗體，建立了心肌損傷標志物肌酸激酶同工酶熒光檢測方法，實現(xiàn)血清中CK-MB定性與定量檢測，為心肌損傷標志物熒光免疫層析檢測方法的研發(fā)提供了實驗技術(shù)基礎(chǔ)。

心肌損傷標志物；肌酸激酶同工酶；熒光微球；熒光免疫分析法

近年來，由于心肌損傷引起的疾病已經(jīng)嚴重的威脅到了人類生命與健康［1］。心肌損傷標志物CK-MB又稱血清肌酸激酶同工酶，是人體細胞內(nèi)能量的代謝有關(guān)的具有重要作用的酶［2］。CK和CK-MB在監(jiān)測鑒別診斷心肌梗死患者中起重要作用，CK-MB在適當?shù)呐R床環(huán)境中的非典型的上升和下降現(xiàn)象足以證實AMI是否發(fā)生［3］，在急性癥狀入院后4至8小時內(nèi)，血清總CK和血清CK-MB接近其各自的峰值活動。當胸痛發(fā)作時，CK-MB較早出現(xiàn)在血液中，據(jù)此特點CK-MB可以作為早期診斷AMI的標志物［4-5］，同時也可用于檢測心肌梗死的面積以及判斷是否再梗死［6］。

檢測CK-MB的方法有很多，如酶活力測定法、酶聯(lián)免疫（ELISA）定量檢測方法［7］、化學發(fā)光免疫分析檢測法以及床旁快速檢測（POCT）免疫層析檢測法等。酶活力測定法靈敏性不高［8］，ELISA檢測時間長，化學發(fā)光法檢測CK-MB具有特異性強以及靈敏度高的特點將逐漸取代免疫抑制法以及放射性免疫分析法［8-9］，POCT試劑檢測方法操作簡單，檢測時間短且不需要大型的分析檢測儀器，實現(xiàn)了實時現(xiàn)場快速檢測。目前常用的POCT檢測方法中包含膠體金免疫層析檢測法以及量子點、熒光微球等熒光免疫層析檢測法等。膠體金免疫層析可定性或半定量進行檢測，而熒光免疫層析可實現(xiàn)CK-MB的定量檢測。

圖1 試紙條原理圖

熒光免疫層析試紙條或檢測卡由吸水紙、NC膜、釋放墊、樣品墊分別按順序粘在PVC板上，通過裁剪可為試紙條，如圖1所示。熒光微球有微球粒徑均一、形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、實驗重復性好、發(fā)光效率高、單分散性好等特點，并具有環(huán)境變化影響小，生物相容性好等優(yōu)點［11-12］。該研究以熒光微球為標記物，以anti-CK-MB 7502作為標記抗體，利用EDC與NHS作為活化劑來活化微球，促進其與抗體的共價偶聯(lián)。對緩沖液的pH值、共價偶聯(lián)時間與溫度等條件對偶聯(lián)結(jié)果的影響做了詳盡探討，并研制熒光免疫層析檢測卡，其操作簡單，12min即可獲得檢測結(jié)果，靈敏度較高，線性范圍較寬，可實現(xiàn)血清中CK-MB定性與定量檢測［13］。對臨床醫(yī)學快速檢測技術(shù)的發(fā)展具有重要意義［14］。

1 材料與方法

其中，OD0為測量偶聯(lián)前的IgG溶液吸光值；OD1為將偶聯(lián)后的抗體與微球復合物進行離心后上清的OD值；OD2為再將復合物利用緩沖液PB進行清洗，離心后的上清OD值。

設計實驗如表1，按下表所示的條件同時做9組實驗，進行蛋白偶聯(lián)最佳條件的摸索。

1.1 材料與儀器

肌酸激酶同工酶（CK-MB）、CK-MB單克隆抗體anti-CK-MB 7501及anti-CK-MB7502（Medix，芬蘭）、羊抗鼠IgG（上海生工生物工程有限公司，中國）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（Sigma，美國）、熒光微球（Huge，中國）。

小型高速離心機Centrifuge 5427 R（Eppendorf，德國）；熒光免疫層析檢測儀（上海捷寧生物科技有限公司，中國）；三維平面點膜儀（上海金標生物科技有限公司，中國）。

1.2 量子點與抗體偶聯(lián)最佳條件的研究

1.2.1 包被抗體與標記抗體的篩選

將CK-MB抗原配制成2μg/mL每孔100μL，37℃恒溫包被1h；清洗3min，重復3次；CK-MB抗體按 1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000的比例稀釋，每孔100μL，每個濃度做三個重復，37℃孵育1h；洗滌3次，每孔加入100μL HRP-羊抗鼠多抗（1∶3000稀釋），37℃孵育1h；洗滌3次后，加入100μL的TMB應用液反應20min；使用酶標儀測定波長450nm處的吸光度，計算獲得抗體效價。

1.2.2 熒光微球與CK-MB單克隆抗體供價偶聯(lián)及條件優(yōu)化

取10μL的微球用100μL的MES（pH6.0）清洗兩次后重懸超聲；分別取出10μL的0.001M EDC及0.001M NHS加入到清洗后的微球溶液中進行活化；清洗兩次后用PB緩沖液進行重懸超聲；按微球與抗體比為10∶1到5∶1的比例加入抗體蛋白，進行偶聯(lián)；離心留取上清檢測偶聯(lián)率，清洗兩次并重懸超聲后放入4℃?zhèn)溆谩?/p>

測定偶聯(lián)效率的方法是通過檢測偶聯(lián)前和偶聯(lián)后的抗體濃度變化進行偶聯(lián)效率的計算，

表1 不同條件偶聯(lián)率測定

1.2.3 熒光微球與抗體偶聯(lián)表征

將10μL的熒光微球用100μL的MES（pH6.0）緩沖液反復清洗2次；用MES（pH6.0）緩沖液重懸超聲；留一管放入4℃?zhèn)溆?，另一管加入相同比例?M的EDC與NHS各10μL，室溫活化1.5h；反復清洗兩次后，用PB緩沖溶液進行重懸超聲，加入32.5μg/mL的IgG，25℃偶聯(lián)1h。離心后，吸出液體，用PB緩沖溶液進行重懸超聲，反復清洗2次。將兩管樣品用掃描電子顯微鏡檢測分析。

1.3 熒光免疫層析檢測卡制備

利用三維平面點膜儀進行層析卡試劑包被，質(zhì)控線為羊抗鼠多抗，包被濃度1.5mg/mL，檢測線為anti-CK-MB 7501單克隆抗體，包被濃度為1.25mg/mL，包被完成后放入37℃烘箱干燥2h備用。將吸水紙，NC膜，樣品墊及釋放墊依次貼于PVC板上，裁剪寬度4mm，放入密封袋中防潮備用。

1.3.1 檢測時間的確定

組裝試劑卡，每個試劑卡中加入標準品（200ng/ml），利用熒光定量檢測儀每隔2min進行一次檢測，記錄T/C比值，T為檢測線，C為質(zhì)控線。由于標記抗體與包被抗體的量為定值，在層析完成后T線與C線熒光強度也為定值，所以當T/C值趨于固定值時所記錄的時間即為檢測時間。

1.3.2 標準曲線的建立

采用磷酸鹽緩沖液（PBS）將CK-MB標準品分別稀釋為 0ng/mL，1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、625ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL，每組濃度5個重復，采用制備的熒光免疫檢測卡檢測CK-MB標準品，熒光免疫層析檢測儀檢測熒光強度，建立不同濃度CK-MB標準品與熒光強度的線性關(guān)系，確定CK-MB定量檢測靈敏度。

1.3.3 CK-MB試紙條重復性研究

在同樣的條件下，一批制作30個試紙條，分別做3批，加入CK-MB標準品濃度為每毫升25.0、125.0、625.0ng進行檢測，每個濃度樣品重復檢測三次，檢測結(jié)果計算出檢測CV值大小。選用不同批次的檢測卡中，進行相同條件的檢測計算回收率，同時計算其批內(nèi)差和批間差對檢測卡的重復性和穩(wěn)定性進行評價。

1.3.4 CK-MB檢測方法學比較及相關(guān)性測定

通過對市售的膠體金試劑卡的檢測方法進行比較，通過利用檢出抗原濃度做對比。同時將CK-MB標準品按濃度為0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL加入到膠體金檢測卡及CK-MB免疫層析檢測卡進行檢測，每個濃度做3組重復實驗，判斷其檢測相關(guān)性。

1.3.5 CK-MB免疫層析試紙條穩(wěn)定性的研究

研究根據(jù)阿倫尼烏斯經(jīng)驗式，37℃加速熱穩(wěn)定性考察模擬試劑的穩(wěn)定性。將CK-MB免疫層析試紙條在37℃下密封放置7天，使用儀器來檢測并研究試紙條的T線與C線的顯色情況以及靈敏度在第3天和第7天2個時間點來考察試紙條的穩(wěn)定性性。

2 結(jié)果與討論

2.1 包被抗體與標記抗體的確定

通過使用酶標儀測定波長450nm處的OD值檢測，CK-MB兩種抗的效價如圖2，圖3所示。

圖2 anti-CK-MB 7501效價分析

圖3 anti-CK-MB 7502效價分析

最終檢測結(jié)果表明抗體效價anti-CK-MB 7501抗體的效價高于anti-CK-MB 7502抗體的效價，即親和性7501＞7502；由于包被抗體為固定相，所以選擇親和性更好的抗體作為包被用于捕獲抗原，則將anti-CK-MB 7501作為包被抗體，用于捕獲抗原；將anti-CK-MB 7502作為標記抗體，用于提供檢測信號。

2.2 熒光微球與單抗供價偶聯(lián)

2.2.1 最佳偶聯(lián)條件確定

通過對9組實驗結(jié)果的檢測來進行偶聯(lián)條件優(yōu)化，如下表2所示最終確定最佳的偶聯(lián)條件為pH為7.0的緩沖溶液中，抗體終濃度為32.25μg/mL，溫度為25℃，反應1h時為最佳偶聯(lián)條件。

表2 偶聯(lián)效率結(jié)果

2.2.2 熒光微球與抗體偶聯(lián)表征

通過對市售熒光微球掃描電子顯微鏡分析鑒定其粒徑、形狀及分散均勻度。如圖4所示，隨機選取100個粒子，經(jīng)過測量計算得到其平均直徑為145nm，標準偏差為1.00nm，變異系數(shù)為5.78%，顆粒分散均勻呈圓球狀，無聚沉。通過掃描電子顯微鏡進行熒光微球與抗體偶聯(lián)后標記物的表征。如圖5可以看出微球與抗體偶聯(lián)后粒徑明顯增大，證明偶聯(lián)成功并且分散度好，無聚沉現(xiàn)像。

圖4 熒光微球表征

圖5 熒光微球與抗體偶聯(lián)表征

2.3 檢測時間的確定

由于免疫層析過程中液體不斷流動，熒光檢測儀器檢測到的數(shù)據(jù)處于不斷的變化中，當數(shù)據(jù)穩(wěn)定時說明層析完成。此時記錄的時間為最佳檢測時間。如圖6所示，當檢測到12min時，記錄的T/C值趨于平穩(wěn)，最后達到穩(wěn)定值。為了能夠準確的檢測反應時測得的物質(zhì)的含量，將12分鐘定為最快的檢測時間。

圖6 CK-MB檢測時間分析結(jié)果

2.4 CK-MB定量檢測標準曲線及靈敏度

將CK-MB標準品稀釋成1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、 125ng/mL、 625ng/mL、 1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL。每組各制作5個檢測卡，通過熒光免疫層析檢測儀檢測熒光強度計算T/C線的熒光比值，求出算數(shù)平均值，根據(jù)數(shù)據(jù)制作出標準曲線，由標準曲線可知，范圍在1ng/mL到1.0μg/mL時線性關(guān)系良好，R2＞0.99如圖7所示。

圖7 CK-MB標準曲線

圖8 CK-MB標準品溶液不同濃度檢測結(jié)果

當CK-MB的含量剛好達到試紙條的靈敏度時，C線與T線同時顯色。所以當T線剛剛顯色時的檢測的CK-MB的含量即為該試紙條的可檢測的靈敏度。通過對稀釋的不同梯度濃度的CK-MB樣品溶液進行檢測，表明在CK-MB濃度為每毫升0ng～2μg時檢測線呈現(xiàn)明顯的梯度的變化，如圖8所示，CK-MB標準溶液濃度分別為每毫升0.1ng、1ng、5ng、25ng、125ng、625ng、1000ng、1500ng、2000ng。當CK-MB含量大于1.0ng/mL時檢測線無明顯差距變化，即靈敏度1.0ng/mL。線性范圍為當范圍為1ng/mL～1.0μg/mL。當CK-MB濃度小于1.0ng/mL時，此熒光檢測卡檢測不出結(jié)果。

2.5 CK-MB試紙條重復性研究

在同樣的條件下，一批制作30個試紙條，分別做3批，選用不同批次的試紙條對不同濃度的CK-MB標準品，每個條件重復三次，取平均值進行檢測，檢測結(jié)果如表3所示，回收率在84%～108.3%之間，CV值＜8%。結(jié)果顯示批內(nèi)批間重復性較好。

表3 CK-MB試紙條批間批內(nèi)重復性結(jié)果

2.6 CK-MB免疫層析試紙條方法學比較及相關(guān)性測定

由實驗結(jié)果取其中一組圖片如圖9及圖10選可以看出，CK-MB的熒光微球試紙條與市售膠體金試紙條的相關(guān)性較好。檢測結(jié)果都呈梯度顯色。

圖9 CK-MB熒光檢測試紙條檢測結(jié)果

圖10 CK-MB膠體金檢測試紙條檢測結(jié)果

由表4的對比結(jié)果可知，CK-MB膠體金的檢測限為5ng/ml，而CK-MB熒光微球的檢測靈敏度明顯比膠體金的值高。因此，在免疫層析方法中，熒光微球標記制作免疫層析試紙條檢測CK-MB可提高檢測靈敏度。

表4 CK-MB熒光免疫層析試紙條與膠體金方法比較結(jié)果

2.7 CK-MB免疫層析試紙條穩(wěn)定性的研究

試紙條在組裝完后，對其穩(wěn)定性進行測試，在37℃放置7天的檢測結(jié)果顯示，C線與T線顯色正常，初步可以確定試劑檢測卡的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

利用間接ELISA法對市售抗體進行篩選，獲得了包被抗體anti-CK-MB 7501以及標記抗體anti-CK-MB 7502。通過優(yōu)化熒光乳膠微球表面羧基活化條件，使得抗體與微球的偶聯(lián)率達到91.7%，降低了試紙條的制備成本。制備的熒光免疫層析試紙條的檢測范圍為1ng/mL～1.0μg/mL，靈敏度達到了1ng/mL，回收率在84%～108.3%之間，CV值＜8%。與市售的CK-MB膠體金層析檢測試紙條（POCT）相比，范圍較寬，靈敏度強且穩(wěn)定性好。與酶聯(lián)免疫吸附法比，操作簡便，速度快，12min即可完成。因此該研究的CK-MB熒光免疫層析技術(shù)及制備方法可以滿足臨床上的快速定量檢測的需求，為其他心肌損傷標志物如Myo、cTnI等熒光免疫層析技術(shù)及試紙條開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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Quantitative Determination of Creatine Kinase Isoenzyme Damage Markers with Fluorescence Immune Analysis

CHU Chunxu，SUN Xue，DING Qiuyu，LI Chao，YU Yuanhua
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

Objective：creatine kinase isoenzyme （CK-MB） is the early diagnosis of acute myocardial infarction （AMI） isan important marker of the fluorescent microspheres as a marker of rapid and sensitive fluorescence immunochromatographic detection method CK-MB. Methods：the fluorescent microspheres were covalently conjugated to commerciallyavailable antibodies by N-hydroxysuccinyl （NHS） and 1-ethyl-3- （3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride （EDC），Optimizd the coupling conditions between antibody and fluorescent microspheres，characterized the complexes，prepared the fluorescent immunochromatographic assay card for CK-MB，estabilished the CK-MB fluorescence immunochromatographic assay. Results：coupling rate was 91.7%，detection linear range was 1ng/ml～1000ng/ml，sensitivity was 1ng/ml，CV＜8%，recovery rate was 84%～108.3%. Conclusion：the commercially available antibodies were screened by indirect ELISA method，obtained the coated antibody and the labeled antibody，proposed on creatine kinase isoenzyme fluorescence detection of myocardial injury markers，to achieve qualitative and quantitative detection of serum CK-MB，This study provides an experimental basis for the development of fluorescence immunochromatographic assays for myocardial injury markers.

myocardial injury markers；creatine kinase isoenzyme；fluorescent microsphere；fluorescence immunoassay chromatography

R-33

A

1672-9870（2017）05-0119-06

2017-06-22

褚春旭（1992-），女，碩士研究生，E-mail：930981208@qq.com

于源華（1963-），女，博士，教授，E-mail：yuyuanhua8888@126.com