李 玲 呂 磊 呂狄亞 丁德英 朱臻宇*

1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測(cè)試中心，上海 200433; 2.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438

GC-MS法測(cè)定艾葉中5種揮發(fā)性成分的含量

李 玲1呂 磊2呂狄亞1丁德英1朱臻宇1*

1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測(cè)試中心，上海 200433; 2.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438

目的：建立測(cè)定艾葉中桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯、氧化石竹烯5種成分含量的氣相色譜質(zhì)譜方法。方法：艾葉藥材采用正己烷回流提取1h。運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以丁香酚為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)對(duì)艾葉中的5種揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析。色譜條件為Agilent HP-5MS(30m×0.25mm, 0.25μm)氣相色譜柱，采用程序升溫方式；質(zhì)譜采用EI離子源，選擇離子監(jiān)測(cè)模式，溫度250℃。結(jié)果：5種成分分離良好，在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率符合要求。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單快速，可為艾葉的多成分測(cè)定及其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

艾葉；揮發(fā)性成分；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；桉油精；樟腦；龍腦；β-石竹烯；氧化石竹烯

艾葉為菊科植物艾ArtemisiaargyiLevl. et Vant的干燥葉，為歷版《中國(guó)藥典》收載的品種，具有散寒止痛、溫經(jīng)止血的功效[1]。研究表明，艾葉含多糖、黃酮、揮發(fā)油等成分,多糖具有抗菌、抗氧化作用[2]。揮發(fā)油是艾葉的主要有效部位，具有平喘、抑菌等作用[3]，含多種活性成分。如桉油精可用于哮喘、神經(jīng)痛和皮膚病的治療[4-5]；龍腦和樟腦具有相似的生物活性，如鎮(zhèn)痛、抑菌且都具有一定毒性[6]；β-石竹烯及其氧化物具有鎮(zhèn)痛、抗炎，抗氧化等作用[7-8]。從2010年版《中國(guó)藥典》開(kāi)始，艾葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中新增了桉油精的含量測(cè)定，然而中藥是通過(guò)多種成分的協(xié)同作用而發(fā)揮藥效的，對(duì)艾葉的多種成分進(jìn)行定量分析，有利于從整體上把握藥材的質(zhì)量，為艾葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供科學(xué)數(shù)據(jù)。GC-MS具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，適于揮發(fā)油成分的檢測(cè)。因此建立GC-MS同時(shí)測(cè)定艾葉中桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯、氧化石竹烯5種揮發(fā)性成分含量的方法，有利于完善艾葉及其制劑的質(zhì)量控制方法，并為其有效成分的深入研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Thermo fisher Trace GC Ultra amp; DSQII氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(配備Xcalibur工作站，Triplus自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)賽默飛世爾公司)；METTLER AE240型電子天平(瑞士梅特勒公司)；LX-02藥材粉碎機(jī)(上海利祥公司)，水浴鍋PK-824(上海精宏儀器公司)。

1.2 材料 對(duì)照品樟腦(批號(hào)：110747-201008，純度﹥99.0%)、龍腦(批號(hào)：110881-201107，純度﹥99.3%)、桉油精(批號(hào)：72300001，純度﹥98.0%)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；氧化石竹烯(批號(hào)：101180142，純度﹥99.0%)、β-石竹烯(批號(hào)：101278589，純度﹥98.5%)購(gòu)于Sigma公司，內(nèi)標(biāo)物丁香酚(批號(hào)：110725-201213，純度﹥99.7%)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。實(shí)驗(yàn)所用正己烷為色譜純(Fisher, 國(guó)藥試劑公司)。

1.3 樣品來(lái)源 實(shí)驗(yàn)樣品藥材經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室孫蓮娜副教授鑒定確為菊科植物艾ArtemisiaargyiLevl.et Vant的干燥葉，其產(chǎn)地為安徽，批號(hào)分別為20150301、20151003、20151102、20151203，購(gòu)自上海雷允上大藥房。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS條件 色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS(30mm×0.25mm，0.25μm)弱極性毛細(xì)管氣相色譜柱，采用程序升溫方式：起始溫度40℃，以3℃/min的速率升溫至100℃，然后以10℃/min升溫至200℃，并保持7min，進(jìn)樣口溫度200℃，傳輸線溫度250℃，載氣為高純氦氣，流速1.0mL/min-1，進(jìn)樣量1μL。

質(zhì)譜條件：采用EI源，電子能量70ev，溫度250℃，采用全掃描模式獲得混合對(duì)照品溶液的總離子流圖，確定各目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和特征離子；再采用選擇離子監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定量，定量離子分別為：桉油精 m/z=154，樟腦 m/z=95，龍腦 m/z=95，β-石竹烯 m/z=133，氧化石竹烯 m/z=79，丁香酚 m/z=164。

2.2 溶液的配置

2.2.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱(chēng)取桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯、氧化石竹烯適量置于100ml的量瓶，用正己烷溶解，稀釋至刻度，制成含桉油精482.8μg/mL，樟腦53.30μg/mL，龍腦51.35μg/mL，β-石竹烯193.6μg/mL，氧化石竹烯399.6μg/mL的混合溶液，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)丁香酚對(duì)照品適量至10mL棕色量瓶中，以正己烷溶解稀釋成質(zhì)量濃度為 254.2μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液 取粉碎后的艾葉藥材5g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入正己烷50mL，稱(chēng)定重量，水浴加熱回流1h，放冷，再稱(chēng)定重量，用正己烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，精密量取2～10mL量瓶中，加入1mL內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷稀釋至刻度，即為供試品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取合適濃度的混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各1μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果如圖1所示，內(nèi)標(biāo)及溶劑對(duì)目標(biāo)化合物測(cè)定沒(méi)有干擾，專(zhuān)屬性良好。

2.4 檢測(cè)限和定量限 取低濃度的混合對(duì)照品溶液，用正己烷逐級(jí)稀釋?zhuān)葱旁氡?∶1和10∶1分別測(cè)得各成分的最低檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 最低檢測(cè)限和定量限

2.5 線性及范圍 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量至10mL棕色量瓶中，用正己烷稀釋?zhuān)⒕芗尤?mL內(nèi)標(biāo)母液，依次配制成6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液，作為線性工作溶液。按 “2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件，進(jìn)樣1μL，以目標(biāo)化物的濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積比為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示，桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯和氧化石竹烯的質(zhì)量濃度分別在0.9656～96.56μg/mL、0.1066～10.66μg/mL、0.1027～10.27μg/mL、0.3872～38.72μg/mL、0.7992～79.92μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)化合物的線性關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn) 取適當(dāng)濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯、氧化石竹烯峰面積的RSD分別為1.71%、1.53%、1.37%、1.61%，2.75%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品(批號(hào)20151102)6份，按供試品溶液配置方法操作，按2.1項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯、氧化石竹烯含量分別為793.79，88.86、91.24、270.56、758.97μg/g,RSD分別為2.06%、2.38%，3.32%、3.96%、2.75%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取粉碎后的艾葉藥材2.5g(批號(hào)20151102)，精密稱(chēng)定6份，加入一定量的混合對(duì)照品(樣品中各成分含量的100%)，按供試品的制備方法制備加樣回收用的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，分別計(jì)算各目標(biāo)化合物的加樣回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。表明該方法準(zhǔn)確度良好，符合含量測(cè)定的要求。

表3 目標(biāo)化合物加樣回收率試驗(yàn)

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12h后分別按“2.1”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算供試品溶液中桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯、氧化石竹烯含量的RSD分別為3.26%、2.87%、2.71%、3.10%、3.73%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 樣品含量測(cè)定 經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，本含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，能更有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。因此，應(yīng)用該方法測(cè)定4個(gè)批次的樣品，平行操作3份，取平均值，計(jì)算目標(biāo)化物的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 艾葉中桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯、氧化石竹烯含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

研究基于GC-MS建立的分析方法，可同時(shí)測(cè)定艾葉中桉油精、樟腦、龍腦、β-石竹烯、氧化石竹烯含的含量。艾葉的揮發(fā)油成分復(fù)雜，采用GC-MS選擇離子檢測(cè)模式可以有效的排除基質(zhì)和其它揮發(fā)性成分的干擾。參考其他學(xué)者的研究[9-10]并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，實(shí)驗(yàn)分別選取了萘、正十四烷、環(huán)己酮、丁香酚作為待選的內(nèi)標(biāo)物進(jìn)樣分析，綜合考察其分子量、沸點(diǎn)、出峰位置、峰形等因素，結(jié)果顯示，丁香酚的出峰時(shí)間，居于各待測(cè)化合物的中間位置，且供試品溶液在丁香酚的出峰位置上基線平整，沒(méi)有干擾，因此選定丁香酚為最終的內(nèi)標(biāo)物。由于待測(cè)的5種化合物的沸點(diǎn)差別較大，為了盡可能的分離所有的化合物，故選擇了弱極性的毛細(xì)管氣相色譜柱，并采用程序升溫方式，分別考察了氣化溫度，起始溫度，升溫速率，載氣流速等條件，最終確定了該含量測(cè)定的方法。

實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了4個(gè)批次的艾葉樣品，其中的主要成分桉油精的含量都達(dá)到2015年版中國(guó)藥典一部的要求(按干燥品計(jì)算桉油精的含量不得低于0.05%)，但綜合分析測(cè)定結(jié)果，各批次之間的含量不盡相同。其中批號(hào)為20150301的樣品與其它樣品比較，含量明顯偏低，可能是由于該批號(hào)的樣品購(gòu)置時(shí)間較長(zhǎng)、保存不當(dāng)(室溫，密封袋保存)，而導(dǎo)致其中的部分揮發(fā)性成分含量降低，這也從側(cè)面對(duì)中藥材，特別是含揮發(fā)油的中藥材的儲(chǔ)存條件和保質(zhì)期的制定提供了參考依據(jù)。

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Rapid Determination of Five Volatile Components from Artemisiae argyi folium by Gas Chromatography-mass Spectrometry

LI Ling1LV Lei2LV Diya1DING Deying1ZHU Zhenyu1*

1.Pharmaceutical Analysis Center，School of Pharmacy，Second Military Medical University of PLA，Shanghai 200433,China；2.Department of Pharmacy，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital，Shanghai 200438,China

Objiective To establish a rapid method for simultaneous determination of Eucalyptol, Camphor, Borneol, β-Caryophyllene and Caryophyllene oxide fromArtemisiaeargyifolium by gas chromatography-mass spectrometry. MethodsArtemisiaeargyifolium was reflux extracted with n-hexane for 1h. Based on GC-MS, the 5 compounds were simultaneously determined with the internal standard Eugenol．The GC-MS analysis was carried out on Agilent HP-5MS capillary column (30 m×0.25 mm, 0.25μm) with programmed temperature method. Mass spectra were taken with EI source SIM mode and the temperature was 250℃．Results Five volatile components were detected with good separation. They have good linear relationship in their respective concentration range, and the average recovery all meet the requirements. Conclusion The developed method is simple and quick,which can be used as multicomponent determination and provides reference for the quality control of Artemisiae argyi folium．

Artemisiaeargyifolium；Volatile Components；GC-MS；Eucalyptol； Camphor；Borneol；β-Caryophyllene；Caryophyllene Oxide

R285.5

A

1007-8517(2017)20-0027-04

李玲(1984-)，女，漢族，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：316262150@163.com

朱臻宇(1974-)，男，漢族，博士研究生，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榇x組學(xué)研究。E-mail：zzyzyfzhu@126.com

2017-08-30 編輯：穆麗華)