范仕郡，劉 鑫，楊 東，祝元鋒，魯永玲，鄭 江

(第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

經(jīng)驗(yàn)交流

一種易操作的小鼠肝細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法

范仕郡，劉 鑫，楊 東，祝元鋒，魯永玲，鄭 江*

(第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

目的在傳統(tǒng)肝細(xì)胞提取方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化一種易操作、快速實(shí)用獲取小鼠肝細(xì)胞的方法，為從事肝臟功能相關(guān)研究人員提供改良的實(shí)驗(yàn)方法參考。方法以肝臟分離液逆向灌注小鼠肝臟后，剪碎，肝臟酶消化后密度梯度離心分離肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用臺盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活力，流式細(xì)胞檢測技術(shù)計(jì)算純度，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果獲得較高純度和活力的肝細(xì)胞，具備肝細(xì)胞的典型形態(tài)特征。結(jié)論通過逆向灌注，降低了灌注的難度，同時(shí)獲得較高純度、較高活力的肝細(xì)胞，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明該方法確實(shí)是一種易操作、高效適用的肝細(xì)胞提取方法。

C57BL/6J小鼠；肝細(xì)胞；逆向灌注；活力；純度

肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)器官和重要的排毒器官。在人體中擔(dān)負(fù)著去氧化、存儲(chǔ)肝糖、合成分泌性蛋白質(zhì)等重要作用。同時(shí)也是消化系統(tǒng)中重要的消化腺。它可以制造膽汁來幫助食物的消化，也是尿素合成的主要臟器，更是新陳代謝的重要器官[1]。因此，肝臟對于人體的重要作用不言而喻。肝臟細(xì)胞主要由肝細(xì)胞(hepatocytes，HC)、枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KC)、肝星形細(xì)胞(liver stellate cells，HSC)和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSEC)構(gòu)成，肝細(xì)胞占肝臟細(xì)胞80%以上[2]。其作用主要表現(xiàn)在合成凝血因子和多種消化酶以及膽汁、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、代謝儲(chǔ)能、清除毒素等方面。肝細(xì)胞形態(tài)為多角形，直徑約幾十微米級，具有六至八個(gè)面。不同的生理?xiàng)l件下肝細(xì)胞大小有差異，在饑餓時(shí)肝細(xì)胞體積變大。每個(gè)肝細(xì)胞表面可分為竇狀隙面、肝細(xì)胞面和膽小管面三種。肝細(xì)胞里面含有非常多復(fù)雜的細(xì)微結(jié)構(gòu)：如肝細(xì)胞核、肝細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成[3]。然而，在實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞株并不能滿足所有的研究需求。本文主要是提供一種實(shí)用的肝細(xì)胞提取方式，為從事病毒性肝炎、肝硬化和肝癌方面。以及少數(shù)從事肝臟的遺傳性代謝疾病、免疫性肝病、藥物和化學(xué)中毒性肝病、肝血管性疾病等研究者提供一些參考。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級10周齡C57BL/6J雄性小鼠2只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [SCXK (京) 2014-0004]。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，小鼠手術(shù)及取材過程均在第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行 [SYXK (渝) 2017-0011]，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

VS-1300L-U型潔凈工作臺(中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；1300系列A2生物安全柜(美國Thermo公司)；倒置BDS200-P型顯微鏡(中國重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Harvard 2000型精密注射泵(美國Harvard公司)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；ST-40R臺式離心機(jī)(美國Thermo公司)；Nano Drop 2000分光光度計(jì)(美國Thermo公司)；CPA2250型電子天平(德國Sartorius公司)；蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；ChemiDocTMXRS+超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Bio-Rad公司)；微量移液器(美國Millipore公司)；Zeiss LSM 780激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；MS分離柱及MACS分離器(德國Milternyi Biotec公司)；漩渦振蕩器(中國上海科學(xué)儀器廠)；電熱恒溫水浴箱(中國上?？茖W(xué)儀器廠)。

60 mL注射器，靜脈輸液針(規(guī)格0.7 mm)，注射器針頭，無菌大玻璃平皿，吸耳球，無菌10 mL玻璃吸管，無菌15 mL離心管，無菌1.5 mL離心管，無菌50 mL離心管，眼科手術(shù)剪，眼科鑷(平口及有齒)，酒精燈，止血鉗，小動(dòng)脈夾，微量移液器(規(guī)格1000 μL)。

1.2.1 肝細(xì)胞分離液I

D-Hank’s平衡溶液(不含鈣、鎂離子)250 mL為基礎(chǔ)液，加入EDTA 46.5 mg和葡萄糖250 mg，振蕩溶解后，經(jīng)0.22 μm超濾，轉(zhuǎn)入50 mL無菌離心管分裝。

1.2.2 肝細(xì)胞分離液II

Hank’s平衡溶液(含鈣、鎂離子)250 mL為基礎(chǔ)液，加入葡萄糖250 mg、HEPES 1191.5 mg和IV膠原酶40 mg，振蕩溶解后，經(jīng)0.22 μm超濾，轉(zhuǎn)入50 mL無菌離心管分裝。

1.2.3 肝細(xì)胞分離液III

Hank’s平衡溶液(含鈣、鎂離子)250 mL為基礎(chǔ)液，加入輔助試劑葡萄糖250 mg、HEPES 1191.5 mg、IV膠原酶40 mg和DNase I 2.5 mg，振蕩溶解后，經(jīng)0.22 μm超濾，轉(zhuǎn)入50 mL無菌離心管分裝。

1.2.4 肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液

取100 mL PBS溶液，加入1 g BSA，振蕩溶解后，經(jīng)0.22 μm超濾，轉(zhuǎn)入50 mL無菌離心管分裝。

1.2.5 密度梯度離心液(10% OptiPrep)

無菌生理鹽水(V/V=4∶2)，即取4 mL OptiPrepTM加入2 mL無菌生理鹽水，配成6 mL WS工作液，充分混勻，4℃避光，備用；配置5 mL的10% OptiPrep，即精確吸取1.25 mL WS工作液加入3.75 mL無菌生理鹽水，至15 mL無菌離心管內(nèi)混勻，4℃避光保存。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠肝臟的原位灌洗

用60 mL注射器吸取已預(yù)溫至37℃的原代肝細(xì)胞分離液I并連接好靜脈輸液針與注射器，并將注射器固定在注射泵插槽內(nèi)，白熾手術(shù)燈距其約20 cm加熱，進(jìn)行保溫。將預(yù)凍冰袋置于不銹鋼托盤上。小鼠經(jīng)脫臼處死后，立即用注射器針頭固定四肢置于不銹鋼托盤的冰袋上，用75%乙醇消毒腹部皮膚，“U”形切口剪開小鼠腹部、胸，并沿胸廓外沿剪開，完全剪開隔肌，暴露胸、腹器官，并可視心臟下腔靜脈，用平口鑷將腹部臟器向右外側(cè)牽拉，暴露并識別肝門靜脈。第一步灌洗，用止血鉗結(jié)扎小鼠肝前靜脈及心臟下腔靜脈后，用靜脈輸液針穿刺肝后靜脈，進(jìn)入約5 mm，并同時(shí)用小動(dòng)脈夾固定穿刺入針頭前端約3 mm位置，剪開肝門靜脈，隨后開始灌注肝細(xì)胞分離液I，設(shè)定流速為6 mL/min，灌注體積為20 mL/只，灌流方向從肝后靜脈進(jìn)入，從肝門靜脈流出，行逆行灌注；可見肝門靜脈缺口有大量血液流出(如圖1A)，并逐漸減少，肝臟完全變?yōu)橥粱疑?。第二步灌洗，待第一步灌洗結(jié)束后，隨即改用已預(yù)溫至37℃的原代肝細(xì)胞分離液II進(jìn)行灌洗，設(shè)定流速為3 mL/min，灌注體積為20 mL/只，可見肝門靜脈缺口已無血液流出，液體清亮，肝臟逐漸變?yōu)橥咙S色(如圖1B，體積明顯膨脹，用平口鑷輕觸肝臟表面可見不可復(fù)原小坑出現(xiàn)[4, 5]。

注：A：第一步灌洗開始；B：第二步灌洗結(jié)束。圖1 小鼠肝臟原位灌洗示意圖Note. A: Beginning of the first perfusion; B: Ending of the second perfusion.Fig.1 In situ liver perfusion of a mouse

1.3.2 小鼠肝臟的酶消化

用眼科手術(shù)剪無菌剝離全肝(去除膽囊部分)，經(jīng)4℃，含1% FBS的無菌PBS溶液漂洗后，迅速轉(zhuǎn)至盛有已預(yù)熱至37℃的肝細(xì)胞分離液III的15 mL大玻璃平皿；將小鼠肝臟經(jīng)眼科剪剪至大小1 mm3后轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋消化15 min；立即向每個(gè)肝臟加入5 mL DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)混勻，中止酶消化。

1.3.3 單細(xì)胞懸液的制備

消化處理后的肝組織懸液經(jīng)100 μm細(xì)胞濾器過濾后，再經(jīng)4℃的肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液補(bǔ)充體積至30 mL，4℃，750 r/min，5 min離心；吸棄上清，再加入5 mL肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液，4℃，750 r/min，3 min離心，洗滌2次，目視上清無明顯渾濁出現(xiàn)。

1.3.4 肝細(xì)胞的密度梯度離心分離

沿管壁加入5 mL 10% OptiPrep，用微量移液器吹打至獲得的細(xì)胞沉渣均勻分布，轉(zhuǎn)移至無菌15 mL離心管內(nèi)；再在上層加入5 mL肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液，不混勻，標(biāo)記并立即進(jìn)行4℃，750 r/min，10 min離心，吸棄上清后，再加入肝細(xì)胞分離用洗滌緩沖液2 mL，4℃，750 r/min，2 min離心洗滌，獲得肝細(xì)胞。

1.3.5 原代肝細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)

向獲得的肝細(xì)胞沉淀中加入1 mL DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)后，混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，按接種密度為2 × 105個(gè)/mL立即接種于預(yù)包被有大鼠鼠尾膠蛋白的六孔板或細(xì)胞培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿所加培養(yǎng)基以視培養(yǎng)基厚度為1.6～1.8 mm為準(zhǔn)，于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后細(xì)胞貼壁，吸棄上清，加入1 mL DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)小心洗滌未貼壁細(xì)胞，再加入DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)，37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(如圖2)。

圖2 肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h后形態(tài)(× 40)Fig.2 Morphology of hepatocytes after culture for 24 h

1.3.6 TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算

分離后獲得的肝細(xì)胞純度檢測采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)，對FITC標(biāo)記細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18)抗體(FITC-At18)標(biāo)記的肝細(xì)胞進(jìn)行分析，即分離后的肝細(xì)胞懸液約100 μL，分別加入2支無菌15 mL離心管內(nèi)，標(biāo)記為陰性對照(negative control，NC)管和FITC-At18標(biāo)記的肝細(xì)胞(FITC-At18-HC)管，再分別加入1 mL 4%多聚甲醛，4℃，避光固定15 min后，分別加入1 mL PBS溶液，混勻，4℃，750 r/min，3 min離心，如此洗滌3次；加入3% BSA，4℃，封閉30 min后，4℃，750 r/min，3 min離心，吸棄上清，再加入500 μL按FITC標(biāo)記抗細(xì)胞角蛋白18抗體原液: 3% BSA(V/V)=1∶300稀釋后的抗體，4℃，避光過夜孵育；次日，每次以1 mL PBS溶液進(jìn)行洗滌，4℃，750 r/min，3 min離心，洗滌3次，再加入200 μL PBS溶液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.7 原代肝細(xì)胞的活力分析

分離肝細(xì)胞的活力分析(臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn))：取0.2 mL 4%臺盼藍(lán)母液，加入1.8 mL PBS溶液中，稀釋為0.4%作為臺盼藍(lán)工作液。取分離后的原代肝細(xì)胞懸液約100 μL加入1支無菌1.5 mL離心管內(nèi)，加入0.9 mL 0.4%臺盼藍(lán)工作液，3 min染色后，利用TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)未被染色的細(xì)胞數(shù)，得活細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞率。

2 結(jié)果

2.1純度分析

通過TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算，細(xì)胞濃度為5.95 × 105個(gè)/mL；從檢測結(jié)果來看，紅色為NC組，藍(lán)色為FITC-At18-HC組，測得FITC-At18-HC組陽性細(xì)胞百分比為91.3%，表明初次分離獲得原代肝細(xì)胞純度為91.3%(見圖3)。

圖3 分離肝細(xì)胞的純度測定Fig.3 Purity analysis of the isolated hepatocytes

2.2活力分析

通過臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)，測得初次分離的原代肝細(xì)胞在未貼壁培養(yǎng)前的存活率為90.5%(見圖4)。

圖4 臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞活力(× 40)Fig.4 Cell viability determined by trypan blue exclusion test

3 討論

肝臟是生理和病理狀態(tài)下能量代謝、毒素的生物轉(zhuǎn)化以及血漿蛋白合成的中心器官，是機(jī)體最重要的器官之一[6]。肝細(xì)胞培養(yǎng)體系可以很好地模擬體內(nèi)肝臟生理環(huán)境，作為研究肝特異代謝過程和肝臟功能的重要工具，被廣泛用于毒理學(xué)和藥理學(xué)的研究[7, 8]。因此，建立和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝細(xì)胞的提取方法具有重要意義。

從實(shí)驗(yàn)對象來看，目前常規(guī)的肝細(xì)胞提取操作大多在大鼠中開展。主要原因是大鼠體型相對較大，且實(shí)驗(yàn)易操作，獲取的肝細(xì)胞產(chǎn)量較高。然而目前大多數(shù)基因敲除或轉(zhuǎn)基因模型均在小鼠中建立，因此優(yōu)化小鼠肝細(xì)胞提取技術(shù)對開展生命科學(xué)相關(guān)研究更具意義。從操作流程來看，常規(guī)肝細(xì)胞提取主要采用膠原酶浸泡的方法消化組織。該方法雖然操作簡單(無需灌注)，但是浸泡消化的時(shí)間和強(qiáng)度不易掌握，得到的肝細(xì)胞質(zhì)量不好(活力一般低于80%)[9]，不能滿足有些實(shí)驗(yàn)的需求。因此本研究選擇了操作復(fù)雜但效果更好的酶灌注消化法。灌流在肝細(xì)胞提取中又是非常重要的環(huán)節(jié)，直接決定實(shí)驗(yàn)所獲取細(xì)胞的質(zhì)量。在實(shí)際操作中我們發(fā)現(xiàn)，小鼠門靜脈非常細(xì)小，不易穿刺。經(jīng)過多次摸索，我們在兩步灌洗法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化出一種更易操作的方法，即采用下腔靜脈進(jìn)、門靜脈出的方式。下腔靜脈相對門靜脈更粗，因此方便穿刺操作。該改良方法相對降低了實(shí)驗(yàn)的操作難度，降低了對實(shí)驗(yàn)材料的要求(常見的靜脈輸液針即可滿足需求)。同時(shí)經(jīng)改法獲得的肝細(xì)胞純度和活力均在90%以上，能夠滿足大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)需求。在實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)，該方法的主要不足之處在于灌流液體可從門靜脈流出，因而增大了細(xì)胞污染的幾率，故要求實(shí)驗(yàn)者在操作時(shí)應(yīng)小心謹(jǐn)慎。課題組在傳統(tǒng)肝細(xì)胞提取方法的基礎(chǔ)上，改變了灌流方式，得到了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為從事相關(guān)研究者提供參考。同時(shí)，建立和完善肝細(xì)胞長期培養(yǎng)技術(shù)將為人工生物肝臟研究及其臨床應(yīng)用提供技術(shù)參考，具有重要意義。

[1] Strnad P, Tacke F, Koch A, et al. Liver—guardian, modifier and target of sepsis [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017, 14(1): 55-66.

[2] 楊東, 劉鑫, 鄭新川, 等. 小鼠肝臟細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展 [J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2015, 44(34): 4851-4854.

[3] Ueno T, Komatsu M. Autophagy in the liver: functions in health and disease [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017, 14(3): 170-184.

[4] 彭齊榮, 袁愛力, 賴卓勝, 等. 肝細(xì)胞的大量制備技術(shù) [J]. 中華肝臟病雜志, 1999, 7(4): 246.

[5] 劉學(xué)忠, 李慧敏, 王富民, 等. 大鼠肝細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)的簡易方法 [J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 25(1): 222-224.

[6] Liu W, Hou Y, Chen H, et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies [J]. Proteomics, 2011, 11(17): 3556-3564.

[7] Vinken M, Maes M, Oliveira AG, et al. Primary hepatocytes and their cultures in liver apoptosis research [J]. Arch Toxicol. 2014, 88(2): 199-212.

[8] Shulman M, Nahmias Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes [J]. Methods Mol Biol, 2013, 945: 287-302.

[9] 王琳, 徐建波, 田元, 等. 一種分離新生小鼠肝細(xì)胞的簡單方法 [J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2007, 15(1): 10-12.

Asimplifiedmethodforisolationandcultureofprimarymousehepatocytes

FAN Shi-jun， LIU Xin， YANG Dong， ZHU Yuan-feng， LU Yong-ling， ZHENG Jiang*

(Medical Research Center, First Affiliated Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

ObjectiveTo simplify and optimize the method for isolation and culture of primary mouse hepatocytes on the basis of conventional extraction method, and to provide a reference for related research.MethodsMouse liver was reversely perfused with the isolation solution (i.e., through the vena cava inferior in, and portal vein out), cut into small pieces and digested with enzymes. Then the hepatocytes were isolated by density gradient centrifugation and transferred into culture medium. The cell viability was detected by trypan blue staining. The purity of the hepatocytes was analyzed by flow cytometry and the cell morphology was observed with an inverted microscope.ResultsThe hepatocytes obtained by this improved method showed high viability and purity, with typical characteristics of cell morphology.ConclusionsThe liver perfusion is facilitated by reversed perfusion, and the isolated hepatocytes are with high viability and purity confirmed by many times of experiments. This optimized procedure is an easy and efficient method for isolation of primary mouse hepatocytes.

C57BL/6J mice; Hepatocytes; Reversed perfusion; Viability; Purity

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81372089)。

范仕郡(1983 -)，男，助理研究員，研究方向：膿毒癥的發(fā)病機(jī)制與拮抗措施研究。E-mail: 574472439@qq.com

鄭江(1961 -)，男，研究員，研究方向：膿毒癥的發(fā)病機(jī)制與拮抗措施研究。E-mail: zhengj@tmmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0075-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.015

2017-03-20