吳金生，鄭傳秋，王清明，紀(jì) 萌，孫立江*

(1.青島大學(xué)，山東 青島 266071； 2.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

卡介苗對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞及代謝產(chǎn)物的作用影響

吳金生1，鄭傳秋2，王清明2，紀(jì) 萌2，孫立江1*

(1.青島大學(xué)，山東 青島 266071； 2.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

目的探究 卡介苗對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞及代謝產(chǎn)物的作用和影響，對(duì)卡介苗治療膀胱腫瘤細(xì)胞的可能機(jī)制進(jìn)行初步的探索。方法通過(guò)膀胱灌注N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)并建立大鼠的膀胱腫瘤模型，將膀胱腫瘤細(xì)胞和正常移行上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。按照培養(yǎng)液的不同成分將其分為5組，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)的濃度。利用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定卡介苗抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度。利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果在灌注的15只大鼠中，2只大鼠在灌注2次后死亡，3只大鼠灌注3次后死亡，解剖死亡大鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤。再對(duì)其余10只大鼠完成膀胱灌注后，其中8只大鼠解剖后發(fā)現(xiàn)有明顯的腫瘤。MTT結(jié)果顯示：卡介苗對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，其抑制率與卡介苗的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α濃度在B組為(160.654±5.775) ng/L，D組為(124.443±4.972) ng/L的濃度，與其他三組相比差異有顯著性；IL-10濃度在B組為(16.973±3.428) ng/L，E組為(20.327±2.721) ng/L，蛋白水平明顯高于其他三組。各組細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。對(duì)原代膀胱腫瘤細(xì)胞的鑒定顯示：利用HE染色可發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核體積增大，核漿比增高，有的可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核仁數(shù)目增加，有的細(xì)胞核呈現(xiàn)墨水滴樣，核仁比較明顯。結(jié)論卡介苗對(duì)大鼠膀胱腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)具有抑制作用，沒有發(fā)生細(xì)胞凋亡，且腫瘤細(xì)胞自身分泌的IL-10、TNF-α可以參與調(diào)節(jié)。

卡介苗；膀胱腫瘤細(xì)胞；IL-10；TNF-α

膀胱癌發(fā)病率在全部腫瘤發(fā)病率中占到第八位，是位居第二的男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，僅次于前列腺癌，占全部惡性腫瘤的3.2%。在我國(guó)，膀胱癌在男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中，其發(fā)病率和死亡率均居首位，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命身體健康[1],且膀胱腫瘤具有高復(fù)發(fā)性。大量研究證實(shí)膀胱惡性腫瘤術(shù)后給予藥物膀胱灌注治療可以有效降低膀胱惡性腫瘤的復(fù)發(fā)率；而卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)在目前所有的膀胱癌灌注藥物中被認(rèn)為是術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)的最佳藥物之一?？ń槊缈梢允鼓[瘤復(fù)發(fā)率降低20% ～ 65%，平均可達(dá)40%左右。國(guó)際上的一些專家將卡介苗膀胱灌注治療稱為原位癌灌注治療中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是卡介苗對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制尚不明確[2]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪且骄靠ń槊鐚?duì)膀胱腫瘤細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物的作用影響。通過(guò)N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)并建立了大鼠膀胱腫瘤模型，將膀胱腫瘤細(xì)胞和正常移行上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，按照培養(yǎng)液的不同成分將其分為5組，然后運(yùn)用各種檢測(cè)方法測(cè)定各種指標(biāo)的濃度，以此來(lái)了解卡介苗對(duì)腫瘤細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的作用和影響，從而進(jìn)一步探索卡介苗對(duì)治療腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性8周齡大鼠15只，體重190 ～ 210 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供 [SCXK (魯) 2014-0007]，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

卡介苗(BCG)(賽諾菲巴斯德，法國(guó))；N-甲基亞硝基脲(MNU)(Sigma，美國(guó))；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma，美國(guó))；噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma，美國(guó))；Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶(Sigma，美國(guó))；1640培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；PBS(北京索萊寶科技有限公司，中國(guó))；大鼠TNF-α ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司，中國(guó))；大鼠IL-10 ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司，中國(guó))。

大鼠膀胱癌細(xì)胞株BIU-87(購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù))、0.25%胰蛋白酶、MTT溶液(5 mL/mL)，封閉液、固定液、通透液和工作液等，需新鮮配制。

倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(Olympus，日本)；超凈工作臺(tái)(大連瑞欣公司，中國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Blnder，德國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))；低溫離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；電子天平(Sartorius，德國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)，在常規(guī)麻醉、消毒和導(dǎo)尿后，對(duì)大鼠進(jìn)行膀胱灌注濃度為20 mg/mL的MNU溶液，每只大鼠每次灌注2 mg MNU溶液，每?jī)芍苓M(jìn)行一次，一共四次[3]。對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離獲取和原代培養(yǎng)，并按照其培養(yǎng)液的成分分為5組。使用含10%胎牛血清的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞為A組，使用含有卡介苗+基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞為B組，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)正常移行上皮細(xì)胞后的上清液培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞為C組，使用含卡介苗+基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)正常移行上皮細(xì)胞后的上清液培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞為D組，使用含卡介苗+基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞后的上清液培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞為E組(陰性對(duì)照組為A組和C組)。利用MTT法測(cè)定不同濃度卡介苗影響大鼠膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，利用ELISA法[4]檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α和IL-10的濃度，最后利用TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)[5]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Tab.1Concentrations of IL-10 and TNF-α in the supernatant of each group

組別GroupsIL-10濃度ConcentrationofIL-10TNF-α濃度ConcentrationofTNF-αA組GroupA10.486±1.623*△△29.653±2.676B組GroupB16.973±3.428160.654±5.775△△▲▲※※C組GroupC10.479±1.807*△△25.687±2.143D組GroupD10.975±2.749*△△124.443±4.972△△▲▲※※E組GroupE20.327±2.72150.119±3.317▲▲※※

注：與B組相比，*P< 0.05；與E組相比，△△P< 0.01；與A組相比，▲▲P< 0.01；與C組相比，※※P< 0.01。

Note. Compared with group B,*P< 0.05; Compared with group E,△△P< 0.01; Compared with group A,▲▲P< 0.01; Compared with group C,※※P< 0.01.

2 結(jié)果

2.1建立大鼠膀胱腫瘤細(xì)胞模型，原代細(xì)胞培養(yǎng)

在灌注的15只大鼠中，2只大鼠在灌注2次后死亡，3只大鼠灌注3次后死亡，解剖死亡大鼠均未發(fā)現(xiàn)有明顯的腫瘤。對(duì)其余10只大鼠完成膀胱灌注后，其中有8只大鼠在解剖后發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤，肉眼可見膀胱壁黏膜充血，局部有米粒樣或乳頭樣腫物；顯微鏡下可見膀胱上皮細(xì)胞層次增多，排列紊亂。

2.2MTT檢測(cè)卡介苗對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

由各孔的吸光度來(lái)計(jì)算腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(見圖1)。MTT檢測(cè)的結(jié)果顯示，卡介苗可以有效地抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且其抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)。在低濃度時(shí)(0.0625 mg/L)時(shí)抑制能力較弱，當(dāng)藥物濃度≥ 0.5 mg/L時(shí)呈現(xiàn)明顯的抑制作用(P< 0.01)。

圖1 卡介苗不同濃度對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of BCG at different concentrations on the growth of bladder cancer cells

2.3利用ELISA法檢測(cè)IL-10和TNF-α的濃度

在IL-10濃度的比較中，B組與A、C、D組相比差異有顯著性(P< 0.05)，E組與A、C、D組相比差異有顯著性(P< 0.01)。見表1。

在TNF-α濃度的比較中，含有卡介苗的組(B、D、E組)和不含卡介苗的組(A、C組)間的比較，其差異有顯著性(P< 0.01)；不含卡介苗的A組和C組相比，差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。此外，TNF-α濃度在B組為(160.654 ± 5.775) ng/L，D組為(124.443 ± 4.972) ng/L的濃度，與A、C、E組相比差異有顯著性(P< 0.01)。見表1。

2.4顯微鏡下觀察細(xì)胞情況

顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況顯示，原代培養(yǎng)的大鼠正常移行上皮細(xì)胞貼壁，呈上皮細(xì)胞樣多形性生長(zhǎng)；原代培養(yǎng)的大鼠腫瘤細(xì)胞體積大，呈鋪路石樣，細(xì)胞核仁明顯；卡介苗作用后的腫瘤細(xì)胞體積縮小，胞漿有空泡；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂、溶解，呈凋亡現(xiàn)象。見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，卡介苗作用后膀胱腫瘤細(xì)胞增殖速度減慢。

注：A：大鼠原代培養(yǎng)正常移行上皮細(xì)胞(× 100)；B：大鼠原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞(× 200); C：卡介苗作用后的腫瘤細(xì)胞(× 200)；D：TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(× 400)。圖2 細(xì)胞培養(yǎng)圖Note. A: Primarily cultured normal transitional epithelial cells of rats (× 100); B: Primarily cultured tumor cells of rats (× 200); C: Tumor cells after BCG treatment (× 200); D: TUNEL detection of apoptosis (× 400).Fig.2 Images of cultured cells

3 討論

目前，膀胱腫瘤手術(shù)后輔助以膀胱灌注的治療方法成為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的主要措施?？ń槊缭谀壳八械陌螂装┕嘧⒒熕幬镏斜徽J(rèn)為是術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)的最佳藥物之一，它在淺表性膀胱腫瘤免疫治療中的應(yīng)用取得了重大的成功[6-10]。但是，膀胱腫瘤的發(fā)病機(jī)制和膀胱灌注治療的作用機(jī)制尚不明確實(shí)驗(yàn)證明，利用MNU膀胱灌注誘發(fā)膀胱腫瘤建立動(dòng)物模型，方法較為簡(jiǎn)單。在前期研究中具有可操作性和實(shí)用性，且成癌率較高[4,11]。目前普遍認(rèn)為卡介苗作用于膀胱腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制主要在于其自身的結(jié)構(gòu)，還有它對(duì)樹突狀細(xì)胞的獨(dú)特作用?？ń槊缤ㄟ^(guò)激發(fā)機(jī)體免疫力來(lái)達(dá)到抵抗腫瘤的作用，至今醫(yī)學(xué)界一致認(rèn)為是通過(guò)CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫發(fā)揮了它抵抗腫瘤細(xì)胞的作用。

MMT結(jié)果顯示，卡介苗對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且和它的濃度呈正相關(guān)。在對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液的檢測(cè)中可以發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IF-10均發(fā)生改變，這說(shuō)明了卡介苗不僅激發(fā)了機(jī)體的免疫細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)了免疫能力，而且還使自身產(chǎn)生細(xì)胞因子避免了進(jìn)一步的傷害。在卡介苗初次刺激膀胱腫瘤細(xì)胞之后，IL-10的濃度明顯增大(B組)。再一次卡介苗刺激后，E組的IL-10濃度比B組增高。但是，當(dāng)含有卡介苗成分的細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液再次刺激腫瘤細(xì)胞時(shí)，其IL-10濃度卻沒有發(fā)生改變。這說(shuō)明卡介苗初次作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，可以產(chǎn)生IL-10。如果使用其代謝產(chǎn)物再次刺激腫瘤細(xì)胞，則能夠產(chǎn)生更多的IL-10。在TNF-α的濃度變化方面，當(dāng)卡介苗初次刺激腫瘤細(xì)胞時(shí)能產(chǎn)生大量的TNF-α，而再次刺激腫瘤細(xì)胞卻不能產(chǎn)生TNF-α，這可能是其代謝產(chǎn)物抑制了TNF-α的產(chǎn)生，甚至抵消第一次產(chǎn)生的TNF-α。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在單一因素卡介苗條件下，腫瘤細(xì)胞自身會(huì)通過(guò)分泌不同的細(xì)胞因子，避開免疫細(xì)胞的傷害。

綜上所述，卡介苗對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，通過(guò)抑制增殖活躍的腫瘤細(xì)胞，使其發(fā)生病理性壞死，且隨卡介苗藥物濃度的增加，其抑制作用也越來(lái)越強(qiáng)，可能打破腫瘤生長(zhǎng)平衡的體液環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞縮小或延緩腫瘤生長(zhǎng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。

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EffectofBCGonbladdercancercellsandtheirmetabolitesinrats

WU Jin-sheng1， ZHENG Chuan-qiu2， WANG Qing-ming2， JI Meng2， SUN Li-jiang1 *

(Qingdao University, Qingdao 266071, China； 2. Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo investigate the effect of bacillus Calmette-Guérin (BCG) on bladder cancer cells and their metabolites, and to preliminarily explore the possible mechanisms of BCG in the treatment of bladder cancer.MethodsThe rat model of bladder cancer was induced by intravesical instillation with N-methylnitrosourea (MNU). Bladder cancer cells and normal transitional epithelial cells were isolated and primarily cultured, and were divided into 5 groups according to the different components of the culture medium. The concentration of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-10 (IL-10) in the supernatant of each group was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The concentration of BCG to inhibit the cancer cell growth was determined by MTT assay. Apoptosis of bladder cancer cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL).ResultsAmong the 15 rats, 2 rats died after 2 times of instillation, and 3 rats died after 3 times of instillation, without obvious tumors found at autopsy. The other 10 rats were killed after completion of the intravesically instillation of MNU, and obvious tumors were found in 8 of them after dissection. The results of MTT assay showed that BCG had an inhibitory effect on the growth of bladder cancer cells, and the inhibitory rate was positively correlated with the concentration of BCG. The results of ELISA showed that the concentrations of TNF-α in the supernatant of groups B and D were (160.654±5.775) ng/L and (124.443±4.972) ng/L, respectively, with significant differences from those of the other three groups. The concentrations of IL-10 in the groups B and E were (16.973±3.428) ng/L and (20.327±2.721) ng/L, significantly higher than those of the other three groups. Apoptosis of cancer cells was not found in all groups. HE staining of the primary bladder cancer cells showed that the volume of cell nucleus was increased, and the nucleo-cytoplasmic ratio was increased. The number of nucleoli in some cells was increased and some nuclei appeared like ink drops with prominent nucleoli.ConclusionsBCG has an inhibitory effect on the growth of rat bladder cancer cells. IL-10 and TNF-α secreted by the tumor cells might be involved in this regulatory process. However, apoptosis does not show an obvious effect on this inhibitory process.

Bacillus Calmette-Guérin, BCG; Bladder cancer cells; IL-10; TNF-α

吳金生(1975 -)，男，副教授，青島大學(xué)在職博士研究生。E-mail: wjswfmc@163.com

孫立江(1963 -)，男，教授。E-mail: slijiangqd@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0056-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.011

2017-05-10