沈 琪，王 梅，康金森

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

沙棘油對小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎的治療作用

沈 琪，王 梅*，康金森

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

目的研究沙棘油對小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)的治療作用。方法60只ICR小鼠隨機(jī)分為6組：空白對照組、模型對照組、高中低3個劑量沙棘油外用組(100%，50%和25%)及陽性藥對照組(復(fù)方醋酸地塞米松乳膏)，每組10只。以2,4-二硝基氯苯(DNCB)致敏和激發(fā)建立小鼠ACD模型，耳部皮損情況評分作為模型建立成功與否的指標(biāo)，在激發(fā)后48 h測定各試驗組小鼠的耳廓腫脹度和脾指數(shù)，并以蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色觀察小鼠耳部皮膚炎性細(xì)胞浸潤等病理變化情況。結(jié)果小鼠耳腫脹度測定結(jié)果表明沙棘油高劑量組(9 mL/kg，外用)可明顯抑制DNCB誘發(fā)的小鼠耳廓腫脹，與模型組比較差異有顯著性(P< 0.01)，與陽性對照組比較差異無顯著性(P> 0.05)，小鼠脾指數(shù)測定結(jié)果表明沙棘油各劑量組可能通過促進(jìn)免疫器官發(fā)育來發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用。病理學(xué)檢查結(jié)果表明，沙棘油各劑量組與模型組比較耳組織表皮增厚程度減小，表皮及真皮水腫明顯減輕，淋巴細(xì)胞浸潤明顯減少，真皮血管擴(kuò)張充血現(xiàn)象緩解，抑制炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)論沙棘油對DNCB誘發(fā)的小鼠ACD有明顯的治療作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步考察。

沙棘油；變應(yīng)性接觸性皮炎；免疫

沙棘系胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木，為藥食兩用植物。沙棘油是由沙棘的籽或果實(shí)中提取，可修復(fù)黏膜、皮膚損傷，臨床上用于預(yù)防和治療胃潰瘍、皮膚燒燙傷等疾病。文獻(xiàn)報道沙棘油對醋酸引起小鼠腹膜炎[1]和角叉菜膠所致大鼠足腫脹均有明顯抑制作用[2]，抑制炎癥遞質(zhì)釋放，可降低毛細(xì)血管通透性。

變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)是T細(xì)胞介導(dǎo)的針對皮膚接觸致敏原的免疫反應(yīng)[3]，是最常見的皮膚病之一，具有難預(yù)防、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣的特點(diǎn)。減少炎性細(xì)胞聚集、促進(jìn)皮膚屏障功能恢復(fù)是目前治療ACD的一個突破口。研究表明沙棘油對皮膚損傷具有一定的修復(fù)作用，但其對ACD是否有抑制作用少有報道，本實(shí)驗通過建立2,4-二硝基氯苯(DNCB)誘發(fā)的小鼠ACD模型，研究沙棘油對小鼠ACD的治療作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗動物

雄性ICR小鼠，體重18～22 g，60只，來源于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心 [SCXK (新) 2016-0013]；飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心屏障環(huán)境 [SYXK (新) 2016-0002]，SPF級動物房，飼養(yǎng)溫度：恒溫(21℃～23℃)，相對濕度：恒濕(45%～65%)，光照：12 h/12 h明暗交替，每籠5只飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水；并在動物實(shí)驗過程中按實(shí)驗動物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

2,4-二硝基氯苯(DNCB)(西亞試劑有限公司)，二甲苯、丙酮、吐溫-80、甲醛溶液(天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純)，沙棘油(新疆慧華沙棘生物科技有限公司，批號：20160302)，復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：0503261)。

PQ202型飛利浦電動剃毛刀(珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司)，AB135-S型天平(瑞士梅特勒Mettler Toledo)，打孔器自制，DSX100型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3實(shí)驗方法

1.3.1 沙棘油各劑量組的制備

以吐溫-80為溶劑，將沙棘油制備成100%、50%和25%(高、中、低)3個劑量的沙棘油給藥組[2]。

1.3.2 小鼠ACD模型建立

按文獻(xiàn)建立動物模型[4-7]，腹部脫毛(3 cm × 3 cm)后，用1% DNCB丙酮橄欖油溶液100 μL致敏，第2天再次涂100 μL強(qiáng)化致敏。第5天小鼠右耳內(nèi)外側(cè)耳面涂以1% DNCB丙酮橄欖油溶液20 μL進(jìn)行激發(fā)。

1.3.3 實(shí)驗分組與給藥方案

實(shí)驗動物隨機(jī)分為6組，即空白對照組、模型對照組、陽性對照組、及沙棘油高、中、低劑量組(9 mL/kg、4.5 mL/kg、2.25 mL/kg)，每組10只?？瞻讓φ战M給予等量吐溫-80。按人與小鼠劑量換算公式，小鼠復(fù)方醋酸地塞米松乳膏用量為10 mL/kg。所有藥物均于致敏前1 d開始腹部外用給藥，每日1次，每次給藥量180 μL，連續(xù)給藥7 d。除模型組，其它各組于給藥第2、3天進(jìn)行致敏和強(qiáng)化致敏，給藥第6天各組進(jìn)行激發(fā)。

1.3.4 小鼠ACD模型評價指標(biāo)

激發(fā)前、激發(fā)后48 h分別對小鼠耳部紅斑、水腫、抓痕進(jìn)行評分作為耳部皮損情況評價指標(biāo)，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1；耳部皮損情況評分為建模成功與否及過敏反應(yīng)程度的評價指標(biāo)。

1.3.5 小鼠耳廓腫脹度及脾指數(shù)測定

激發(fā)后48 h脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用7 mm打孔器分別在兩耳同一部位打下耳片，稱重，以兩耳片的重量差異為腫脹度。耳廓腫脹抑制率計算如下：抑制率(%)=(模型對照組腫脹度-實(shí)驗組腫脹度)/模型對照組腫脹度× 100%。同時取小鼠脾臟稱重，以每10 g體重的脾質(zhì)量作為脾指數(shù)。

表1 小鼠耳部皮損情況評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.6 小鼠耳廓組織病理學(xué)檢查

激發(fā)后48 h，每組分別取5只小鼠，取右耳皮膚組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋固定，制成5 μm薄層切片，以蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)進(jìn)行染色，并使用光學(xué)顯微鏡觀察皮膚組織的病理變化，主要包括真皮水腫程度、炎癥細(xì)胞浸潤及其數(shù)目變化等情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1小鼠ACD模型評價指標(biāo)

結(jié)果見表2。小鼠經(jīng)耳部給予1% DNCB，激發(fā)30 min后，可見耳部激發(fā)處皮膚開始紅腫，小鼠搔抓現(xiàn)象明顯，48 h后小鼠耳部紅腫且均有撓抓痂皮，部分小鼠耳部水腫化膿。與空白對照組相比，ACD建模小鼠耳部皮損情況評分均明顯增加(P< 0.01)，提示小鼠ACD模型成功建立。

2.2各組藥物對ACD模型小鼠耳腫脹度的影響

結(jié)果見表3。由表可見，沙棘油給藥組和陽性對照組均能抑制小鼠耳腫脹度的增加，其中沙棘油高劑量組(9 mL/kg，外用)可明顯抑制DNCB誘發(fā)的小鼠耳廓腫脹，與模型組比較差異有顯著性(P< 0.01)，與陽性對照組比較差異無顯著性(P> 0.05)，抑制效果與陽性對照組接近。

Tab.2Scoring of the ear skin injury in the mice in each group

組別Groups劑量/mL/kgDose耳變態(tài)評分Scoresofearabnormalities致敏前Beforesensitization激發(fā)后48h48hafterstimulation空白對照組Blankcontrolgroup00.0±0.0模型對照組Modelcontrolgroup05.2±0.8**陽性對照組Positivecontrolgroup1005.2±0.8**沙棘油高劑量組High-doseseabuckthornoilgroup905.2±0.4**沙棘油中劑量組Medium-doseseabuckthornoilgroup4.505.3±0.7**沙棘油低劑量組Low-doseseabuckthornoilgroup2.2506.6±0.8**

注：與模型對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the model control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

Tab.3Comparison of the degree and inhibitory rate of mouse ear swelling in each group

組別Groups劑量/mL/kgDose耳腫脹度/mgEarswellingdegrees抑制率/%Inhibitoryrate空白對照組Blankcontrolgroup0.65±0.16**模型對照組Modelcontrolgroup12.22±2.30陽性對照組Positivecontrolgroup105.34±3.03**59.53沙棘油高劑量組High-doseseabuckthornoilgroup95.80±2.30**54.47沙棘油中劑量組Medium-doseseabuckthornoilgroup4.510.44±0.6523.62沙棘油低劑量組Low-doseseabuckthornoilgroup2.2510.30±5.7021.72

注：與模型對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the model control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.3小鼠ACD模型耳廓皮膚組織病理變化

2.3.1 建模后小鼠耳廓皮膚組織病理變化

正常小鼠耳部組織學(xué)結(jié)構(gòu)清楚，層次分明，表皮厚度正常，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間無水腫，無明顯炎性細(xì)胞浸潤，見圖1A。ACD模型組小鼠耳表皮增厚，創(chuàng)面有部分缺失，可見輕度細(xì)胞內(nèi)水腫及中度細(xì)胞間水腫，真皮淺層大量炎癥細(xì)胞浸潤，真皮血管擴(kuò)張充血明顯，與典型接觸性皮炎病理相符，見圖1B。

2.3.2 藥物處理后小鼠耳廓皮膚組織病理變化

ACD模型組小鼠經(jīng)不同劑量沙棘油及復(fù)方醋酸地塞米松乳膏腹部外用處理后，耳部組織表皮增厚程度減小，表皮及真皮水腫減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，真皮血管擴(kuò)張充血現(xiàn)象緩解，見圖1C～1F。在細(xì)胞間水腫減少程度上，陽性對照組更為明顯；在炎性細(xì)胞浸潤滲出減少程度上，沙棘油高劑量的抑制效果與陽性對照組接近，且沙棘油給藥組可見肉芽組織。以上表明沙棘油及復(fù)方醋酸地塞米松乳膏均能改善小鼠ACD模型耳部炎癥浸潤，在抑制血管擴(kuò)張充血效果上沙棘油高劑量組更為明顯。

2.4各組藥物對ACD模型小鼠脾指數(shù)影響

結(jié)果見表4。由表可見陽性對照組小鼠的脾指數(shù)低于空白對照組，而沙棘油各劑量組小鼠脾指數(shù)均高于空白對照組。復(fù)方醋酸地塞米松乳膏為糖皮質(zhì)激素類藥物，有免疫抑制作用，用藥后小鼠脾指數(shù)降低。沙棘油各組可能通過增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫、促進(jìn)免疫器官發(fā)育、恢復(fù)異常體液免疫功能，使免疫系統(tǒng)趨于平衡來發(fā)揮作用。

Tab.4Comparison of spleen indexes of the mice in each group

組別Groups劑量/mL/kgDose脾指數(shù)/10mg/gSpleenindex空白對照組Blankcontrolgroup51.52±13.26模型對照組Modelcontrolgroup60.07±15.64陽性對照組組Positivecontrolgroup1035.13±8.13*沙棘油高劑量組High-doseseabuckthornoilgroup973.18±18.78**沙棘油中劑量組Medium-doseseabuckthornoilgroup4.569.71±9.96**沙棘油低劑量組Low-doseseabuckthornoilgroup2.2564.50±6.10*

注：與空白對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the model control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A：空白對照組；B：模型對照組；C：陽性對照組；D：沙棘油高劑量組；E：沙棘油中劑量組；F：沙棘油低劑量組。圖1 各組小鼠耳廓皮膚組織病理變化的比較(× 20)Note. A: Blank control group; B: Model control group; C: Positive control group; D: Group of high-dose sea buckthorn oil; E: Group of medium-dose sea buckthorn oil; F: Group of low-dose sea buckthorn oil.Fig.1 Comparison of pathological changes in the ear skin of each group

3 討論

ACD是最常見的皮膚病之一，具有難預(yù)防、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣的特點(diǎn)，目前治療ACD的常用藥中，抗組胺藥對炎癥介質(zhì)有拮抗作用，對I型超敏反應(yīng)有效，但不能抑制IV型超敏反應(yīng)病變部位的炎細(xì)胞浸潤；糖皮質(zhì)激素類雖然顯效快、作用強(qiáng)、療效確切，但不適合長期臨床應(yīng)用。因此，尋找能安全、有效抑制IV型超敏反應(yīng)的藥物是目前的一個研究重點(diǎn)。小鼠ACD模型是免疫學(xué)上研究IV型變態(tài)反應(yīng)的經(jīng)典模型[5]，且不同誘導(dǎo)物產(chǎn)生的動物模型與藥物作用靶位有相關(guān)性。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，DNCB誘發(fā)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)[8]，且DNCB與細(xì)胞的蛋白質(zhì)載體結(jié)合刺激細(xì)胞因子釋放；異硫氰酸熒光素(FITC)誘發(fā)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，F(xiàn)ITC與血清中的蛋白質(zhì)載體結(jié)合刺激細(xì)胞因子釋放[9]，本實(shí)驗采用DNCB作為小鼠ACD模型誘導(dǎo)物，研究沙棘油對小鼠ACD的治療作用。

因為脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，故本實(shí)驗對小鼠脾指數(shù)進(jìn)行測定。實(shí)驗結(jié)果表明沙棘油各劑量組小鼠脾指數(shù)均高于空白對照組，而復(fù)方醋酸地塞米松乳膏給藥組低于空白對照組，提示復(fù)方醋酸地塞米松乳膏等糖皮質(zhì)激素類藥物是通過抑制機(jī)體的多個免疫環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮治療ACD的作用，但長期使用此類藥物會誘發(fā)感染或加重感染，可使體內(nèi)潛在的感染灶擴(kuò)散或靜止感染灶復(fù)燃，特別是原有抵抗力下降者。沙棘油各劑量組小鼠脾指數(shù)升高，推測沙棘油是通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，恢復(fù)異常體液免疫功能，使免疫系統(tǒng)趨于平衡來發(fā)揮作用，這對具有復(fù)發(fā)特點(diǎn)的ACD治療有長期應(yīng)用優(yōu)勢。

另外，根據(jù)小鼠耳腫脹度和耳廓皮膚組織病理切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙棘油和復(fù)方醋酸地塞米松乳膏均具有良好的抗炎癥作用，可以抑制炎性介質(zhì)釋放，降低毛細(xì)管通透性。研究報道表明沙棘油具有減少炎癥物質(zhì)產(chǎn)生、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能、恢復(fù)免疫抑制狀態(tài)下的天然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)水平的作用[10-11]，因此推斷沙棘油是通過控制炎性因子和免疫性因子而發(fā)揮治療ACD的作用[5]。沙棘油各組小鼠耳廓皮膚組織病理切片鏡下可見肉芽組織，而陽性對照組中未觀察到。因復(fù)方醋酸地塞米松乳膏等糖皮質(zhì)激素類藥物，有抑制肉芽組織增生作用，防止炎癥后期粘連和瘢痕形成，但這也將降低機(jī)體的防御和修復(fù)功能，可導(dǎo)致感染的擴(kuò)散和延緩創(chuàng)口的愈合。與復(fù)方醋酸地塞米松乳膏比，盡管沙棘油不能防止炎癥后期粘連和瘢痕形成，但可以促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合和修復(fù)[12-13]。

本文對沙棘油治療ACD藥效進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明沙棘油在治療ACD方面療效明顯，且無糖皮質(zhì)激素類藥物副作用，提示沙棘油在治療ACD中具有明顯的優(yōu)勢。目前沙棘油治療ACD作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步考察。

[1] 車錫平, 霍海如. 沙棘果油對小白鼠的鎮(zhèn)痛作用及對大鼠實(shí)驗性胃潰瘍的影響 [J]. 沙棘, 2001, 14(1): 34-37.

[2] 車錫平, 霍海如, 封衛(wèi)毅, 等. 沙棘油栓局部用藥對小白鼠等的抗炎作用和毒性實(shí)驗 [J]. 沙棘, 1995, 8(3): 40-44.

[3] 李林峰. 接觸性皮炎與皮膚變態(tài)反應(yīng) [M]. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2003.

[4] 陳奇. 中藥藥理研究方法學(xué) [M]. 第3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011.

[5] 許宗嚴(yán), 吳鐵, 吳志華. 鼠皮炎濕疹模型建立的研究進(jìn)展 [J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2005, 10(7): 730-733.

[6] 李圓圓, 閻春林, 馬莉, 等. 變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠模型評價指標(biāo)探討 [J]. 中國實(shí)驗動物學(xué)報, 2008, 16(5): 353-356, 404.

[7] 孫明立, 魏敏杰, 金萬寶, 等. 兩種變應(yīng)性接觸性皮炎動物模型的建立及比較 [J]. 中國實(shí)驗動物學(xué)報, 2008, 16(2): 132-134, 68.

[8] Tang A, Judge TA, Nickoloff BJ, et al. Suppression of murine allergic contact dermatitis by CTLA4Ig. Tolerance induction of Th2 responses requires additional blockade of CD40-ligand. [J]. J Immunol, 1996, 157(1): 117-125.

[9] Hopkins JE, Naisbitt DJ, Kitteringham NR, et al. Selective haptenation of cellular or extracellular protein by chemical allergens: association with cytokine polarization [J]. Chem Res Toxicol, 2005, 18(2): 375-381.

[10] 車錫平, 徐威, 霍海如, 等. 沙棘果油的抗炎作用和對免疫功能影響的實(shí)驗研究 [J]. 沙棘, 2000, 13(4): 28-32.

[11] 任力颯. 沙棘籽油抗突變抗免疫抑制作用的觀察 [J]. 沙棘, 1992, 5(4): 23-26.

[12] 周衛(wèi)東, 王玲, 鄒鳳, 等. 耳內(nèi)鏡下沙棘油棉片貼補(bǔ)治療外傷性鼓膜穿孔 [J]. 聽力學(xué)及言語疾病雜志, 2011, 19(3): 273-274.

[13] 王志遠(yuǎn), 羅小林, 何彩萍. 沙棘油治療燒傷創(chuàng)面的臨床觀察 [J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2006, 26(1): 124-125.

Therapeuticeffectofseabuckthornoilonallergiccontactdermatitisinmice

SHEN Qi， WANG Mei*， KANG Jin-sen

(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

ObjectiveTo study the therapeutic effect of sea buckthorn oil on allergic contact dermatitis (ACD) in mice.MethodsA total of 60 ICR mice were randomly divided into 6 groups: blank control group, model control group, three groups of high-dose, medium-dose and low-dose sea buckthorn oil (100%, 50%, 25%,adus.ext.), respectively, and positive control group (compound dexamethasone acetate cream), with 10 mice in each group. The mouse model of ACD was established by sensitization and stimulation with 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB), and injuries in the ear skin of the mice were scored and used as the indicator of successful establishment of the model. The degree of ear swelling and the spleen index of the mice in each group were measured at 48 h after stimulation. Hematoxylin and eosin staining was used to observe the pathological changes in the mouse ear skin.ResultsMeasurement of the degrees of ear swelling showed that the high-dose sea buckthorn oil group (9 mL/kg,adus.ext.) obviously inhibited the DNCB-induced ear swelling in the mice, with a significant difference compared with the model group (P< 0.01) and non-significant difference compared with the positive control group (P> 0.05). The result of the spleen index assessment showed that sea buckthorn oil at each dose may play an immune-regulatory role by promoting the development of immune organs. The pathological examination showed that epidermis thickening of the ear tissue, epidermal and dermal edema and infiltration of lymphocytes were reduced, dermal vasodilatation and congestion were alleviated, and inflammatory cell infiltration was inhibited in the three groups of different doses of sea buckthorn oil compared with the model control group.ConclusionsSea buckthorn oil has an obvious inhibitory effect on the DNCB-induced allergic contact dermatitis in mice. However, its related mechanisms remain to be further investigated.

Sea buckthorn oil; Allergic contact dermatitis, ACD; Immunity

沙棘油納米乳的制備研究(編號：CXCY096)。

沈琪(1992 -)，女，碩士研究生，專業(yè)：藥物新劑型。E-mail: 2529110682@qq.com

王梅(1978 -)，女，副教授，研究方向：藥物新劑型和藥物傳輸系統(tǒng)。E-mail: wm630@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0050-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.010

2017-03-19