李夢(mèng)媛，燕正強(qiáng)，韋榮飛，楊星九，朱瑞敏，高 苒*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021；2.定西市中醫(yī)院骨傷一科，甘肅 定西 743000)

IL-37b通過抑制樹突狀細(xì)胞相關(guān)的免疫應(yīng)答緩解感染性休克

李夢(mèng)媛1，燕正強(qiáng)2，韋榮飛1，楊星九1，朱瑞敏1，高 苒1*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021；2.定西市中醫(yī)院骨傷一科，甘肅 定西 743000)

目的表達(dá)IL-37b重組蛋白，研究其在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答方面的作用機(jī)制。方法構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28/IL-37b，誘導(dǎo)表達(dá)的IL-37b重組蛋白由Ni2+-NTA凝膠進(jìn)行純化。將IL-37b作用于C57BL/6 J小鼠，注射LPS誘導(dǎo)感染性休克，檢測(cè)小鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ的表達(dá)水平。分離并培養(yǎng)小鼠樹突狀細(xì)胞，用IL-37b處理，經(jīng)LPS誘導(dǎo)活化，檢測(cè)細(xì)胞表面CD40、CD80、MHCII等標(biāo)志物分子表達(dá)情況，以及培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)水平。分離小鼠CD4+T細(xì)胞，檢測(cè)IL-37b對(duì)LPS誘導(dǎo)的T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的抑制作用。結(jié)果IL-37b能夠降低感染性休克的小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)；并抑制小鼠樹突狀細(xì)胞共刺激分子和促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，以及CD4+T細(xì)胞表達(dá)促炎性細(xì)胞因子。結(jié)論純化的IL-37b具備生物學(xué)活性，能夠通過抑制樹突狀細(xì)胞活化及相關(guān)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答緩解機(jī)體感染性休克。

IL-37b；純化；樹突狀細(xì)胞；免疫應(yīng)答；感染性休克

細(xì)胞因子IL-37屬IL-1家族成員，曾經(jīng)被命名為IL-1F7[1]，其在人體多種組織、器官中都有表達(dá)[2-4]，但小鼠體內(nèi)并沒有被發(fā)現(xiàn)有其同類細(xì)胞因子的表達(dá)[5]。IL-37的基因序列包含6個(gè)外顯子，外顯子1～3編碼IL-37前體蛋白的N末端，外顯子4～6編碼C末端IL-1樣細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)[6]。IL-37的編碼產(chǎn)物有a、b、c、d、e共5種亞型，其中IL-37b是五種亞型中序列最長(zhǎng)的一個(gè)，共有218個(gè)氨基酸，含有外顯子1、2、4、5、6[7]。近年來，大量研究已證實(shí)IL-37b具有生物學(xué)活性，能夠作為炎癥抑制因子在多種炎癥性疾病中發(fā)揮功能，調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答[8-11]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)表面具有豐富的抗原遞呈分子，是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，能夠高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原。成熟的DCs能夠激活初始型T細(xì)胞，啟動(dòng)并調(diào)控免疫應(yīng)答，是機(jī)體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控者[12]。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建原核表達(dá)載體大量表達(dá)IL-37b重組蛋白，研究IL-37b對(duì)DCs活化及其相關(guān)的免疫應(yīng)答的影響，并進(jìn)一步研究IL-37b對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)揮抑制作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與原核表達(dá)質(zhì)粒

7～8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6 J小鼠18只購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [SCXK (京) 2014-0004]，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 [SYXK (京) 2014-002]。該實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC：GR16002)。

含有全長(zhǎng)IL-37b基因的重組質(zhì)粒pET28/IL-37b由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2主要試劑與用品

酵母提取物、干粉蛋白胨、瓊脂粉購自O(shè)xiod公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司；Ni2+-NTA凝膠購自Novagen公司；尿素、Tris-HCl、NaH2PO4、考馬斯亮藍(lán)等化學(xué)試劑購自Amresco公司；PBS、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶等購自Gibco公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自Sigma公司；重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)購自Peprotech公司；無菌細(xì)胞篩網(wǎng)、紅細(xì)胞裂解液、流式CBA細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購自BD公司；熒光標(biāo)記的細(xì)胞表面標(biāo)志分子檢測(cè)抗體購自eBioscience公司；預(yù)染蛋白分子量Marker、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自Thermo公司。引物合成及測(cè)序等服務(wù)由英濰捷基(上海)公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白純化

將制備好的能夠穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒pET28/IL-37b的大腸桿菌甘油菌凍存液均勻涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板表面，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，復(fù)蘇菌種。次日，挑取單個(gè)菌落接種至3～4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振搖培養(yǎng)8 h。將培養(yǎng)的菌液按1∶500的體積比接種到1 L LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃，200 r/min振搖，擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)至菌液A600值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)。16～18 h后，以4℃、4000 r/min條件離心30 min，收集菌體沉淀。用PBS溶液重懸沉淀，超聲破碎菌體，12 000 r/min再次離心20 min，分別取裂解產(chǎn)物的上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果顯示菌體裂解產(chǎn)物的上清和沉淀中都有外源性重組蛋白表達(dá)的條帶，表明重組IL-37b具有可溶性和包涵體兩種表達(dá)形式，其中沉淀中的目的重組蛋白較多，故收集菌體沉淀進(jìn)行純化[13]。

因重組IL-37b蛋白帶有6個(gè)His標(biāo)簽，故采用Ni2+-NTA凝膠進(jìn)行變性條件下的親和層析純化。變性結(jié)合緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0；變性漂洗緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 6.3；變性洗脫緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 4.5。純化完成后，對(duì)收集到的重組蛋白溶液進(jìn)行透析復(fù)性，并除去其中的尿素，于4℃環(huán)境透析24 h，每2～3 h更換一次透析液。

將蛋白純化過程中收集的各組分溶液樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，小心地將有條帶的分離膠部分切下來，用考馬斯亮藍(lán)染色30 min～1 h，至能明顯觀察到marker與蛋白條帶后，將其放入乙酸脫色液中洗滌脫色至蛋白條帶清晰。在紫外顯影儀下觀察蛋白條帶大小位置并拍照記錄。

1.3.2 IL-37b重組蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)的機(jī)體感染性休克的抑制作用

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外表層的內(nèi)毒素脂多糖，能夠引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、感染性休克等癥狀[14]。將C57BL/6 J小鼠分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩組，每組6只；實(shí)驗(yàn)組按照體重腹腔注射10 mg/kg的IL-37b重組蛋白溶液，對(duì)照組注射相同體積的PBS溶液；2 h后按體重給每只小鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS。注射18～20 h后，進(jìn)行眼眶取血，將全血室溫靜置1～2 h，待血凝后離心收集血清。采用CBA細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ的表達(dá)水平。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，配制含有上述3種細(xì)胞因子對(duì)應(yīng)的捕獲微球混合溶液，每個(gè)血清樣品取50 μL，與同體積的微球混合液混勻，室溫作用1 h；配制含有上述3種細(xì)胞因子對(duì)應(yīng)的PE標(biāo)記的熒光抗體混合溶液，取50 μL，逐一加入上一步的樣品中并混勻，室溫避光繼續(xù)作用1 h；1500 r/min離心5 min，洗滌一次，將樣品重懸后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ 3種細(xì)胞因子的表達(dá)量。

1.3.3 小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取3只C57BL/6 J小鼠，頸椎脫臼處死后，浸入75%乙醇中滅菌，在生物安全柜中解剖分離股骨與脛骨，用注射器抽取PBS溶液吹洗骨髓腔得到骨髓懸液；將骨髓懸液流過70 μm孔徑的細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，以1500 r/min離心5 min，棄去上清溶液；加入5 mL配制好的紅細(xì)胞裂解液，重懸細(xì)胞，4℃靜置5 min，去除紅細(xì)胞；隨后1500 r/min離心5 min，棄去上清溶液，用PBS溶液以相同的條件離心洗滌細(xì)胞，再次棄去上清溶液；用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于無菌培養(yǎng)皿中；DCs半貼壁生長(zhǎng)，用工作濃度20 ng/mL的GM-CSF與10 ng/mL IL-4共同誘導(dǎo)培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)6 d，每3 d更換一次培養(yǎng)基，補(bǔ)充細(xì)胞因子。GM-CSF能夠誘導(dǎo)DCs擴(kuò)增分化，并在體外環(huán)境下維持其生存；IL-4可抑制巨噬細(xì)胞克隆形成，誘導(dǎo)DCs生長(zhǎng)成熟。該方法得到的DCs可達(dá)到細(xì)胞總數(shù)的90%以上[15]。

1.3.4 IL-37b重組蛋白對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞活化的抑制作用

將培養(yǎng)6 d的DCs制成濃度為2 × 106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。LPS能夠促進(jìn)DCs活化或進(jìn)一步成熟，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞先采用工作濃度500 ng/mL的IL-37b單獨(dú)作用，2 h后加入工作濃度為500 ng/mL的LPS，與重組蛋白共同作用于細(xì)胞；對(duì)照組細(xì)胞則采用與重組蛋白溶液同體積的PBS溶液與500 ng/mL的LPS共同作用。37℃培養(yǎng)18～20 h后，分別收集細(xì)胞與培養(yǎng)上清。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樹突狀細(xì)胞表面的標(biāo)志物分子表達(dá)情況

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面標(biāo)志分子CD40、CD80、MHCII的表達(dá)情況。配制含有不同熒光標(biāo)記的CD40(PE)、CD80(PE-Cyanine5)、MHCII(FITC)抗體混合溶液，加入離心收集到的細(xì)胞沉淀中并將其重懸，4℃避光反應(yīng)30 min；1500 r/min離心5 min，棄去上清，加入PBS溶液離心洗滌細(xì)胞一次，再將細(xì)胞重懸；用200目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面CD40、CD80、MHCII的表達(dá)水平。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子表達(dá)水平

采用CBA細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)1.3.4中收集的DCs培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)量。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟同1.3.2。

1.3.7 分離小鼠脾臟CD4+ T細(xì)胞

取3只C57BL/6 J小鼠，頸椎脫臼處死后，浸入75%乙醇中滅菌，在生物安全柜中解剖取脾臟，浸入PBS溶液。用無菌注射器活塞研磨至細(xì)胞釋出，將細(xì)胞懸液流過70 μm孔徑的細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，以1500 r/min離心5 min，棄去上清溶液；加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，步驟同1.3.3。配制CD4+(FITC)抗體溶液，加入離心后的細(xì)胞沉淀中并將其重懸，避光反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后離心去除上清，并加入PBS溶液離心洗滌細(xì)胞一次，再將細(xì)胞重懸；用200目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞懸液中的CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行分選。

1.3.8 IL-37b重組蛋白對(duì)小鼠CD4+T細(xì)胞活化的抑制作用

將分選后的小鼠CD4+T細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別采用工作濃度500 ng/mL的IL-37b與同體積的PBS溶液?jiǎn)为?dú)作用，2 h后加入工作濃度為500 ng/mL的LPS，共同孵育培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)18 h后，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用CBA細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的表達(dá)量。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟同1.3.2。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1蛋白純化

SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示，在25 × 103左右處有一條高表達(dá)的外源性蛋白條帶，與預(yù)期IL-37b重組蛋白的分子量相符合；并且純化后的蛋白溶液中除該目的條帶外未見其他條帶。

2.2小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)LPS誘導(dǎo)感染性休克的小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)水平。與PBS對(duì)照組比較，經(jīng)IL-37b重組蛋白預(yù)處理后，小鼠血清中的IL-1β、IL-6與IFN-γ的表達(dá)水平均顯著下降，如圖2所示。表明純化的重組IL-37b蛋白具備生物學(xué)活性，能夠抑制LPS引起的機(jī)體炎癥反應(yīng)。

2.3小鼠樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物分子的表達(dá)

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)LPS作用后的小鼠DCs表面CD40、CD80、MHCII等表面標(biāo)志物分子的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同數(shù)量的細(xì)胞中，經(jīng)IL-37b預(yù)處理的DCs表面CD40、CD80與MHCII所占的百分比低于未經(jīng)蛋白作用的組別，其中CD40、CD80的下降趨勢(shì)差異有顯著性，如圖3所示。

圖1 IL-37b純化的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of IL-37b purification and identification

注：n=6；與PBS對(duì)照組比較，* P< 0.05。圖2 血清中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá) Note. n=6; Compared with the PBS control group,*P< 0.05.Fig.2 Expression levels of proinflammatory cytokines in the serum of mice with LPS-induced septic shock

注：n=3；* P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖3 樹突細(xì)胞表面抗原的表達(dá)Note. n=3;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Fig.3 Surface antigen expression on dendritic cells

2.4小鼠樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)LPS作用后小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未經(jīng)蛋白預(yù)處理的對(duì)照組相比，經(jīng)IL-37b作用的細(xì)胞培養(yǎng)上清中，上述4種細(xì)胞因子的表達(dá)量全部降低，其中IL-1β、IL-12與TNF-α顯著下降，如圖4所示。

2.5小鼠CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)

通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)LPS作用后小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未經(jīng)IL-37b預(yù)處理的對(duì)照組相比，經(jīng)IL-37b作用的細(xì)胞培養(yǎng)上清中，上述3種細(xì)胞因子的表達(dá)量明顯下降，如圖5所示。

3 討論

人DCs起源于造血干細(xì)胞，DCs表面具有豐富的抗原遞呈分子，如組織相容性復(fù)合物MHCI與MHCII，共刺激因子CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40/CD40L，以及粘附因子ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3等。未成熟的DCs具有較強(qiáng)的遷移能力與抗原吞噬能力，而成熟的DCs表面高表達(dá)共刺激分子與粘附因子，處于啟動(dòng)、調(diào)控、維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[12]。DCs使T細(xì)胞活化需要三個(gè)信號(hào)：第一個(gè)信號(hào)是DCs表面高表達(dá)MHCI或MHCII分子，其與被捕獲并加工處理后的抗原肽結(jié)合后，共同遞呈給T細(xì)胞；第二個(gè)信號(hào)是DCs表面高表達(dá)的共刺激分子CD80、CD86、CD40等，能夠促進(jìn)T細(xì)胞活化，啟動(dòng)免疫應(yīng)答；第三個(gè)信號(hào)即活化的DCs大量分泌的IL-1β、IL-12、TNF-α、IL-10和IL-6等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠激活T細(xì)胞分化增殖并影響其分化方向[16]，故DCs能夠介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

Nold[17]等用IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，證實(shí)IL-37能夠抑制LPS引起的機(jī)體感染性休克；并且，IL-37也能夠在體外抑制LPS刺激引起的人外周血單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用IL-37b重組蛋白對(duì)野生型(wild type，WT)小鼠進(jìn)行預(yù)處理，隨后通過LPS誘導(dǎo)其感染性休克，證實(shí)IL-37b重組蛋白能夠明顯抑制血清中的IL-1β、IL-6與IFN-γ等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，說明原核表達(dá)的IL-37b具備生物學(xué)活性，能夠抑制機(jī)體感染性休克。

注：n=3；*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖4 樹突細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)Note. n=3;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Fig.4 Expression of cytokines in culture supernatants of dendritic cells

注：n=3；*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖5 CD4+ T細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)Note. n=3;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Fig.5 Expression of cytokines in culture supernatants of CD4+ T cells

LPS能夠促進(jìn)DCs進(jìn)一步活化并分泌大量促炎性細(xì)胞因子，從而促進(jìn)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[18]。Nold[17]等通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了感染性休克小鼠脾臟DCs中CD86和MHCII分子雙陽性細(xì)胞所占的比例，這些表面分子的大量表達(dá)可以引發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)中，WT小鼠CD86和MHCII分子雙陽性細(xì)胞所占的比例是73%，而IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠CD86和MHCII分子雙陽性細(xì)胞所占的比例僅為47%，表明IL-37能夠抑制LPS引起的DCs活化。CD4+T細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)的核心細(xì)胞群體，不同的CD4+T細(xì)胞通過分泌不同的細(xì)胞因子，對(duì)免疫系統(tǒng)的整體功能具有重要的調(diào)控作用[19]。成熟的DCs是IL-1β的重要來源，在某些情況下，DCs可通過分泌以IL-1β為主的細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞活化。IL-12和TNF-α是促進(jìn)輔助性T細(xì)胞(T helper cells，Th)向Th1分化的主要細(xì)胞因子，IL-6和IL-10則促進(jìn)Th向Th2分化，這些細(xì)胞因子表達(dá)量的變化對(duì)Th0的分化起著重要作用[12, 20]。Th1與Th2同屬于CD4+T細(xì)胞亞群，Th1能夠分泌TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的進(jìn)一步合成；而Th2可產(chǎn)生IL-10等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子的適量表達(dá)有利于控制、阻斷急性炎癥的發(fā)展，因而對(duì)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)起下調(diào)作用[21]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)IL-37b預(yù)處理的小鼠DCs培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-10、IL-12、TNF-α表達(dá)量全部降低，DCs表面的共刺激分子表達(dá)下降，證實(shí)IL-37b能夠抑制DCs活化，且抑制其傳達(dá)使T細(xì)胞活化的信號(hào)；并且，IL-37b能夠降低CD4+T細(xì)胞表達(dá)的IFN-γ、TNF-α、IL-10等細(xì)胞因子，抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的進(jìn)程。

綜上，IL-37b能夠抑制T細(xì)胞的活化與其向Th1、Th2分化的進(jìn)程，從而抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答。證實(shí)IL-37b能夠通過抑制DCs活化及相關(guān)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)緩解LPS引起的機(jī)體感染性休克。

[1] Dinarello C, Arend W, Sims J, et al. IL-1 family nomenclature [J]. Nat Immunol, 2010, 11(11): 973.

[2] Akdis M, Burgler S, Crameri R, et al. Interleukins, from 1 to 37, and interferon-γ: receptors, functions, and roles in diseases [J]. J Allergy Clin Immunol, 2011, 127(3): 701-721, e1-e70.

[3] Gao W, Kumar S, Lotze MT, et al. Innate immunity mediated by the cytokine IL-1 homologue 4 (IL-1H4/IL-1F7) induces IL-12-dependent adaptive and profound antitumor immunity [J]. J Immunol, 2003, 170(1): 107-113.

[4] Kumar S, Hanning CR, Brigham-Burke MR, et al. Interleukin-1F7B (IL-1H4/IL-1F7) is processed by caspase-1 and mature IL-1F7B binds to the IL-18 receptor but does not induce IFN-γ production [J]. Cytokine, 2002, 18(2): 61-71.

[5] Boraschi D, Lucchesi D, Hainzl S, et al. IL-37: a new anti-inflammatory cytokine of the IL-1 family [J]. Eur Cytokine Netw, 2011, 22(3): 127-147.

[6] Kumar S, McDonnell PC, Lehr R, et al. Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin-1 family [J]. J Biol Chem, 2000, 275(14): 10308-10314.

[7] Sharma S, Kulk N, Nold MF, et al. The IL-1 family member 7b translocates to the nucleus and down-regulates proinflammatory cytokines [J]. J Immunol, 2008, 180(8): 5477-5482.

[8] McNamee EN, Masterson JC, Jedlicka P, et al. Interleukin 37 expression protects mice from colitis [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(40): 16711-16716.

[9] Zhao PW, Jiang WG, Wang L, et al. Plasma levels of IL-37 and correlation with TNF-α, IL-17A, and disease activity during DMARD treatment of rheumatoid arthritis [J]. PLoS One, 2014, 9(5): e95346.

[10] Bulau AM, Fink M, Maucksch C, et al.Invivoexpression of interleukin-37 reduces local and systemic inflammation in concanavalin A-induced hepatitis [J]. ScientificWorldJournal, 2011, 11: 2480-2490.

[11] Lunding L, Webering S, Vock C, et al. IL-37 requires IL-18Rα and SIGIRR/IL-1R8 to diminish allergic airway inflammation in mice [J]. Allergy, 2015, 70(4): 366-373.

[12] 楊文博, 趙堃. 樹突狀細(xì)胞的研究進(jìn)展 [J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2011, 17(15): 2279-2281.

[13] Gu J, Gao X, Pan X, et al. High-level expression and one-step purification of a soluble recombinant human interleukin-37b inEscherichiacoli[J]. Protein Expr Purif, 2015, 108: 18-22.

[14] 郭萌, 李冠民, 黃清泉. 細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2009, 17(5): 397-401.

[15] 馬東霞, 趙越, 向瑩, 等. 小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增和鑒定 [J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013, 42(4): 386-390.

[16] 夏清, 譚洪毅, 潘頻華, 等. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子在誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化中的作用 [J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2015, 40(8): 829-836.

[17] Nold MF, Nold-Petry CA, Zepp JA, et al. IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity [J]. Nat Immunol, 2010, 11(11): 1014-1022.

[18] 陳松, 盧利莎, 王偉強(qiáng), 等. 脂多糖通過調(diào)控樹突狀細(xì)胞存活和分泌細(xì)胞因子促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖 [J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2016, 32(9): 1153-1157, 1163.

[19] 周洲, 馮娟, 王憲. 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化及其影響因素 [J]. 生物物理學(xué)報(bào), 2012, 28(2): 93-111.

[20] Lombardi V, Akbari O. Dendritic cell modulation as a new interventional approach for the treatment of asthma [J]. Drug News Perspect, 2009, 22(8): 445-451.

[21] 郝鈺, 趙斌, 郭鈺琪, 等. 脂多糖誘導(dǎo)小鼠內(nèi)皮損傷早期T細(xì)胞亞群的變化 [J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2011, 27(6): 488-491.

IL-37balleviatessepticshockthroughinhibitionofimmuneresponsesrelatedtodendriticcells

LI Meng-yuan1， YAN Zheng-qiang2, WEI Rong-fei1， YANG Xing-jiu1， ZHU Rui-min1， GAO Ran1*

(1.Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College (PUMC), Beijing 100021, China; 2.Department of Orthopedics,Dingxi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Dingxi 743000,China)

ObjectiveTo express the recombinant IL-37b protein and to investigate its role in the regulation of immune responses.MethodsThe prokaryotic expression vector pET28/IL-37b was constructed. The recombinant IL-37b protein was induced to be expressed and was purified using Ni2+-NTA gel column. C57BL/6 J mice were treated with IL-37b and injected with lipopolysaccharide (LPS) to induce septic shock, and the expression levels of IL-1β, IL-6, IFN-γ in the serum of the mice were detected. Dendritic cells from bone marrow of the mice were isolated and cultured, and were treated with IL-37b. After LPS-induced activation, the expression levels of marker molecules such as CD40, CD80 and MHCII on the cell surface, and cytokines such as IL-1β, IL-10, IL-12 and TNF-α in the culture supernatants were detected by flow cytometry. The CD4+T cells from mice were isolated and the inhibitory effects of IL-37b on the expression of IFN-γ, TNF-α and IL-10 in the culture supernatants of T cells after induction by LPS were detected.ResultsIL-37b reduced the expression levels of proinflammatory cytokines in the serum of septic shock mice. IL-37b also inhibited the expression of co-stimulatory molecules and proinflammatory cytokines of the mouse dendritic cells, and suppress the activation of CD4+T cellsinvitro.ConclusionsPurified recombinant IL-37b protein has high bioactivity, and can alleviate septic shock in organisms through inhibiting the activation of dendritic cells and related T cell immune responses.

IL-37b; Purification; Dendritic cells; Immune responses; Septic shock

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程-重大協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目-協(xié)同創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助(編號(hào)：2016-I2M-3-019)。

李夢(mèng)媛(1988-)，女，研究方向：免疫學(xué)。E-mail: limengyuan767@126.com

高苒(1980 -)，女，研究方向：腫瘤學(xué)、免疫學(xué)。E-mail: gaoran26@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0044-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.009

2017-03-23