沈唯軍 時(shí) 晨 丁 婷 （無錫市輔仁高級中學(xué) 江蘇無錫 214123）

學(xué)生“D IY”凝膠染色，用于“探究影響酶活性的因素”

沈唯軍 時(shí) 晨 丁 婷 （無錫市輔仁高級中學(xué) 江蘇無錫 214123）

在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生整合了凝膠電泳和“探究影響酶活性的因素”的實(shí)驗(yàn)。通過創(chuàng)新地引入凝膠分割和染色條件控制，學(xué)生“DIY”進(jìn)行了凝膠酶活性染色。實(shí)驗(yàn)不僅操作性更強(qiáng)、能夠培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)興趣，而且開拓了學(xué)生的思路，充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)的探究性和開放性。

凝膠染色 淀粉酶 過氧化氫酶 溫度 pH

筆者在與丹麥交流生的交談中，發(fā)現(xiàn)歐美生物課程并不是采用線性的方法去驗(yàn)證結(jié)論，而是鼓勵(lì)學(xué)生“跳躍思維”運(yùn)用各種技術(shù)去探究問題。為此筆者以“探究影響酶活性的因素”實(shí)驗(yàn)為支點(diǎn)，指導(dǎo)學(xué)生查閱各種資料，獨(dú)立設(shè)計(jì)了各種實(shí)用的實(shí)驗(yàn)方法。其中，聯(lián)系到人教版選修1“SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳——血紅蛋白的分離與純度檢測”，學(xué)生創(chuàng)新地整合了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)并取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。

1 實(shí)驗(yàn)原理

蛋白酶的凝膠電泳分離：在電場的驅(qū)動(dòng)下，攜帶負(fù)電荷的蛋白酶能從聚丙烯酰胺凝膠的負(fù)極向正極泳動(dòng)，其電泳的距離和樣品的分子量有關(guān)。

過氧化氫酶的活性染色：在凝膠上無過氧化氫酶的區(qū)域，H2O2能與FeCl3-K3Fe(CN)6反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色，而在有過氧化氫酶的區(qū)域則能將H2O2分解為H2O和O2，這樣在凝膠的藍(lán)色背景下就會(huì)呈現(xiàn)透明區(qū)帶，并且區(qū)帶亮度越大，表明活性越高。

淀粉酶的活性染色：在凝膠上無淀粉酶的區(qū)域，淀粉溶液能與碘溶液反應(yīng)呈現(xiàn)暗藍(lán)色，而在有淀粉酶的區(qū)域則能分解淀粉，同樣會(huì)在暗藍(lán)色背景上出現(xiàn)淺黃色區(qū)帶，并且區(qū)帶亮度越大，表明活性越高。

2 試劑配制（以下試劑由教師提前配制或直接購買）

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的丙烯酰胺溶液：稱取14.55 g丙烯酰胺和0.45 g N，N'-甲叉雙丙烯酰胺，先用40 mL蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓儆谜麴s水定容至50 mL，過濾。用棕色瓶4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

物質(zhì)量濃度為0.5 mol/L的Tris-HCl(pH6.8)溶液：稱取3.03 g Tris溶解在40 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8。再用蒸餾水定容至50 mL。保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

物質(zhì)量濃度為1.5 mol/L的Tris-HCl（pH8.9)溶液：稱取18.16 g Tris溶解在80 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH至8.9。再用蒸餾水定容至100 mL，保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的過硫酸銨：稱取0.1 g過硫酸銨用蒸餾水定容至1.0 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

電極緩沖液：稱取15.14 g Tris和72.07 g甘氨酸，用蒸餾水定容至5 L。

樣品：購買商品化的過氧化氫酶和淀粉酶（鄭州碩源生物科技有限公司），稱取1 g酶粉和2 mg溴酚藍(lán)，加入1 mL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)溶液和0.5 mL甘油，用蒸餾水定容到10 mL。

過氧化氫酶染色液：A液：量取1 mL市售質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，用蒸餾水定容至1 L；B液：稱取FeCl3和K3Fe(CN)6各10 g，用蒸餾水定容至1 L。

淀粉酶染色液：A液：稱取10 g可溶性淀粉和12 g NaCl，用蒸餾水定容至1 L；B液：量取50 mL醋酸，用蒸餾水定容至1L；C液：稱取30mg KI和13mg I2，用蒸餾水定容至1 L。

3 凝膠的配制(由學(xué)生自主操作，教師指導(dǎo))

（1）將玻璃板、膠墊、梳子用蒸餾水洗凈，并用酒精棉球擦拭，按說明安裝好電泳槽。

（2）按表1所示，配制12%分離膠和5%濃縮膠。

（3）先將分離膠倒入兩塊玻璃板間，直至前端離頂端2.5 cm左右，在膠頂部緩緩加入約0.5 cm的蒸餾水，待分離膠聚合完全后，傾去上層的蒸餾水，用吸水紙吸去殘余的水滴。將濃縮膠倒入玻璃板夾層，插上梳子，待濃縮膠聚合完全后，拔去梳子，立即用蒸餾水清洗點(diǎn)樣孔。

4 電泳

加入電極緩沖液，用移液槍將10 μL樣品點(diǎn)入點(diǎn)樣孔底部。電泳在4℃的冰箱中進(jìn)行，保持電壓100 V，直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部終止。

表1 分離膠和濃縮膠的配置

5 凝膠分割

使用直尺和飛鷹刀片，將不同泳道的凝膠進(jìn)行分割。

6 凝膠活性染色

（1）參考Wu,Cui,Tao and Yang的方法：將凝膠條移到大培養(yǎng)皿中，用蒸餾水浸泡15 min。其后，將凝膠在 pH 為 3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 的 A 液中浸泡25 min，然后小心地用蒸餾水洗滌后放入B液中染色。當(dāng)達(dá)到最大對比度，用蒸餾水漂洗凝膠使反應(yīng)停止。

（2）參考黃紅英、易道生和高建林的方法：把凝膠條浸入 A 液，在 0、25、50、75、100 ℃保溫 30 min，取出凝膠用蒸餾水洗凈再放置于B液中浸泡5 min。然后取出沖洗后再放置于C液中浸泡，直至在暗藍(lán)色背景上出現(xiàn)淺黃色區(qū)帶。

7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

學(xué)生通過自主的的探究活動(dòng)，可以得出如下結(jié)論：如圖1所示，凝膠中的過氧化氫酶在不同pH條件下顯示的條帶深淺各不相同，即過氧化氫酶的活性與pH緊密相關(guān)的。過氧化氫酶的最適pH為6.0，pH上升（pH7.5,pH9.0）或下降（pH3.0，pH4.5）時(shí)，酶的活性都會(huì)顯著下降。如圖2所示，凝膠中淀粉酶的條帶著色也隨著溫度而變化。當(dāng)在溫度為50℃時(shí)，活性最高，酶帶較寬。溫度低于或高于50℃時(shí)，酶帶逐漸變窄，酶活性顯著下降。

8 教學(xué)反思

8.1 采用凝膠染色，體驗(yàn)分子技術(shù)

圖1 利用凝膠活性染色探究pH對過氧化氫酶的活性的影響

圖2 淀粉酶的凝膠活性染色

隨著實(shí)驗(yàn)硬件的改善，昔日“高大上”的分子實(shí)驗(yàn)，開始“飛入”尋常高中的課堂。但是由于實(shí)踐運(yùn)用上的局限，學(xué)校很少能夠有效地開展凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。相較于純粹地理論講解，通過親身實(shí)驗(yàn)可以使學(xué)生更加真實(shí)地體驗(yàn)到分子生物學(xué)的奧秘。

8.2 操作性更強(qiáng)，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)興趣

原教材的探究實(shí)驗(yàn)雖然簡單易行，但是也剝奪了學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐的機(jī)會(huì)。生物學(xué)本質(zhì)是實(shí)驗(yàn)性的科學(xué)，更多的實(shí)踐操作會(huì)為學(xué)生打下更加堅(jiān)實(shí)的科研基礎(chǔ)。此外，相較于直接觀察氣泡或顏色的變化，由學(xué)生“DIY”的凝膠染色，明顯增加了實(shí)驗(yàn)的趣味性。

8.3 自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，開拓探究思路

本實(shí)驗(yàn)從設(shè)計(jì)到最終的實(shí)施，都有學(xué)生的參與。學(xué)生在參考文獻(xiàn)的同時(shí)并不是簡單地模仿。為了適應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，學(xué)生創(chuàng)新地進(jìn)行了凝膠分割和染色條件控制，充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)的探究性和開放性。

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文件編號：1003-7586(2017)10-0044-02