張明天 張永和 張蓮珠

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

參葉緩癡膠囊對(duì)SHSY5Y細(xì)胞凋亡的作用

張明天 張永和 張蓮珠

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的探討參葉緩癡膠囊(SYHC)改善認(rèn)知功能障礙(CI)作用的相關(guān)機(jī)制。方法MTT法觀察SYHC對(duì)細(xì)胞增殖的影響，不同濃度岡田酸誘導(dǎo)下細(xì)胞的存活率及岡田酸IC50的確定。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及SYHC對(duì)岡田酸致神經(jīng)細(xì)胞凋亡后的保護(hù)作用。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定細(xì)胞中相關(guān)神經(jīng)介質(zhì)的含量及酶的活性。結(jié)果結(jié)論SYHC對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞具有促增殖作用，能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，降低岡田酸對(duì)其造成的損傷，并對(duì)已受損的神經(jīng)細(xì)胞具有一定的修復(fù)作用。其作用途徑可能是從維持細(xì)胞膽堿能水平、避免細(xì)胞tau蛋白過(guò)度磷酸化及調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)等方面來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

參葉緩癡膠囊；認(rèn)知功能障礙；岡田酸；tau 蛋白

認(rèn)知功能障礙(CI)主要包括感知覺(jué)障礙、思維障礙、注意障礙、記憶障礙、智能障礙等。重者達(dá)到癡呆的程度，輕者則表現(xiàn)為CI，其中輕者具有早期干預(yù)的價(jià)值。CI是介于正常老化和老年癡呆(AD)之間的一種臨床狀態(tài)，CI代表AD的早期階段，由于CI在臨床上處于可逆期，如果在CI階段能給予治療及干預(yù)可大大降低AD發(fā)病率。參葉緩癡膠囊(SYHC)由淫羊藿、人參、銀杏葉等組成，臨床治療CI療效顯著。乙酰膽堿(Ach)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。其主要功能是能夠促進(jìn)激活腦神經(jīng)傳導(dǎo)功能，提高信息傳遞速度，增強(qiáng)大腦記憶能力，全面改善腦功能并能延緩衰老。tau蛋白是一種低分子量的微管相關(guān)蛋白，當(dāng)tau蛋白發(fā)生高度磷酸化時(shí)則失去對(duì)微管的穩(wěn)定作用，導(dǎo)致神經(jīng)纖維退化，從而引起神經(jīng)功能失調(diào)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本文以岡田酸損傷神經(jīng)細(xì)胞作為模型，初步探究該藥改善CI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2試劑 SYHC(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 制劑中心)，低糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶(Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMSO、岡田酸(SIGMA公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD公司)，ACH、chAT、AchE、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF及p-tau試劑盒(RD公司)。

1.3儀器 BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD)，INFINITE M200酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)，IX71倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)，Mili Q超純水器(美國(guó)Millipore)，3111二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó) THERMO)，SW-CJ-1F 超凈臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)等。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基中，37℃，飽和濕度，5% CO2溫箱培養(yǎng)。每周更換3次培養(yǎng)基，0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SYHC對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 參葉緩癡膠囊與SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞共孵育24 h，在 6.25～100 μg/ml濃度范圍內(nèi)具有細(xì)胞增殖作用。對(duì)照組細(xì)胞存活率為(100.1±4.33)%，隨著濃度的增加，其增殖效果逐漸加強(qiáng)，其中6.25 μg/ml細(xì)胞存活率(100.4±1.16)%，12.5 μg/ml細(xì)胞存活率(100.8±4.35)%，25 μg/ml細(xì)胞存活率(105.7±4.35)%，50 μg/ml細(xì)胞存活率(113.7±2.41)%，100 μg/ml細(xì)胞存活率(119.3±3.40)%。但濃度高于100 μg/ml時(shí)，SYHC對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的促增殖作用逐漸減緩，200 μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率為(110.7±2.15)%。

2.2岡田酸致細(xì)胞損傷IC50的測(cè)定 岡田酸可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，具有顯著殺傷作用，其殺傷效力具有濃度依賴性，且作用效果與時(shí)間具有正相關(guān)性，岡田酸320 nmol/L作用48 h，細(xì)胞存活率為19.7%，通過(guò)擬合曲線，計(jì)算其IC50為80 nmol/L，見(jiàn)表1。通過(guò)顯微鏡察不同濃度岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。對(duì)照組(A)細(xì)胞呈三角形或多角形，軸突清晰，胞膜完整光滑，隨著岡田酸濃度的增加(B～F)，細(xì)胞逐漸皺縮，胞質(zhì)及胞核濃縮，細(xì)胞間接觸消失。見(jiàn)圖1。

表1 岡田酸對(duì)SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞存活率的影響

與0 nmol/L比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01，3)Plt;0.001

A.對(duì)照組;B～F：岡田酸濃度分別為20、 40、 80、 160、 320 nmol/L圖1 與岡田酸共孵育48 h 后SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.3SYHC對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)與修復(fù) 當(dāng)細(xì)胞在與SYHC共同孵育12 h后，加入損傷因子岡田酸(80 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，SYHC對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。其中對(duì)照組細(xì)胞存活率(100.0±16.0)%，模型組細(xì)胞存活率(54.6±8.7)%，12.5 μg/ml細(xì)胞存活率(56.6±5.1)%,25 μg/ml細(xì)胞存活率(64.4±5.3)%,50 μg/ml細(xì)胞存活率(69.8±2.5)%,100 μg/ml細(xì)胞存活率(83.3±4.2)%。

經(jīng)過(guò)損傷因子岡田酸(80 nmol/L)損傷后的SH-SY5Y細(xì)胞，在SYHC 12.5～100 μg/ml的濃度下，對(duì)其具有一定的修復(fù)作用。其中對(duì)照組細(xì)胞存活率(100.0±1.3)%，模型組細(xì)胞存活率(48.4±2.0)%，12.5 μg/ml細(xì)胞存活率(49.0±0.7)%,25 μg/ml細(xì)胞存活率(51.8±0.8)%,50 μg/ml細(xì)胞存活率(61.2±3.2)%,100 μg/ml細(xì)胞存活率(62.5±6.6)%。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)岡田酸致SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡情況 與對(duì)照組(0.02%±6.44%)比較，岡田酸20、40、80、160、320 nmol/L組細(xì)胞凋亡率(5.13%±0.68%、23.72%±1.06%、51.38%±1.78%、65.99%±0.94%、82.28%±0.70%)逐漸增加，表明岡田酸可以造成細(xì)胞凋亡。在岡田酸濃度為80 nmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率為51.38%，確定此濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)元細(xì)胞損傷濃度。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)參葉緩癡膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)情況 與模型組(45.40%±8.76%)比較，參葉緩癡膠囊25、50、100 μg/ml組細(xì)胞凋亡率(35.61%±5.39%、30.18%±2.56%、16.62%±4.26%)降低(Plt;0.05)，表明參葉緩癡膠囊對(duì)岡田酸致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。另外，對(duì)照組為0.03%±16.09%，12.5 ng/ml組為43.40%±5.12%。

2.6參葉緩癡膠囊對(duì)岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞膽堿能異常的影響 與對(duì)照組比較，岡田酸致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型組細(xì)胞Ach含量明顯降低(Plt;0.001)，ChAT含量減少(Plt;0.001)，AchE酶活力明顯升高(Plt;0.001)。與模型組比較，參葉緩癡膠囊50、100 μg/ml給藥組SH-SY5Y細(xì)胞Ach含量增加(Plt;0.001)，25、50、100 μg/ml給藥組SH-SY5Y細(xì)胞ChAT含量增加(Plt;0.05，Plt;0.01)，AchE活力降低(Plt;0.01)。見(jiàn)表2。

2.7參葉緩癡膠囊對(duì)岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡基因的影響 與對(duì)照組比較，岡田酸模型組Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(Plt;0.001)。與模型組比較，參葉緩癡膠囊50、100 μg/ml組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量增加(Plt;0.05)，Bax/Bcl-2比值降低。見(jiàn)表3。

2.8參葉緩癡膠囊對(duì)岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞磷酸化tau蛋白含量的影響 岡田酸造成SH-SY5Y細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞液中p-tau的含量明顯增加(Plt;0.001)。與模型組〔(3.08±0.07)pg/ml〕比較，參葉緩癡膠囊50、100 μg/ml給藥組〔(2.78±0.12)pg/ml、(2.68±0.07)pg/ml〕細(xì)胞液中p-tau含量明顯下降(Plt;0.05，lt;0.01)。對(duì)照組為(2.54±0.02)pg/ml，12.5 μg/ml組為(3.06±0.16)pg/ml，25 μg/ml組為(2.95±0.11)pg/ml。

表2 參葉緩癡膠囊增加岡田酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞Ach、ChAT含量，抑制AchE活性

與模型組比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01，3)Plt;0.001

表3 參葉緩癡膠囊對(duì)岡田酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞Bax/Bcl-2表達(dá)變化的比較

3 討 論

CI多發(fā)病于老年人，是老年癡呆的前兆，老年人的記憶功能隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸衰退，記憶和認(rèn)知功能減退是正常老化不可避免的現(xiàn)象〔1，2〕，而虛、瘀、濁、毒〔3〕是多種老年病的主要中醫(yī)病理基礎(chǔ)，也是大多數(shù)老年病的基本病機(jī)，虛為其本，瘀、濁、毒為其標(biāo)，血瘀、痰濁、毒邪既是臟氣虛衰的結(jié)果，又是主要的致病因素，四者相互影響，成為認(rèn)知功能障礙及癡呆的復(fù)雜發(fā)病機(jī)理〔4～6〕。參葉緩癡膠囊以淫羊藿溫補(bǔ)腎陽(yáng)，補(bǔ)先天之本(腎)，以人參健脾益氣，補(bǔ)后天之本(脾)，以銀杏葉活血化瘀，通調(diào)血脈(心)。岡田酸是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，在一定濃度下可以抑制磷酸酯酶的活性，磷酸酯酶可以催化磷酸蛋白內(nèi)的磷酸酯鍵水解，達(dá)到去磷酸化的目的〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)：(1)參葉緩癡膠囊對(duì)正常SH-SY5Y細(xì)胞在一定濃度范圍內(nèi)具有促增殖作用且濃度與細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)性。在參葉緩癡膠囊對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，模型組與中藥治療組比較，在50 μg/ml與100 μg/ml濃度下保護(hù)效果最為明顯，提示在進(jìn)一步研究參葉緩癡膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)途徑時(shí)，要將作用濃度控制在100 μg/ml以下。同時(shí)參葉緩癡膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)于修復(fù)作用。 (2)參葉緩癡膠囊可降低岡田酸致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型細(xì)胞凋亡率。(3)降低細(xì)胞凋亡基因Bax蛋白的表達(dá)含量可提高抑凋亡基因(Bcl2)蛋白表達(dá)量，Bax/Bcl-2比值降低。本研究提示結(jié)果表明，參葉緩癡膠囊可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡的途徑對(duì)腦細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。(4)岡田酸可以造成神經(jīng)元細(xì)胞乙酰膽堿水平下降、tau蛋白過(guò)度磷酸化、細(xì)胞凋亡基因表達(dá)異常以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺失。(5)參葉緩癡膠囊改善認(rèn)知功能障礙可能與其調(diào)節(jié)中樞膽堿能神經(jīng)功能，促進(jìn)細(xì)胞ACh合成并抑制分解有關(guān)。(6)腦內(nèi)微管蛋白tau蛋白是一種分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的低分子量含磷糖蛋白，本研究表明，參葉緩癡膠囊改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用可能與抵制P-tau生成有關(guān)?？傊?，SYHC改善CI其作用途徑可能與維持細(xì)胞膽堿能水平、避免細(xì)胞tau蛋白過(guò)度磷酸化及調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)等方面有關(guān)。

1Fillit H，Evansd，Butler R，etal.Achieving and maintaining cognitive veitality with wing〔J〕.Mayo Clin Proc，2002;77(7)：681-967.

2Chertkow H，Bergman H，Schipper HM，etal.Assessment of suspected dementia〔J〕.Can J Neurol Sci,2001;28(suppll)：S28-S41.

3李 浩，姚明江.淺談中醫(yī)“虛”、“瘀”、“濁”、“毒”與輕度認(rèn)知障礙發(fā)病的關(guān)系〔J〕.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2006；3(11) ：4-5.

4王江山，周文泉.治療老年性癡呆臨床經(jīng)驗(yàn)〔J〕.中醫(yī)研究，2000;13(4)：18-9.

5趙 冰，張華東，張 晨，等.謝海洲治療老年性癡呆經(jīng)驗(yàn)〔J〕.中醫(yī)雜志，2006;47(4)：258-9.

6顧 蔚，侯曉薇，劉 鑫，等.對(duì)經(jīng)基苯甲酸丙醋對(duì)果蠅壽命及超氧化物歧化酶、丙二酸的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(20)：2968-70.

7Fernandez JJ，Candenas ML，Souto ML，etal.Okadaic acid，useful tool for studying cellular processes〔J〕.Curr Med Chem，2002;9(2)：229-62.

〔2017-09-11修回〕

(編輯 郭 菁)

R285.5

A

1005-9202(2017)21-5255-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.017

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201215161)

張永和(1955-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理學(xué)及中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

張明天(1988-)，男，碩士，主要從事分子生物學(xué)及流式細(xì)胞儀臨床檢驗(yàn)及科研工作。