侯 杰 焦成斌 尚進才 張曉麗 羅 蘭

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科，黑龍江 佳木斯 154002)

可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對原位肝癌小鼠的治療效果

侯 杰 焦成斌 尚進才 張曉麗 羅 蘭1

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的評價可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對原位肝癌小鼠的抗腫瘤效果。方法通過外科手術(shù)將肝癌H22細(xì)胞種植于昆明鼠的左肝內(nèi)，構(gòu)建原位肝癌小鼠腫瘤模型。將4價奧沙利鉑(Ⅳ)藥物連接到高分子載體上，組裝成納米藥物，將該納米藥物同小分子奧沙利鉑(Ⅱ)對肝癌的治療效果進行比較。結(jié)果成功構(gòu)建了小鼠肝癌原位模型，并通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)實驗及腫瘤機制實驗證實可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物更有效，生物毒性更低。結(jié)論可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對原位肝癌小鼠有較好的治療效果，并明顯降低了鉑藥的毒副作用。

原位肝癌模型；高分子鍵合藥；納米膠束；靶向治療

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年(45～55)萬人死于肝癌〔1～3〕，Jemal等〔4〕報道，全球每年肝癌新發(fā)病例超過70萬，我國每年肝癌新發(fā)病例約占全球一半以上〔5〕。據(jù)世界衛(wèi)生部門統(tǒng)計〔6〕，肝癌的死亡率在消化系統(tǒng)各類惡性腫瘤中高居第2位，僅次于胃癌，我國肝癌患者平均發(fā)病年齡較輕〔7〕。肝癌的治療手段有手術(shù)、化療、放療、介入治療、中醫(yī)、中藥治療〔8〕等，目前主要是手術(shù)切除腫瘤組織〔9〕，臨床上肝癌發(fā)現(xiàn)多數(shù)是疾病晚期，喪失手術(shù)機會且預(yù)后較差〔10〕。為了保證治療效果，在肝癌化療方案中選用的多種化療藥物往往劑量很大，并且靶向性不強，對機體產(chǎn)生較明顯的毒副作用，出現(xiàn)高效高毒現(xiàn)象，化療引起的惡心、嘔吐是最常見的不良反應(yīng)〔11，12〕，病人的生存質(zhì)量差，生存期延長有限。提高臨床化療效果有兩點關(guān)鍵因素，①藥物對腫瘤的靶向性治療，有效提高化療藥物靶向性；②如何有效降低藥物本身對機體產(chǎn)生的毒副作用。臨床上肝癌患者化療時，多采用的是小分子2價的奧沙利鉑(Ⅱ)藥物，但奧沙利鉑(Ⅱ)藥物同其他鉑藥一樣，本身具有毒副作用大、靶向性差、在循環(huán)中有效血藥濃度時間短等問題。本實驗構(gòu)建了昆明鼠的原位肝癌動物模型，試圖通過動物和細(xì)胞實驗證實可生物降解4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米膠束M(Pt)藥物較2價奧沙利鉑(Ⅱ)更有效，生物毒性更低，具有更高效的抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1動物、細(xì)胞、主要試劑 雄性昆明小鼠，體重為18～22 g，采購自北京協(xié)和實驗動物中心；造模應(yīng)用的腹水型H22肝癌細(xì)胞、RPMI1640培養(yǎng)基及磷酸鹽緩沖液(PBS)均為中科院長春應(yīng)用化學(xué)研究所提供；實驗應(yīng)用的兩親性嵌段共聚物——聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚賴氨酸(mPEG-b-PCL-b-PLL)與鉑(Ⅳ)的鍵合物在中科院長春應(yīng)用化學(xué)研究所實驗室內(nèi)合成。

1.2昆明鼠原位肝癌模型的制備 消毒條件下，注射器抽取實驗室動物房內(nèi)昆明鼠腹腔內(nèi)傳代保存的腹水型肝癌H22細(xì)胞株，在腹腔液中緩慢加入PBS，低速離心，棄去上清液，電子顯微鏡下精確計數(shù)肝癌H22細(xì)胞數(shù)，準(zhǔn)確調(diào)整H22單細(xì)胞液濃度為2×107/ml備用，單只實驗昆明鼠左葉肝臟接種H22細(xì)胞數(shù)量為單細(xì)胞懸液0.05 ml(1×106個細(xì)胞)，用胰島素針注射于實驗小鼠肝左葉膈面，嚴(yán)格注意進行無菌、無瘤操作原則。造模1 w后，在實驗室嚴(yán)格消毒條件下將100只實驗小鼠實施麻醉后進行剖腹檢查，95只左肝葉可見癌腫生成，腫物表面凹凸不平，呈現(xiàn)灰白顏色，浸潤性生長，突出肝臟表面，質(zhì)地硬，說明原位肝癌模型造模成功，其中有5只腫瘤逃逸，出現(xiàn)癌性腹水，遠處轉(zhuǎn)移，并有腹腔內(nèi)種植轉(zhuǎn)移，原位肝癌模型實驗成瘤率為95%。

1.3細(xì)胞毒性試驗 應(yīng)用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)的方法對比奧沙利鉑(Ⅱ)、M(Pt)的體外抗癌活性。

1.4組織分布 通過斷髓法分批處死實驗小鼠，分別于1、3、6、9、12、24 h摘取原位肝癌實驗小鼠的心、肝、脾、肺、腎等器官，并分離出健康肝組織及腫瘤組織，應(yīng)用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP)方法提取出兩種鉑藥的金屬鉑，測定各個器官內(nèi)兩種實驗藥物的鉑藥含量。

1.5腫瘤抑制實驗 原位肝癌實驗小鼠，分別隨機抓取18只作為對照組(注射生理鹽水)、奧沙利鉑(Ⅱ)組及M(Pt)組，分別于1、3、5、7、9、11 d處死每組各3只，將原位肝癌腫瘤組織完整剝除，采用腫瘤的體積測量公式：長×寬2×0.5〔13〕，電腦測算出每組肝臟腫瘤的體積，取平均值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行t、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩種藥物對人肝腫瘤細(xì)胞株(HepG-2)48、72 h的細(xì)胞毒性 48 h內(nèi)，奧沙利鉑(Ⅱ)對HepG-2細(xì)胞的毒性較M(Pt)大，HepG-2細(xì)胞的殺滅效果較M(Pt)好；隨時間延長，72 h M(Pt)對HepG-2細(xì)胞的毒性較奧沙利鉑(Ⅱ)大，對HepG-2細(xì)胞的殺滅效果較奧沙利鉑(Ⅱ)好，差異均顯著(均Plt;0.05)。見圖1。

圖1 奧沙利鉑(Ⅱ)、M(Pt)對HepG-2細(xì)胞48、72 h的細(xì)胞毒性

2.2兩種藥物在不同器官的含量 M(Pt)在心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織中含量均顯著高于奧沙利鉑(Ⅱ)(Plt;0.05)，見圖2。

2.3兩種藥物對腫瘤體積的抑制效果 M(Pt)組對腫瘤體積的抑制效果顯著好于奧沙利鉑(Ⅱ)組(Plt;0.05)。見圖3。

圖2 奧沙利鉑(Ⅱ)、M(Pt)在不同器官含量的測定

圖3 奧沙利鉑(Ⅱ)、M(Pt)對腫瘤體積的抑制效果

3 討 論

在化療藥物中，鉑配合物抗癌藥物在臨床上占有重要的地位，應(yīng)用量大，約占全部抗癌藥物的一半以上〔14～16〕，在原有“高分子鍵合藥”前期工作的基礎(chǔ)上，研制雙親性嵌段共聚物與鉑(Ⅳ)的鍵合物，藥物含量達到臨床治療上的足夠高的鉑藥劑量，并有效降低了金屬鉑藥的毒性，在真正意義上實現(xiàn)對金屬奧沙利鉑(Ⅱ)藥物的有效保護和靶向輸送，為癌癥的檢測和治療開辟了新途徑〔17〕，鉑(Ⅳ)從高分子鍵合物上釋放和還原成奧沙利鉑(Ⅳ)的過程通過細(xì)胞和動物實驗證明納米鉑藥抗腫瘤效果優(yōu)于奧沙利鉑(Ⅱ)，真正意義上為高分子-鉑(Ⅳ)鍵合藥的研究提供了理論基礎(chǔ)，為納米藥物的臨床應(yīng)用提供可供參考的實驗依據(jù)，開創(chuàng)性地創(chuàng)造出了低毒高效鉑類抗癌藥物的新品種〔18～20〕。構(gòu)建肝癌的動物模型的方法主要包括自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性、人類肝癌的異種移植模型及轉(zhuǎn)基因動物肝癌模型，既往實驗采用的動物模型絕大多數(shù)為移植性模型，且多為異位的動物模型，原位模型極少，這與原位動物模型的構(gòu)建困難有關(guān)，但異位動物模型實驗結(jié)果不完全可靠，并不能完全真實地反映疾病的病理改變及治療效果。本文構(gòu)建的昆明鼠原位肝癌種植模型，在實踐上具有高度的臨床實用性和相關(guān)性，易于開展和普及，實驗周期短，造模成功率高，在進行抗腫瘤藥物治療過程中能更好地真實模擬肝癌在人體內(nèi)的生物學(xué)特性及破壞行為，在臨床試驗研究中具有極大的應(yīng)用價值。從仿生學(xué)的角度設(shè)計和制備可控的鉑類高分子納米藥物，該藥物具有和生物體內(nèi)環(huán)境相應(yīng)的大小、形態(tài)、表面性能的特點。M(Pt)藥物在肝臟組織中具有截留效應(yīng)，在腫瘤組織中具有高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)〔21〕，確實提高了藥物在腫瘤部位的蓄積，膠束藥物可以有效發(fā)揮抗腫瘤作用及達到緩釋的效果，更長久地發(fā)揮抗腫瘤效果。

1Mao J，Yuan J，Wang L，etal.Tamoxifen inhibits migration of estrogen receptor-negative hepatocellular carcinoma cells by blocking the swelling-activated chloride current〔J〕.J Cell Physiol，2013；228(5)：991-1001.

2Ma P，Liu S，Huang Y，etal.Lactose mediated liver-targeting effect observed by ex vivo imaging technology〔J〕.Biomaterials，2010；31(9)：2646-54.

3Jemal A，Siegel R，Xu J，etal.Cancer statistics，2010〔J〕.CA Cancer J Clin，2010；60(5)：277-300.

4Jemal A，Bray F，Center MM，etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2011；61(2)：69-90.

5郝 捷，陳萬青.2012中國腫瘤登記年報〔M〕.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2012:31-56.

6張思維，李連弟，魯鳳珠，等.中國1990～1992年原發(fā)性肝癌死亡調(diào)查分析〔J〕.中華腫瘤雜志，1999；21(4)：245-9.

7Chen JG，Zhang SW.Liver cancer epidemic in China：past，present and future〔J〕.Semin Cancer Biol，2011；21(1)：59-69.

8湯釗猷.中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌的思考〔J〕.臨床肝膽病雜志，2011；27(5)：449-50.

9許磊波，王 捷，劉 超.不同分期系統(tǒng)對晚期肝癌肝切除患者生存的預(yù)測價值比較〔J〕.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2014；21(2)：138-41.

10Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistics，2009〔J〕.CA Cancer J Clin，2009；59(4)：225-49.

11Natale JJ.Reviewing current and emerging antiemetics for chemotherapy-induced nausea and vomiting prophylaxis〔J〕.Hosp Pract (1995)，2015；43(4)：226-34.

12Haiderali A，Menditto L，Good M，etal.Impact on daily functioning and indirect/direct costs associated with chemotherapy-induced nausea and vomiting (CINV) in a U.S.population〔J〕.Support Care Cancer，2011；19(6)：843-51.

13Natio S,von Eschenbach AC,Giavazzi R,etal. Growth and metastasis of tumor cells isolated from a human renal cell carcinoma implanted into different organs of nude mice〔J〕.Cancer Res,1986;46(8):4109-15.

14Madias NE，Harrington JT.Platinum nephrotoxicity〔J〕.Am J Med，1978；65(2)：307-14.

15Thompson SW，Davis LE，Kornfeld M，etal.Cisplatin neuropathy.Clinical，electrophysiologic，morphologic，and toxicologic studies〔J〕.Cancer，1984；54(7)：1269-75.

16Ekborn A，Laurell G，Andersson A，etal.Cisplatin-induced hearing loss：influence of the mode of drug administration in the guinea pig〔J〕.Hear Res，2000；140(1-2)：38-44.

17Cheng Z，Al Zaki A，Hui JZ，etal.Multifunctional nanoparticles：cost versus benefit of adding targeting and imaging capabilities〔J〕.Science，2012；338(6109)：903-10.

18Giandomenico CM，Abrams MJ，Murrer BA，etal.Carboxylation of kinetically inert platinum(Ⅳ) hydroxy complexes.An.Engtr.acte.ee into orally active platinum(Ⅳ) antitumor agents〔J〕.Inorg Chem，1995；34(5)：1015-21.

19Reithofer M，Galanski M，Roller A，etal.An entry to novel platinum complexes：carboxylation of dihydroxoplatinum(Ⅳ) complexes with succinic anhydride and subsequent derivatization〔J〕.Eur J Inorg Chem，2006；13：2612-7.

20Reithofer MR，Valiahdi SM，Jakupec MA，etal.Novel di-and tetracarboxylatoplatinum(Ⅳ) complexes.Synthesis，characterization，cytotoxic activity，and DNA platination〔J〕.J Med Chem，2007；50(26)：6692-9.

21Bisht S，Maitra A.Cheminform abstract: dextran-doxorubicin/chitosan nanoparticles for solid tumor therapy〔J〕.Chemin form，2011；42(25)：415-25.

〔2016-10-22修回〕

(編輯 王一涵)

R735.7

A

1005-9202(2017)21-5241-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.010

黑龍江省青年基金(No.QC2013C101)；佳木斯大學(xué)青年基金(No.Sq2013-023)

1 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化一科

羅 蘭(1978-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)疾病研究。

侯 杰(1978-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事肝膽外科研究。