羅 方 許玲玉 李清楚 康志強(qiáng)

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450000)

Six1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響

羅 方 許玲玉 李清楚 康志強(qiáng)

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450000)

目的探討Six1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響。方法甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞轉(zhuǎn)染Six1小干擾RNA(Six1 siRNA)和小干擾RNA陰性對(duì)照(siRNA control)，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲，Western印跡檢測(cè)Six1、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)、上皮鈣黏附素(E-cadherin)蛋白表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)染siRNA control后的BCPAP細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞中Six1、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平與沒有轉(zhuǎn)染的BCPAP細(xì)胞相比無變化。轉(zhuǎn)染Six1 siRNA后的BCPAP細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞中Six1、N-cadherin蛋白表達(dá)水平與沒有轉(zhuǎn)染的BCPAP細(xì)胞相比明顯降低，而E-cadherin蛋白水平明顯升高。結(jié)論敲低Six1可能通過影響E-cadherin、N-cadherin表達(dá)抑制甲狀腺癌細(xì)胞侵襲遷移。

甲狀腺癌；Six1；侵襲；遷移

甲狀腺癌屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率在全部惡性腫瘤中占1%，碘元素缺乏、放射線、甲狀腺功能異常及遺傳等均能夠引起甲狀腺癌的發(fā)生〔1〕。手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、放射性核素治療是目前常用的治療方法。Six1是一種與胚胎發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在正常的發(fā)育成熟組織中極少表達(dá)，而在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)〔2〕。Six1表達(dá)上調(diào)常與乳腺癌等腫瘤的預(yù)后有關(guān)〔3〕，有研究表明Six1影響宮頸癌等腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖能力〔4〕。本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法下調(diào)甲狀腺癌細(xì)胞中Six1的表達(dá)，初步探討Six1敲低對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；Six1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz ；Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN ；神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)抗體、上皮鈣黏附素(E-cadherin)抗體、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus Corporation。

1.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和鏈霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在相對(duì)濕度95%，5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間每隔3 d進(jìn)行一次傳代，0.25%的胰蛋白酶消化傳代。觀察細(xì)胞飽和度約為70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書。將轉(zhuǎn)染siRNA-Six1和siRNA control的細(xì)胞分別記為siRNA-Six1組、陰性對(duì)照組，同時(shí)以沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染組。

1.3細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的背面用記號(hào)筆均勻的劃線。取未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、siRNA-Six1組細(xì)胞，按照每孔中加入5×105個(gè)細(xì)胞接種到劃線后的細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)1 d待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用移液槍槍頭垂直的在培養(yǎng)板上劃出細(xì)痕，使細(xì)痕與培養(yǎng)板背面的劃線重合。用磷酸鹽緩沖液(PBS)將劃下來的細(xì)胞清洗干凈，加入不含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)24 h后拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.4Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲 侵襲實(shí)驗(yàn)用8 μm孔徑的24孔板Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)前48 h取出matrigel放置于冰上融化，按照50 μl/cm2加入Transwell小室，在37℃下孵育30 min。在Transwell小室的上室加入100 μl不含胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋的未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、siRNA-Six1組細(xì)胞(細(xì)胞懸浮液密度為109個(gè)/L)，在下室中加入600 μl含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后將Transwell小室取出，用棉簽將沒有穿膜的細(xì)胞擦掉，PBS洗滌后用4%甲醛固定，吉姆薩染色后在顯微鏡下觀察穿膜的細(xì)胞數(shù)目，選取5個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western印跡檢測(cè)Six1、N-cadherin、E-cadherin表達(dá) 未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、siRNA-Six1組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白(操作步驟參照蛋白提取試劑盒)，采用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。把蛋白樣品加入到5倍上樣緩沖液中100℃煮沸5 min。每組蛋白樣品取50 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉在室溫封閉60 min，依次與一抗和二抗結(jié)合后，ECL發(fā)光，ChemiDoc XRS成像，Image Lab對(duì)蛋白定量并以β-actin為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差。

2 結(jié) 果

2.1Six1下調(diào)對(duì)細(xì)胞遷移的影響 未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、siRNA-Six1組細(xì)胞遷移率分別為(51.47±5.68)%、(52.69±4.92)%、(21.84±3.54)%。陰性對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。siRNA-Six1組與未轉(zhuǎn)染組相比明顯降低(Plt;0.05)。

2.2Six1下調(diào)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響 未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、siRNA-Six1組細(xì)胞侵襲數(shù)目分別為(325.84±36.25)個(gè)、(324.75±33.55)個(gè)、(213.36±24.17)個(gè)。陰性對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。siRNA-Six1組與未轉(zhuǎn)染組相比明顯降低(Plt;0.05)。

2.3N-cadherin、E-cadherin、Six1蛋白表達(dá) 未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、siRNA-Six1組細(xì)胞Six1蛋白水平分別為0.62±0.04、0.64±0.05、0.25±0.03，N-cadherin蛋白水平分別為1.17±0.15、1.19±0.10、0.85±0.08，E-cadherin蛋白水平分別為0.35±0.03、0.34±0.05、1.10±0.12。陰性對(duì)照組N-cadherin、E-cadherin、Six1蛋白水平與未轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。siRNA-Six1組Six1、N-cadherin蛋白水平與未轉(zhuǎn)染組相比明顯降低，E-cadherin蛋白水平明顯升高(t1=,t2=,t3=,Plt;0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中N-cadherin、E-cadherin、Six1表達(dá)

3 討 論

Six1是胚胎發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子，屬于同源盒蛋白家族成員之一，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附、遷移等作用〔5〕。成熟的細(xì)胞中Six1表達(dá)水平下降，而在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Six1表達(dá)上調(diào)，其可以通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、入侵等導(dǎo)致細(xì)胞癌變，該作用已經(jīng)在子宮癌、乳腺癌、肝癌、大腸癌等多種癌癥中得以證實(shí)〔6,7〕。Six1基因定位于14q23染色體上，其編碼的蛋白可以與DNA結(jié)合調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的增殖〔8〕。Six1是一種癌基因，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、分化、增殖等有關(guān)，正常的乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)Six1后可以誘發(fā)乳腺癌并且表現(xiàn)出高侵襲性〔9〕。Six1表達(dá)下調(diào)后的骨肉瘤細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞侵襲和遷移能力也明顯下降〔10〕。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程，也是腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。癌細(xì)胞擴(kuò)散首先需要脫離原發(fā)病灶，也就是脫離癌細(xì)胞之間的黏附，其中E-cadherin發(fā)揮重要作用〔11〕。E-cadherin是一個(gè)跨膜糖蛋白，分子量為120 kD，為鈣黏素家族的成員之一，其在癌癥中表達(dá)下調(diào)，是癌細(xì)胞侵襲和遷移能力增加的重要原因〔12〕。N-cadherin是另外一個(gè)參與細(xì)胞遷移的鈣黏素成員，是一種神經(jīng)鈣黏素，其與E-cadherin作用不同，在癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用〔13〕。

本研究成功構(gòu)建了Six1下調(diào)的甲狀腺癌細(xì)胞株，提示Six1下調(diào)能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，Six1表達(dá)降低后能夠通過抑制甲狀腺癌細(xì)胞中N-cadherin表達(dá)并促進(jìn)E-cadherin表達(dá)發(fā)揮作用。

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〔2017-08-24修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R736.1

A

1005-9202(2017)21-5243-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.011

河南省科學(xué)技術(shù)廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009A360015)

羅 方(1978-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事甲突眼的發(fā)病機(jī)制研究。