劉杰+劉良敏+黃英龍+呂忠堅+蒙蘭麗+黃鈞

摘 要：以常規(guī)方法分離細菌，API 20NE進行細菌鑒定，人工感染檢測細菌的致病性，K-B紙片擴散法進行耐藥性試驗，對梧州市等3個不同養(yǎng)殖區(qū)域黃顙魚源嗜水氣單胞菌及其致病性、耐藥性進行調(diào)查。結(jié)果顯示，從廣西梧州等3個市/縣網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患病黃顙魚（Pseudobagrus fulvidrico）分離到17株嗜水氣單胞菌，總檢出率41.46%，永?？h的檢出率最高（76.92%），桂平市次之（26.67%），梧州市最低（23.08%）。除YF13無致病力外，其余16株菌株對健康黃顙魚的平均致死率70.00%～100%。抑菌效果最好的藥物有環(huán)丙沙星、左氟沙星和鹽酸沙拉沙星3種，抑菌效果最差的是青霉素G和氨芐青霉素。高度敏感的藥物梧州市有9種，永?？h10種，桂平市12種；不敏感藥物梧州市6種，永?？h3種，桂平市2種。對3個養(yǎng)殖區(qū)域黃顙魚源嗜水氣單胞菌都高度敏感的藥物有頭孢他啶等8種，都不敏感的是青霉素G和氨芐青霉素2種。

關(guān)鍵詞：黃顙魚（Pseudobagrus fulvidrico）；嗜水氣單胞菌；致病性；耐藥性

黃顙魚（Pseudobagrus fulvidrico）的營養(yǎng)價值高，硒含量豐富，是防癌、抗衰老的優(yōu)良食品[1]，是我國出口創(chuàng)匯的優(yōu)良水產(chǎn)品，也是廣西重要的名特優(yōu)淡水養(yǎng)殖品種之一。在廣西，黃顙魚的養(yǎng)殖主要集中在南寧市、柳州市、桂林市、梧州市和桂平市等市、縣，但近年來廣西養(yǎng)殖黃顙魚細菌性病害日漸增多，已知的有類志賀鄰單胞菌引起的類志賀鄰單胞菌病[2]，嗜水氣單胞菌引起的腹水病[3]和暴發(fā)性流行病[4-5]等，還有嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌引起的體表潰瘍病[6]。據(jù)多年來對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，廣西養(yǎng)殖黃顙魚細菌性疾病在生產(chǎn)實踐中很常見，一旦發(fā)病，通常會造成嚴重的經(jīng)濟損失，已檢測到的病原菌主要有嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌等。筆者主要對廣西的梧州市、永福縣和桂平市3個不同養(yǎng)殖區(qū)域黃顙魚源嗜水氣單胞菌及其致病性、耐藥性進行調(diào)查，旨在了解黃顙魚源嗜水氣單胞菌在廣西黃顙魚主養(yǎng)區(qū)的分布和該菌在不同養(yǎng)殖區(qū)域的致病力和對藥物的耐藥特性，為各地對該菌引起的黃顙魚疾病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2013～2015年間，分別于廣西梧州市、桂平市和永?？h，采集網(wǎng)箱養(yǎng)殖中患病病癥明顯的黃顙魚，病魚個體重在35.3～103.4 g之間。健康黃顙魚購自南寧市某個體養(yǎng)殖戶，平均體重（32.26±4.01）g普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、兔血瓊脂培養(yǎng)基購于北京陸橋責(zé)任有限公司，API20NE試劑條及附加試劑、麥氏比濁管購于法國生物梅里埃公司，革蘭氏染液、藥敏紙片購自杭州天和微生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離 病樣帶回實驗室后，先按常規(guī)進行剖檢，觀察記錄其臨床癥狀，然后從其肝臟、心臟、脾臟、腦等組織取樣，分別接種到購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和兔血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)24 h后取優(yōu)勢菌落經(jīng)純化后以甘油液保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 細菌的鑒定 菌落和菌體的形態(tài)觀察 在普通培養(yǎng)基和兔血培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，直接觀察菌落形態(tài)、顏色及溶血性等，革蘭氏染色后觀察細菌的染色特性、菌體形態(tài)并測定菌體大小。

API生化鑒定 生化鑒定所用的API半自動細菌鑒定系統(tǒng)及麥氏比濁管、生化試劑條、氧化酶等相關(guān)附屬試劑，均購自法國-梅里埃公司。

細菌鑒定時，先在分離菌株的單個菌落上滴加氧化酶試劑后，1 min內(nèi)快速變色為氧化酶反應(yīng)陽性，不變色為氧化酶反應(yīng)陰性。本調(diào)查僅對氧化酶反應(yīng)陽性的分離菌株，按API產(chǎn)品說明書選用API 20NE試劑條進行鑒定和結(jié)果判讀。

1.2.3 人工感染試驗 健康黃顙魚購回后先進行20 d的檢疫暫養(yǎng)，人工感染前抽樣剖檢和進行細菌分離試驗，確認無寄生蟲和細菌感染。

無菌濾液的人工感染 無菌條件下取病樣的肝、心、脾、腎剪碎，按重量加入5倍的無菌PBS液后勻漿，8 000 r/min離心15 min，取上清液并加入雙抗，置4 ℃冰箱2 h后以0.22 μm細菌濾膜過濾得無菌濾液。取少量無菌濾液涂布于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)24 h觀察有無菌落生成。將健康黃顙魚分成試驗組和對照組（每組10尾），采取腹腔注射的方法，試驗組注射無菌濾液0.3 mL/尾，對照組注射等量的PBS液，注射后按組進行常規(guī)的飼養(yǎng)管理，每天觀察記錄各組受試魚的攝食、游動和死亡情況，連續(xù)觀察15 d。試驗組若出現(xiàn)死亡，即取其肝、心、脾、腎等組織制成無菌濾液再進行1次無菌濾液的人工感染。

分離菌株的致病性試驗 用無菌PBS液洗下分離菌株的新鮮培養(yǎng)菌落，制成相當(dāng)于MCF3管濃度的菌懸液，再以活菌計數(shù)的方法確定菌懸液的細菌濃度。與無菌濾液的人工感染一樣，將健康黃顙魚分組（每組20尾）后，以腹腔注射的方法，試驗組注射0.3 mL/尾的菌懸液，對照組注射等量的無菌PBS液。注射后按組進行常規(guī)的飼養(yǎng)管理，每天觀察記錄各組受試魚的攝食、游動和死亡情況，連續(xù)觀察15 d。試驗組若出現(xiàn)死亡，取瀕死個體再進行細菌分離和人工感染試驗。

1.2.4 菌株的耐藥表譜檢測 試驗用的藥敏紙片中，除氟苯尼考（30 μg）、磺胺-6-甲氧嘧啶（25 μg）、磺胺二甲嘧啶（25 μg）和鹽酸沙拉沙星（5 μg）4種為廣西水生動物病害診斷實驗室自行制備外，其余的青霉素G（10 μg）、氨芐青霉素（10 μg）、頭孢他啶（30 μg）、頭孢拉定（30 μg）、慶大霉素（10 μg）、復(fù)方磺胺甲惡唑SMZ/TMP（23.75/1.25 μg）、新霉素（30 μg）、新生霉素（30 μg）、恩諾沙星（30 μg）、環(huán)丙沙星（5 μg）、左氟沙星（5 μg）、依諾沙星（30 μg）、氧氟沙星（5 μg）、頭孢哌酮鈉（75 μg）和哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（哌拉西林/他唑巴坦：100/10 μg）15種均購自杭州天和微生物試劑有限公司。endprint

試驗采用常規(guī)的K-B紙片擴散法進行。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離鑒定結(jié)果

2013年～2015年，共從廣西梧州市、永福縣和桂平市網(wǎng)箱養(yǎng)殖中采集了27批次黃顙魚病樣，分離到41株優(yōu)勢菌株，氧化酶試驗均為陽性，經(jīng)API 20NE生化鑒定，嗜水氣單胞菌17株，占分離菌株數(shù)的41.46%，其他菌株分別為溫和氣單胞菌15株（占36.59%），肺炎克雷伯菌肺炎亞種3株（占7.32%），弗氏檸檬酸桿菌4株（占9.76%），不可識別2株（占4.88%）。梧州市、永福縣和桂平市分離到的嗜水氣單胞菌菌株數(shù)分別占分離菌株數(shù)的23.08%、76.92%和26.67%（表1）。

17株嗜水氣單胞菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落圓形且略隆起，菌落表面濕潤、邊緣整齊、半透明、乳白色，菌落直徑約1.00～1.98 mm。菌體為革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓，長約0.85 μm，排列形式為單個或者成對。經(jīng)兔血培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果，除YF13菌株無溶血性外，其余菌株均呈β溶血。17株嗜水氣單胞菌的API 20NE生化鑒定結(jié)果見表2。

在表2中，17株嗜水氣單胞菌的API陽性代碼值除YF30菌株為5577754、GP32菌株為7777754外，其余菌株均為7577754。

2.2 人工感染結(jié)果

2.2.1 無菌濾液人工感染結(jié)果 無菌濾液經(jīng)36 ℃、24 h的涂布培養(yǎng)無細菌生長。人工感染無菌濾液后經(jīng)15 d的連續(xù)觀察，試驗組與對照組的黃顙魚均未出現(xiàn)病癥和死亡現(xiàn)象，表明所采集的發(fā)病樣本因病毒引起的可能性不大。

2.2.2 17株嗜水氣單胞菌的人工感染結(jié)果 17株嗜水氣單胞菌對健康黃顙魚的人工感染結(jié)果見表3。

從表3可見，2次人工感染試驗結(jié)果，除了YF13無致病力外，其余16株菌株對健康黃顙魚均有很強的致病力，人工感染的平均致病率70.00%～100%，并能復(fù)制出體表、下頜、鰭條、鰭基發(fā)紅，腹腔內(nèi)充滿血色腹水，腸道和胃發(fā)紅，部分病魚肛門紅腫等與自然發(fā)病相似的癥狀，試驗期間對照組無癥狀和死亡現(xiàn)象，表明分離到的17株嗜水氣單胞菌中，除YF13菌株外，其余16株均是引起黃顙發(fā)病死亡的病原菌。

2.3 不同養(yǎng)殖區(qū)域嗜水氣單胞菌的耐藥性比較

17株嗜水氣單胞菌的藥敏試驗結(jié)果見表4。

根據(jù)表4，19種試驗藥物對17株黃顙魚源嗜水氣單胞菌抑菌效果最好的是環(huán)丙沙星、左氟沙星和鹽酸沙拉沙星3種，高度敏感率均為94.12%，其余依次為氟苯尼考（88.24%），恩諾沙星、氧氟沙星和哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（均為82.35%），頭孢他啶和頭孢哌酮鈉（均為76.47%），磺胺二甲嘧啶（58.82%），依諾沙星（47.06%），頭孢拉定和慶大霉素（均為35.29%），新霉素（29.41%），復(fù)方磺胺甲惡唑和磺胺-6-甲氧嘧啶（均為11.76%），新生霉素（5.88%），青霉素G和氨芐青霉素（均為0.00%）；抑菌效果最差的是青霉素G和氨芐青霉素，不敏感率均為100%，其次為頭孢拉定（58.82%），其余依次為，新生霉素（41.18%），磺胺-6-甲氧嘧啶（29.41%），復(fù)方磺胺甲惡唑（17.65%），氟苯尼考（5.88%），頭孢他啶、慶大霉素、新霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、頭孢哌酮鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦鈉、磺胺二甲嘧啶和鹽酸沙拉沙星均為0.00%。

將表4結(jié)果進行統(tǒng)計后，得到不同養(yǎng)殖區(qū)域嗜水氣單胞菌的耐藥性結(jié)果（表5）。

說明：1.表中數(shù)字為抑菌圈直徑（單位：mm）；2.藥敏片直徑5.6 mm；3.抑菌圈直徑d>20 mm判為高度敏感，10 mm

將高敏率達到和超過60%藥物定義為敏感藥物，將不敏感率達到和超過60%藥物定義為不敏感藥物。根據(jù)表5，對3個養(yǎng)殖區(qū)域黃顙魚源嗜水氣單胞菌敏感的藥物梧州市有9種，永福縣10種，桂平市有12種；不敏感藥物梧州市6種，永?？h3種，桂平市2種。對3個養(yǎng)殖區(qū)域黃顙魚源嗜水氣單胞菌都敏感的藥物有頭孢他啶、環(huán)丙沙星、左氟沙星、氧氟沙星、頭孢哌酮鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦鈉、氟苯尼考和鹽酸沙拉沙星8種，都不敏感的藥物只有青霉素G和氨芐青霉素2種。

3 討論

嗜水氣單胞菌是魚類等多種淡水養(yǎng)殖動物細菌性疾病的病原菌，攜帶有hly、Aer、Alt、Act、ahal、ahp 等多種毒力基因[8]，可引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的暴發(fā)性死亡，是目前廣西淡水養(yǎng)殖中常見且危害性大的病原菌之一。本調(diào)查從廣西梧州市、永?？h和桂平市網(wǎng)箱養(yǎng)殖的27批次黃顙魚病樣中分離到的41株菌株中有17株為嗜水氣單胞菌，占分離菌株數(shù)的41.46%，其次為溫和氣單胞菌15株，占36.59，表明廣西梧州市、永?？h和桂平市網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃顙魚細菌性疾病的主要病原菌為嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌。在檢出的17株為嗜水氣單胞菌中，永?？h的檢出率最高，為76.92%，桂平市次之（26.67%），梧州市最低，為23.08%?？梢娛人畾鈫伟怯栏？h網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃顙魚主要的病原菌，但是什么原因?qū)е曼S顙魚源嗜水氣單胞菌在各養(yǎng)殖區(qū)域之間的不均勻分布，尚待從養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖技術(shù)、飼料等諸多因素作進一步的綜合研究。

在本試驗中，除來自永?？h無溶血性的1株嗜水氣單胞菌YF13對健康黃顙魚無致病力外，其余菌株都有很強的致病力，人工感染試驗的平均致死率70.00%～100%?？赡芘c該菌株所攜帶的毒力基因型有關(guān)。根據(jù)劉杰等的研究結(jié)果，黃沙鱉源嗜水氣單胞菌的致病力與其所攜帶的毒力基因型密切相關(guān)，該菌對黃沙鱉的致病力是多個毒力基因共同作用的結(jié)果，只攜帶Alt和ahal 2種毒力基因的菌株對黃沙鱉和小鼠均無致病力，凡攜帶有溶血素基因hly的嗜水氣單胞菌均為有毒株[8]。

藥敏試驗結(jié)果顯示，不同養(yǎng)殖區(qū)域的黃顙魚源嗜水氣單胞菌對藥物的敏感也存在差異，對黃顙魚源嗜水氣單胞菌敏感的藥物種類和數(shù)量在梧州市、永?？h和桂平市3個養(yǎng)殖區(qū)域也不盡相同。產(chǎn)生這一差異的原因可能與不同養(yǎng)殖區(qū)域的用藥習(xí)慣不同有關(guān)。已知病原菌長期接觸某種藥物后會對該藥物產(chǎn)生很強的耐藥性[9-10]，因此，在生產(chǎn)實踐中對嗜水氣單胞菌等細菌引起的水產(chǎn)動物疾病進行防治時，應(yīng)避免長時間選擇用同一種藥物，以免病原菌對該藥物產(chǎn)生耐藥性。值得關(guān)注的是，環(huán)丙沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖中屬于違禁藥物，而在實際生產(chǎn)過程中，偶有發(fā)現(xiàn)少數(shù)養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖魚類出現(xiàn)全身性發(fā)紅或暴發(fā)性死亡時仍將環(huán)丙沙星作為首選藥物，這些養(yǎng)殖者的使用理由是“此藥效果好”。本試驗將環(huán)丙沙星列入藥敏試驗藥物，主要是想印證“此藥效果好”的說法。從藥敏試驗結(jié)果可以看出，環(huán)丙沙星對嗜水氣單菌確實有很好的殺菌效果，但畢竟這是水產(chǎn)違禁藥物，所以建議廣大養(yǎng)殖從業(yè)者在對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物進行疾病防治時自覺遵守國家的相關(guān)法規(guī)，為了食品安全，不使用違禁藥物。政府的相關(guān)部門加強對亂用、濫用藥物行為的監(jiān)管和處罰力度。

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