潘訓(xùn)彬+張秀霞+冼健安

摘 要：氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的常見毒性污染物之一，為探討氨氮對紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）血細(xì)胞的細(xì)胞毒性機(jī)制，研究了氨氮脅迫作用下紅螯螯蝦血細(xì)胞凋亡狀態(tài)的變化。以17.6 mg/L氨氮對紅螯螯蝦幼蝦進(jìn)行急性脅迫，于脅迫后的0、48、72和96 h取血淋巴，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定血細(xì)胞總數(shù)（THC）、胞內(nèi)游離Ca2+含量、線粒體膜電位（MMP）和血細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，紅螯螯蝦的THC在脅迫的72 h開始有顯著的下降，在96 h時達(dá)到最低值；血細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+含量在48 h開始有顯著的升高，在96 h達(dá)到最高值；血細(xì)胞MMP在72 h開始有顯著的下降，在96 h達(dá)到最低值；血細(xì)胞凋亡率在72 h開始有顯著的升高，在96 h時達(dá)到最高值，為9.39%。這些結(jié)果表明，胞內(nèi)游離Ca2+含量是對氨氮脅迫最為敏感的指標(biāo)；氨氮急性脅迫誘導(dǎo)紅螯螯蝦血細(xì)胞發(fā)生了Ca2+參與調(diào)節(jié)、線粒體通路相關(guān)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致了THC的下降。

關(guān)鍵詞：氨氮；紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）；血細(xì)胞；凋亡；流式細(xì)胞術(shù)

中圖分類號：X503.225文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，水體氨氮主要來源于水產(chǎn)動物的氮代謝排泄物以及糞便和殘餌的氨化作用[1]。眾多研究表明，氨氮對水產(chǎn)動物具有較強(qiáng)的毒性[2-4]。隨著養(yǎng)殖時間的延長，氨氮容易不斷地積累于水環(huán)境中，從而對養(yǎng)殖水產(chǎn)動物產(chǎn)生脅迫毒害作用。目前，氨氮對紅螯螯蝦毒性影響的研究仍甚少，主要集中在半致死濃度以及氨氮對生理生化的影響上[5-6]。蝦類等甲殼動物依賴先天性免疫進(jìn)行免疫防御，其中血細(xì)胞在細(xì)胞免疫和體液免疫過程中具發(fā)揮十分重要的作用。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究氨氮對紅螯螯蝦血細(xì)胞凋亡的影響，探討氨氮對紅螯螯蝦血細(xì)胞的細(xì)胞毒性以及氨氮的免疫抑制作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究如何提高紅螯螯蝦的抗氨氮脅迫能力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）購自海南省瓊海市某養(yǎng)殖場，平均體重為（15.16±2.69）g，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下進(jìn)行馴養(yǎng)，水體環(huán)境條件為：pH 7.9～8.0，溫度24±2℃，一直保持曝氣。馴養(yǎng)一周后，選取健康無病患、附肢完整、處于蛻皮間期且反應(yīng)靈敏的螯蝦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 氨氮脅迫

本研究組之前的試驗(yàn)結(jié)果顯示，氨氮對紅螯螯蝦幼蝦的安全濃度為8.8 mg/L，根據(jù)這一結(jié)果以及實(shí)際養(yǎng)殖水體情況，本試驗(yàn)設(shè)定的氨氮脅迫濃度為17.6 mg/L，以NH4Cl作為氨氮的來源進(jìn)行配制，不添加組作為對照組。試驗(yàn)在塑料儲物箱中進(jìn)行，每箱放置30 L水和幼蝦12尾，每組設(shè)置3個平行。試驗(yàn)期間不投喂，保持曝氣。為保證水體的氨氮濃度穩(wěn)定，預(yù)先配制17.6 mg/L氨氮的水，每24 h換水一次。于試驗(yàn)的0，48，72和96 h取樣測定。

1.3 血細(xì)胞懸液的制備

用2.5 mL一次性注射器吸取400 μl預(yù)冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH 7.5），然后從蝦的圍心腔抽取等量的血淋巴。取稀釋血淋巴200 μL，直接用于血細(xì)胞總數(shù)（THC）的測定，余下的稀釋血淋巴用預(yù)冷的抗凝劑進(jìn)一步稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106個/mL，制得血細(xì)胞懸液，用于其它流式細(xì)胞術(shù)指標(biāo)的測定。每尾蝦的血淋巴作為一個單獨(dú)樣品進(jìn)行檢測。

1.4 血細(xì)胞總數(shù)（Total haemocyte count，THC）

商品試劑SYBR GreenI（Sigma）的DMSO（二甲基亞砜）溶液的濃度為10 000×，以DMSO稀釋為1 000×的工作液。分別取稀釋血淋巴200 μL，加入2 μL SYBR GreenI工作液，使終濃度為10×，室溫避光孵育60 min，經(jīng) 200目篩網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACSCalibur）檢測，每個樣品上樣1 min。以第一熒光通道（FL1）獲取SYBR GreenI的綠色熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度大小劃分細(xì)胞碎片區(qū)域與完整細(xì)胞區(qū)域（完整細(xì)胞因包含完整的核酸，結(jié)合SYBR GreenI后發(fā)出強(qiáng)的綠色熒光，非細(xì)胞顆?；蚣?xì)胞碎片沒有核酸或核酸量少，SYBR GreenI結(jié)合量少，因而熒光強(qiáng)度弱），分析并記錄完整細(xì)胞的個數(shù)，每個樣品讀取3次。根據(jù)公式計(jì)算THC[7]。

1.5 胞內(nèi)游離Ca2+含量

分別取血細(xì)胞懸液200 μL，加入終濃度為10 μmol/L的Fluo-3/AM（Sigma），室溫避光孵育60 min，經(jīng) 200目篩網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測。以FL1獲取Fluo-3的綠色熒光強(qiáng)度，以FL1為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)作單參數(shù)直方圖，細(xì)胞的Fluo-3平均熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)游離Ca2+含量成正比。

1.6 線粒體膜電位（MMP）

分別取血細(xì)胞懸液200 μL，加入終濃度為2 mmol/L的DIOC6（Sigma），室溫避光孵育10 min，經(jīng) 200目篩網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測。以FL1獲取DIOC6的綠色熒光強(qiáng)度，以FL1為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)作單參數(shù)直方圖，每個樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個，細(xì)胞的DIOC6平均熒光強(qiáng)度與MMP成正比。

1.7 血細(xì)胞凋亡率

以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（Invitrogen）測定血細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書的步驟稍作調(diào)整來進(jìn)行。取血細(xì)胞懸液600 μL，以800g，4℃離心10min，棄上清后，細(xì)胞沉淀重懸于1 x Annexin V結(jié)合緩沖液中，使細(xì)胞濃度約為3 × 106 個/mL，每100 μL血細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液，避光染色15 min后加入400 μL 1 x Annexin V結(jié)合緩沖液，200目篩網(wǎng)過濾后立即上流式細(xì)胞儀檢測。以FL1獲取FITC的綠色熒光強(qiáng)度，以FL2獲取PI的橙紅色熒光強(qiáng)度，以FL1為橫坐標(biāo)、FL2為縱坐標(biāo)作雙參數(shù)散點(diǎn)圖，用十字門劃分各類細(xì)胞的區(qū)域（右下象限為前期凋亡細(xì)胞，右上象限為后期凋亡和死亡細(xì)胞，凋亡率為右下象限和右上象限的細(xì)胞所占的比例），每個樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個，分析凋亡細(xì)胞所占的比例。endprint

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果顯示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05確認(rèn)為差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞總數(shù)

如圖1所示，對照組螯蝦的THC為7.91×106～8.72×106個/mL。氨氮脅迫48 h時，螯蝦THC沒有顯著變化（P>0.05）；脅迫72 h時，與對照組相比，脅迫組螯蝦的THC開始顯著下降（P<0.05），在96 h時達(dá)到最低值，為3.46×106個/mL；在脅迫120 h時，THC有所恢復(fù)，但仍顯著低于對照組（P<0.05）。

2.2 胞內(nèi)游離Ca2+含量

如圖2所示，與對照組相比，脅迫組螯蝦血細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+含量在48 h開始有顯著的上升（P<0.05）；在96 h時達(dá)到了最高值，為對照組的2.82倍；在120 h有一定的下降，但仍顯著高于對照組（P<0.05）。

2.3 線粒體膜電位

如圖3所示，與對照組相比，脅迫組螯蝦血細(xì)胞MMP在72 h開始有顯著的下降（P<0.05）；在96 h時達(dá)到最低值，為對照組的48.9%；在120 h有一定的恢復(fù)，但仍顯著低于對照組（P<0.05）。

2.4 血細(xì)胞凋亡率

如圖4所示，對照組螯蝦的血細(xì)胞凋亡率為2.46%～2.86%。與對照組相比，脅迫組螯蝦的血細(xì)胞凋亡率在72 h時開始有顯著的提高（P<0.05）；在96 h達(dá)到最高值，為9.39%；在120 h下降為7.01%，但仍顯著高于對照組（P<0.05）。

3 討論

血細(xì)胞在蝦類等甲殼動物的免疫過程中發(fā)揮著重要的作用，因此THC常作為體現(xiàn)蝦類免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。各種環(huán)境因子的脅迫作用均會導(dǎo)致蝦類THC的顯著下降，從而對蝦類的免疫功能產(chǎn)生了抑制作用[8-9]。還有研究認(rèn)為，THC下降到一定的閾值時會導(dǎo)致蝦類的死亡[10]。因此，環(huán)境脅迫對THC的影響不容忽視。本研究前期的研究結(jié)果顯示，紅螯螯蝦的氨氮耐受能力較強(qiáng)，其幼蝦的氨氮安全濃度為8.8 mg/L，為使脅迫作用明顯，本試驗(yàn)設(shè)置了2倍的安全濃度作為脅迫濃度。以往的研究顯示，氨氮脅迫會導(dǎo)致凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[11]、日本對蝦（Penaeus japonicus）[12]、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[13]、日本沼蝦（M.nipponense）[14]、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）[15]等蝦類的THC的下降。本研究結(jié)果也顯示，氨氮脅迫導(dǎo)致了紅螯螯蝦THC的顯著下降。也有研究得出了相反的結(jié)論，其研究結(jié)果顯示氨氮脅迫對羅氏沼蝦的THC沒有顯著影響[16]，但比較可發(fā)現(xiàn)，這一相反結(jié)果可能與該研究所設(shè)置的氨氮濃度以及取樣時間有關(guān)。該研究設(shè)置的氨氮濃度較低，為0.55～3.18 mg/L，可能對血細(xì)胞沒有產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性作用；該研究的取樣時間點(diǎn)僅為脅迫的第7天，取樣時間點(diǎn)太少，可能導(dǎo)致錯過了顯著影響的時期，本研究結(jié)果顯示，在脅迫48 h時THC沒有顯著變化，72 h時THC才開始顯著下降，96 h時達(dá)到了最低值，而120 h時有一定的恢復(fù)，這些結(jié)果表明氨氮對THC的影響與脅迫時間有密切的關(guān)系。

亞硝酸鹽、重金屬等脅迫作用的研究報(bào)道顯示，血細(xì)胞數(shù)量的減少與血細(xì)胞被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡有關(guān)[8-9]。高濃度氨氮脅迫會誘導(dǎo)中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）血細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase的表達(dá)量的顯著升高[17]。本研究結(jié)果顯示，氨氮脅迫72 h開始，紅螯螯蝦血細(xì)胞凋亡率有顯著的升高，在120 h時，凋亡率有所下降，這些結(jié)果與THC的結(jié)果吻合，表明氨氮脅迫誘導(dǎo)了血細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致THC的下降。胞內(nèi)游離Ca2+含量的升高以及MMP的下降是細(xì)胞凋亡的兩個典型事件。在細(xì)胞凋亡的前期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等Ca2+庫受到損傷，其儲存的Ca2+被大量釋放到細(xì)胞質(zhì)中，造成胞質(zhì)內(nèi)的游離Ca2+含量的迅速升高，游離Ca2+含量會進(jìn)一步促進(jìn)其它凋亡事情的發(fā)生[18]。本研究結(jié)果顯示，氨氮脅迫48 h開始，血細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+含量已出現(xiàn)顯著的升高，此時THC、凋亡率和MMP仍未發(fā)生顯著的變化，表明胞內(nèi)游離Ca2+含量是對氨氮脅迫最為敏感的指標(biāo)，同時也表明氨氮所誘導(dǎo)的血細(xì)胞凋亡是一個Ca2+參與調(diào)節(jié)的凋亡過程。由于質(zhì)子泵存在于線粒體內(nèi)膜，可將線粒體基質(zhì)中的質(zhì)子泵入膜間隙，線粒體內(nèi)膜兩側(cè)形成的跨膜電位則MMP。正常的MMP是線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP所必需的。細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，造成了MMP的下降，一些凋亡因子被釋放到胞質(zhì)中，誘導(dǎo)其它凋亡事件的進(jìn)一步發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，氨氮脅迫可造成紅螯螯蝦血細(xì)胞MMP的顯著下降，這一結(jié)果與凋亡率的結(jié)果吻合，表明氨氮所誘導(dǎo)的血細(xì)胞凋亡是線粒體通路相關(guān)的細(xì)胞凋亡。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，氨氮脅迫作用對紅螯螯蝦血細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，氨氮誘導(dǎo)血細(xì)胞發(fā)生了Ca2+參與調(diào)節(jié)、線粒體通路相關(guān)的凋亡，從而導(dǎo)致THC的下降。THC的下降可能引起螯蝦免疫力的下降，使螯蝦更容易受到病原體的感染，因此在養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意加強(qiáng)對水體氨氮含量的控制，在氨氮積累較為嚴(yán)重的養(yǎng)殖后期，更應(yīng)注意預(yù)防疾病的爆發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 冼健安，錢坤，郭慧，等.氨氮對蝦類毒性影響的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè)，2014，35（22）：52-58.

[2] 李建，姜令緒，王文琪，等.氨氮和硫化氫對日本對蝦幼體的毒性影響[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，16（1）：22-27.

[3] 胡賢德，孫成波，蔡鶴翔，等.不同鹽度條件下氨氮對斑節(jié)對蝦的毒性試驗(yàn)[J].廣西科學(xué)，2009，16（2）：206-209.endprint

[4] 梁俊平，李健，李吉濤，等.氨氮對脊尾白蝦幼蝦和成蝦的毒性試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué)，2012，31（9）：526-529.

[5] 陳孝煊，吳志新，熊波.澳大利亞紅螯螯蝦對水中氨氮濃度耐受性的研究[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，1995，22（1）：14-16.

[6] 蔣琦辰，顧曙余，張文逸，等.氨氮急性脅迫及其毒后恢復(fù)對紅螯光殼螯蝦幼蝦相關(guān)免疫和代謝指標(biāo)的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37（7）：1066-1072.

[7] 冼健安，張秀霞，郭慧，等.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測蝦類的血細(xì)胞總數(shù)方法的建立[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2015，36（3）：89-94.

[8] Xian J A，Wang A L，Chen X D，et al.Cytotoxicity of nitrite on haemocytes of the tiger shrimp，Penaeus monodon，using flow cytometric analysis[J].Aquaculture，2011，317：240-244.

[9] Xian J A，Wang A L，Ye C X，et al.Phagocytic activity，respiratory burst，cytoplasmic free-Ca2+ concentration and apoptotic cell ratio of haemocytes from the black tiger shrimp，Penaeus monodon under acute copper stress[J].Comparative Biochemistry and Physiology C，2010，152：182-188.

[10] Lorenzon S，F(xiàn)rancese M，Smith V J，et al.Heavy metal affect the circulating haemocyte number in the shrimp Palaemon elegans[J].Fish & Shellfish Immunology，2001，11：459-472.

[11] 姜令緒，潘魯青，肖國強(qiáng).氨氮對凡納對蝦免疫指標(biāo)的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2004，11（6）：537-541.

[12] Jiang G，Yu R，Zhou M.Modulatory effects of ammonia-N on the immune system of Penaeus japonicus to virulence of white spot syndrome virus[J].Aquacluture，2004，241：61-75.

[13] 胡義波，王玥，姜乃澄.氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮對羅氏沼蝦血細(xì)胞及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2005，32（6）：691-697.

[14] 張亞娟，劉存歧，王軍霞，等.氨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮對日本沼蝦血細(xì)胞數(shù)量及血藍(lán)蛋白含量的影響[J].四川動物，2008，27（5）：853-854.

[15] 朱毅菲.不同濃度氨氮、不同低pH突變對克氏原螯蝦免疫功能的影響[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

[16] Chen W，Chen J C.The virulence of Enterococcus to freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii and its immune resistance under ammonia stress[J].Fish & Shellfish Immunology，2002，12：97-109.

[17] 王蕓.pH、氨氮脅迫對中國對蝦細(xì)胞凋亡和抗氧化系統(tǒng)影響機(jī)理的研究[D].上海海洋大學(xué)博士畢業(yè)論文.2011.

[18] 郭靜，蒲詠梅，張東才.鈣離子信號與細(xì)胞凋亡[J].生物物理學(xué)報(bào)，2005，21（1）：1-18.

[19] 石靜，卿晨.線粒體膜電位改變與細(xì)胞凋亡[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011（7）：20-21.endprint