趙玉紅， 李 欣， 李小菊， 周 浩， 李登文， 石建黨， 張金紅， 趙立青

(南開大學 生物實驗教學中心， 天津 300071)

“動物組織中DNA的分離提取及含量測定”實驗教學改革

趙玉紅， 李 欣， 李小菊， 周 浩， 李登文， 石建黨， 張金紅， 趙立青

(南開大學 生物實驗教學中心， 天津 300071)

對經(jīng)典生物化學實驗項目“動物組織中DNA的分離提取及含量測定”實驗進行改革。在傳統(tǒng)濃鹽法提取基因組DNA、二苯胺法檢測DNA含量的實驗基礎上，新增試劑盒方法提取DNA以及超微量分光光度計檢測DNA兩大現(xiàn)代實驗技術內(nèi)容，對經(jīng)典實驗進行拓展、升級。此外，針對實驗中比色杯污染影響檢測結(jié)果精密度和準確性的困擾難題，提出2種簡便易行的清洗方法，提高實驗數(shù)據(jù)的真實性和有效性。

實驗教學改革； DNA提??； DNA檢測

DNA的分離提取是分子生物學研究最基礎的技術，DNA的提取質(zhì)量直接影響到PCR擴增基因片段、限制性酶切分析以及基因測序等下游實驗的成敗[1]?！皠游锝M織中DNA的分離提取及含量測定”是目前國內(nèi)高校普遍開設的經(jīng)典生物化學實驗項目，在保留原有濃鹽法提取基因組DNA、二苯胺法檢測DNA含量的基礎上，新增目前廣泛使用的商品化試劑盒進行DNA的提取、采用超微量分光光度計檢測DNA的實驗內(nèi)容。此外，針對實驗中比色杯污染嚴重影響檢測結(jié)果精密度和準確性的難題，經(jīng)反復實驗探索，提出2種簡便易行的清洗解決方法。

1 實驗教學改革

“動物組織中DNA的分離提取及含量測定”實驗在傳統(tǒng)教學中存在幾大問題：

(1) 實驗項目獨立開設，學生的思維僅局限于本實驗原理和技術的掌握，缺少對相關知識聯(lián)系和技術整合的意識和能力；

(2) DNA提取及含量檢測技術發(fā)展迅速，而傳統(tǒng)教學中采用的實驗技術、手段相對落后，學生的學習積極主動性不高；

(3) 實驗數(shù)據(jù)多為“正結(jié)果”，學生缺少反思的“原動力”，不利于學生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題能力的培養(yǎng)；

(4) DNA與二苯胺反應產(chǎn)生的藍色不易退色，極易造成比色皿的污染，嚴重影響實驗檢測結(jié)果的精密度和準確性，不利于學生對實驗結(jié)果作出科學的分析。

這些問題嚴重影響了實驗教學效果，亟須改革。

1.1 實驗內(nèi)容的拓展、升級

(1) 基因組DNA的提取。分別采用濃鹽法(根據(jù)參考書《生物化學習題及實驗技術》[2])、試劑盒法(參照Solarbio動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒說明書)2種方法，提取動物肝臟組織中的基因組DNA。

(2) DNA濃度檢測。①采用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測濃鹽法和試劑盒法2種提取方法獲得的DNA樣品濃度，計算DNA的提取率。此外，根據(jù)A260/A280的比值，還可以判斷提取DNA的純度。②利用二苯胺法檢測DNA含量，根據(jù)標準曲線，計算DNA的提取率。

1.2 比色杯清洗方法的改進

DNA在酸性條件下加熱，可與二苯胺反應生成一種藍色的復合物，595 nm波長下具有強烈的吸收。在一定濃度范圍內(nèi)，所成顏色的深淺與DNA的量之間有線性關系，可采用比色法測定樣品中DNA的含量，這是目前許多高校本科生物化學實驗教學中檢測DNA含量常用的經(jīng)典二苯胺法。但是，DNA與二苯胺產(chǎn)生的藍色不易退色，極易造成比色皿的污染，導致嚴重影響實驗檢測結(jié)果的精密度和準確性，以及大大降低比色杯的重復利用率，給正常的實驗教學帶來很大的困擾。為有效解決DNA與二苯胺反應物所污染比色杯的清洗難題，提高實驗數(shù)據(jù)的真實性和有效性，提出2種簡便易行的清洗方法。

(1) 新使用比色杯的清洗。①盛放DNA與二苯胺反應物的比色杯使用完畢后，立即清水沖洗；②放在盛有雙氧水的器皿中浸泡至少1小時；③依次用清水、蒸餾水沖洗干凈，自然晾干。

(2) 已污染比色杯的清洗。①用雙氧水和氨水，以1∶1的比例，反復浸泡3～4次，浸泡時間以雙氧水和氨水反應完畢為準；②污染嚴重的，用雙氧水和氨水浸泡3～4次以后，用雙氧水浸泡3～4天，繼續(xù)用雙氧水和氨水(比例1∶1)浸泡至污染完全消逝；③依次用清水、蒸餾水沖洗干凈，自然晾干。

2 教學改革探討

2.1 合理構建實驗內(nèi)容

雖然濃鹽法提取DNA技術手段上相對傳統(tǒng)，而二苯胺法檢測DNA含量靈敏度不高，兩者目前在科研實踐中都應用較少，但是建議保留這2部分傳統(tǒng)的實驗教學內(nèi)容，理由如下：

(1) 試劑盒法提取DNA雖然簡便、快速，提取的DNA純度高、應用廣泛，但是就實驗教學效果而言，有待商榷。因為受專利保護等因素，試劑盒中的許多試劑僅以溶液A、溶液B、漂洗液、洗脫液等字眼來標記，并不給出每種試劑的具體成分。對于學生來講，試劑盒方法對于實驗原理、研究思路的掌握收效甚微，即使教師指出每種溶液可能的成分及其作用，但是在具體實驗過程中學生關注的重點更多的是操作，不利于學生對原理知識以及研究思路的掌握。而濃鹽法提取DNA對于學生掌握DNA提取的基本原理和基本研究思路非常有“教科書”意義，因此很有必要保留這一經(jīng)典、傳統(tǒng)實驗教學內(nèi)容。

(2) 二苯胺法檢測DNA含量的實質(zhì)是利用了標準曲線的方法，而標準曲線法是一種簡便、快速的定量分析方法。很多生物學實驗中均需要繪制標準曲線[3]，譬如酶聯(lián)免疫法檢測黃曲霉毒素B1的標準曲線擬合分析[4]、CYP4F2和β—action基因?qū)崟r熒光定量PCR標準品質(zhì)粒和標準曲線的構建[5]、構建cRNA為標準曲線定量檢測柑橘碎葉病毒的方法[6]、柱前衍生RP-HPLC法測定狗尾草種子氨基酸含量[7]等都是標準曲線法在生命科學研究中的具體應用。因此有必要保留二苯胺法檢測DNA含量的實驗，培養(yǎng)學生熟練掌握標準曲線法這一重要的基本科研方法。

考慮到基礎課的課時限制并結(jié)合實驗課目標，可以在保留原有濃鹽法提取基因組DNA、二苯胺法檢測DNA含量的基礎上，新增目前廣泛使用的商品化試劑盒進行DNA的提取，采用超微量分光光度計檢測DNA的實驗內(nèi)容，這是對本實驗進行創(chuàng)新改革的最佳方案。

改革后的實驗教學體現(xiàn)學科發(fā)展前沿，內(nèi)容更為豐富，涉及的實驗技能更多。學生通過課程學習，能夠深入理解、掌握并運用DNA提取及含量測定的相關理論和技術，能夠分析和處理實際問題[8]。

2.2 實驗結(jié)果與分析

實驗結(jié)果與分析是科研工作中最重要的一個環(huán)節(jié)，但許多學生往往重結(jié)果而輕分析，通常，數(shù)據(jù)不好就羅列出一系列可能的操作失誤，至于哪一個起決定性作用、是如何影響數(shù)據(jù)結(jié)果的、理論上為何如此，一概不想[9]。為加強學生實驗結(jié)果與分析能力培養(yǎng)，鍛煉學生對實驗結(jié)果作出更有針對性地、深入地分析討論，充分利用改革后的實驗教學優(yōu)勢進行適當引導，要求學生在實驗報告中包含、體現(xiàn)以下2大實驗結(jié)果與分析的內(nèi)容：

(1) 濃鹽法和試劑盒法2種方法提取的基因組DNA效果比較。設計表格見表1(空白表)，對濃鹽法和試劑盒法2種方法提取的基因組DNA效果進行比較，并總結(jié)2種提取方法的優(yōu)缺點。

表1 濃鹽法和試劑盒法2種方法提取的基因組DNA效果比較

(2) 超微量分光光度計和二苯胺法檢測DNA質(zhì)量的效果比較。設計幾個問題：超微量分光光度計和二苯胺法檢測DNA含量的結(jié)果是否一致？導致檢測結(jié)果不一致的因素可能有哪些？2種檢測方法各有什么優(yōu)缺點？影響DNA提取質(zhì)量的因素有哪些？如何對DNA進行純度鑒定？

2.3 課程組織

(1) 尊重和滿足不同學生的學習需求，新增內(nèi)容為選修部分。學生可自主選擇做，還是不做，選擇結(jié)果提前2周告知教師，方便實驗準備。

(2) 按照教學計劃，本實驗為8學時。為了在盡量不增加課時的情況下實現(xiàn)實驗內(nèi)容的拓展，采取了充分利用實驗間隙穿插進行實驗的策略。首先采用試劑盒方法提取基因組DNA，在用酶消化的近2 h里，用濃鹽法進行DNA的制備，此后由學生按照進度來自主安排實驗；其次DNA提取完畢后，學生先用二苯胺法檢測濃鹽法提取的DNA含量，再用超微量分光光度計檢測2種方法提取的DNA濃度和純度。

3 改革成效

相比于傳統(tǒng)的實驗教學，改革后的實驗教學取得了良好的教學效果。

3.1 引入對比教學法，提高教學效果

(1) 將濃鹽法與試劑盒法2種方法提取的基因組DNA效果以及二苯胺法與超微量分光光度法2種方法測得的DNA數(shù)據(jù)結(jié)果進行關聯(lián)和比較，要得到科學、可靠的結(jié)論需要學生查閱數(shù)量不少的相關文獻資料，有利于引導學生跳出課本思維，促進學生多角度、深入地思考問題，并有助于培養(yǎng)學生在不同知識的關聯(lián)和比較中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力。

(2) 不同物種、不同材料的DNA提取方法不一樣[10]，通過對比學習，學生對于實驗原理掌握得更為透徹，對于不同提取方法提取的DNA濃度、純度、穩(wěn)定性及其影響因素等方面有了更為清晰的認識，并形成舉一反三、融會貫通的科學思維方式，為今后從事科研工作奠定堅實的基礎。

(3)以往實驗教學中，學生只要按部就班，操作上即使不是非常規(guī)范也會得到“正結(jié)果”。而改革后，通過對2種提取方法所得結(jié)果進行對比分析，學生會深刻意識到規(guī)范操作是影響實驗結(jié)果的重要因素之一，進而樹立進一步規(guī)范操作的意識。

3.2 教學聯(lián)系科研，激發(fā)學生學習興趣

以往DNA提取結(jié)束后，即用二苯胺法檢測DNA含量，實驗相對孤立，學生大多認為只要提取到DNA即可，至于提取的純度和濃度如何無關緊要，因而實驗的積極性不是很高。但是改革后，利用超微量分光光度計，不僅可以檢測DNA含量，還可以鑒定DNA的純度，一個相對孤立的實驗轉(zhuǎn)化成了生物化學與分子生物學實驗之間的銜接橋梁。DNA的提取質(zhì)量對于分子生物學實驗結(jié)果具有重要影響[7，11-12]，學生的實驗結(jié)果不再是微不足道，而是變得非常有意義，這大大激發(fā)了學生的學習熱情。此外，改革后采用了試劑盒、超微量分光光度計等與科研實際接軌的實驗技術、手段，學生參與的興趣明顯提高。

3.3拓展和延伸內(nèi)容單薄、孤立的實驗項目

改革后的實驗教學具有更多的“點”，譬如：①濃鹽法和試劑盒法提取DNA的原理各是什么？分別有什么優(yōu)缺點？②二苯胺法和超微量分光光度計檢測DNA含量的結(jié)果是否一致？導致檢測結(jié)果不一致的因素可能有哪些？2種檢測方法各有什么優(yōu)劣？③2種提取方法中，影響DNA提取純度的因素各有哪些？學生通過對這些“點”進行剖析，對“點-點”間的相關知識進行整合、類比和歸納，利于以點帶面構建起豐富的知識體系。

3.4 比色杯清洗

對比色杯，尤其是已污染比色杯的清洗(見圖1)，有效解決了因DNA與二苯胺反應物污染所造成的測量誤差，提高了實驗數(shù)據(jù)的真實性、有效性，有助于學生對實驗結(jié)果的合理性進行分析，提高教學效果。

圖1 已污染比色杯的清洗

4 結(jié)語

“動物組織中DNA的分離提取及含量測定”實驗教學改革，在生物伯苓班小班授課中已成功運行2輪，教學效果良好，目前正在向普通班推廣實施。改革后的實驗教學優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：(1) 理論聯(lián)系實際，有利于學生加深理論知識的理解和學以致用；

(2) 引入生物化學新技術、新方法，有利于學生了解學科前沿；

(3) 以人為本，尊重和滿足不同學生的學習需求。

改革后的實驗課整體教學水平得到顯著提升，更有利于學生科研能力和綜合素養(yǎng)的培養(yǎng)。

References)

[1] 王丹，鄧春青，趙龍鳳.兩種外周血 DNA提取方法的比較[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015，15(6):1138-1140.

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Experimental teaching reform on “Isolation, Extraction and Content Determination of DNA in Animal Tissues”

Zhao Yuhong, Li Xin, Li Xiaoju, Zhou Hao, Li Dengwen, Shi Jiandang, Zhang Jinhong, Zhao Liqing

(Biological Experimental Teaching Center， Nankai University， Tianjin 300071， China)

The reform is carried out on the classical biochemical experiment, i.e., Isolation, Extraction and Content Determination of DNA in Animal Tissues. On the basis of the traditional concentrated salt method of extracting genomic DNA and the diphenylamine method of detecting the DNA content, the two major modern experimental technical contents are newly added, i.e., the reagent kit method is used to extract DNA and the ultra micro spectrophotometer is used to detect DNA, which has expanded and upgraded the classical experiment. In addition, in view of the problem in the experiment that the colorimetric cup contamination affects the precision and accuracy of the detection results, two simple and convenient cleaning methods are put forward to improve the authenticity and validity of the experimental data.

experimental teaching reform; DNA extraction; DNA detection

10.16791/j.cnki.sjg.2017.11.053

Q5-33；G642.423

A

1002-4956(2017)11-0214-03

2017-04-11

國家基礎學科人才培養(yǎng)基金“條件建設項目”(J1310003)；南開大學2014年教學改革項目

趙玉紅(1981—)，女，山東青島，碩士，實驗師，從事生物化學和分子生物學實驗教學工作

E-mailzyh@mail.nankai.edu.cn

趙立青(1962—)，女，云南洱源，博士，教授，從事蛋白質(zhì)結(jié)構與功能研究以及基于蛋白質(zhì)結(jié)構的工程應用.

E-maillqzhao@nankai.edu.cn