鄭秀文， 崔 鵬， 石嘉偉， 楊靜靜， 陳敏敏， 鄭 瑤， 許 玲， 劉宏波

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018）

水稻OsZFP互作蛋白的篩選與鑒定

鄭秀文1， 崔 鵬1， 石嘉偉1， 楊靜靜1， 陳敏敏2， 鄭 瑤2， 許 玲2， 劉宏波1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018）

CCHC型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白OsZFP參與調(diào)控水稻Oryza sativa側(cè)根的生長發(fā)育，但其相關(guān)互作蛋白及調(diào)控機制未知。以水稻 ‘日本晴’ ‘Nipponbare’為試驗材料，克隆了OsZFP基因，利用EcoRI和SalI酶切位點構(gòu)建酵母雙雜交釣餌表達(dá)載體pGBKT7+OsZFP，驗證該表達(dá)載體對酵母菌株Y2H無毒性及報告基因自激活現(xiàn)象；采用酵母雙雜交技術(shù)，從已構(gòu)建的水稻cDNA文庫中篩選到1個陽性互作蛋白，經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（NCBI）同源性比對，鑒定為含有T-complex polypeptide 1（TCP-1）結(jié)構(gòu)域的分子伴侶蛋白第7個亞基（Os06g0687700），命名為chaperonin containing TCP-1 eta subunit（CCT-eta），進而通過酵母一對一回復(fù)驗證該互作蛋白。基于CCT-eta亞基與OsZFP蛋白互作，推測分子伴侶蛋白亞基CCT-eta可能參與調(diào)控水稻側(cè)根的生長發(fā)育。圖4參19

植物學(xué)；水稻；調(diào)控蛋白；載體構(gòu)建；酵母雙雜交；蛋白互作

水稻Oryza sativa是世界上重要的禾本科Gramineae糧食作物之一。據(jù)估計，到2030年，禾本科作物的產(chǎn)量至少需要提高40%才能滿足人口增長所帶來的糧食需求［1］。生長發(fā)育良好的水稻根系不僅使植株適應(yīng)不利的生長環(huán)境，而且還能提高植株對水分和營養(yǎng)的利用率［2］，從而保證結(jié)實率和產(chǎn)量。水稻的種子根只在植株發(fā)育初期起作用，隨后的整個生育期主要通過發(fā)育更為完善和發(fā)達(dá)的側(cè)根和冠根維持生長發(fā)育。因此，發(fā)掘和鑒定調(diào)控水稻側(cè)根和根冠生長發(fā)育的蛋白對水稻根系遺傳發(fā)育及分子調(diào)控機制研究顯得尤為重要。目前，在水稻根系發(fā)育研究中已獲得了一些突變體表型及其調(diào)控側(cè)根和冠根發(fā)育的關(guān)鍵基因，這些基因的功能缺失突變能特異地影響根系的生長發(fā)育和形態(tài)建成［3-5］。水稻側(cè)根通過中柱鞘和內(nèi)皮層細(xì)胞不斷分裂而形成［6］。已有研究表明：真核生物中含鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白能特異結(jié)合DNA，RNA和蛋白質(zhì)，從而參與調(diào)控真核生物細(xì)胞的發(fā)育和凋亡過程及相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑［7-8］。擬南芥Arabidopsis thaliana C1-1i亞族中GIS，GIS2，ZFP8和ZFP5蛋白受赤霉素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)，參與調(diào)控表皮毛的生長發(fā)育及相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑［9-12］；而C1-2i亞族中的Zat6被證實參與調(diào)控種子根的生長發(fā)育和磷酸鹽的吸收［13］。最近，水稻中已鑒定出189個含C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，其中至少26個蛋白響應(yīng)不同的生物脅迫和非生物脅迫［14］。這些研究結(jié)果預(yù)示著含鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白在水稻生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在前期研究中，我們已鑒定到1個水稻調(diào)控側(cè)根生長發(fā)育的C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白。本研究擬利用酵母雙雜交技術(shù)篩選鑒定與該蛋白互作的調(diào)控蛋白，以期為水稻根系生長發(fā)育分子機制的解析奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 釣餌表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)酵母表達(dá)載體pGBKT7多克隆位點及水稻鋅指結(jié)構(gòu)蛋白基因（OsZFP）表達(dá)序列設(shè)計引物，正向： 5′-CGGAATTCATGGCAAGGGAACCAAGTCC-3′（下劃線為 EcoRI酶切位點）， 反向： 5′-ACGCGTCGACCTAAAATGCCTGGCTCCTAA-3′（下劃線為SalI酶切位點）。以本實驗室保存的水稻品種 ‘日本晴’‘Nipponbare’幼苗為試驗材料，對幼苗cDNA進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增，反應(yīng)體系和擴增程序參照文獻(xiàn)［15］稍作修改。目的基因經(jīng)雙酶切回收后連接至酵母表達(dá)載體pGBKT7并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α，重組酵母表達(dá)載體pGBKT7+OsZFP雙酶切驗證后進行單克隆測序。

1.2 釣餌載體毒性和自激活分析

按YeastmakerTMYeast Transformation System 2小量法轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)載體pGBKT7和酵母釣餌表達(dá)載體pGBKT7+OsZFP至50 μL酵母菌株Y2H感受態(tài)細(xì)胞，分別稀釋轉(zhuǎn)化菌液至1/10和1/100，取100 μL酵母表達(dá)載體pGBKT7轉(zhuǎn)化液涂布于SD/-Trp；同時，取100 μL酵母釣餌表達(dá)載體pGBKT7+OsZFP轉(zhuǎn)化液涂布于 SD/-Trp（SDO）， SD/-Trp/X-α-Gal（SDO/X）和 SD/-Trp/X-α-Gal/AbA（SDO/X/A）固體培養(yǎng)基， 30℃培養(yǎng)3～5 d，對比pGBKT7和pGBKT7+OsCYP2兩者轉(zhuǎn)化后酵母單克隆大小，觀察統(tǒng)計結(jié)果，檢測釣餌載體是否對酵母菌株有毒性及是否對報告基因存在自激活現(xiàn)象。

1.3 cDNA文庫篩選

按YeastmakerTMYeast Transformation System 2共轉(zhuǎn)化水稻幼苗cDNA文庫和酵母釣餌表達(dá)載體pGBKT7+OsZFP至600 μL酵母菌株Y2H感受態(tài)細(xì)胞，所有轉(zhuǎn)化菌液全部涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA（DDO/X/A）固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5 d，挑選藍(lán)色單克隆接種至SD/-Leu/-Trp/-His/Ade/X-α-Gal/AbA（QDO/X/A）固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5 d，將藍(lán)色克隆菌株劃線至SD/-Leu/-Trp//X-α-Gal（DDO/X）固體培養(yǎng)基，重復(fù)2～3次，分離陽性互作蛋白。

1.4 互作蛋白的分離和回復(fù)驗證

挑取上述DDO/X固體培養(yǎng)基中分離出來的藍(lán)色單克隆，用酵母質(zhì)粒提取試劑盒（easy yeast plasmid isolation kit）提取釣餌與互作蛋白表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑選單克隆提取質(zhì)粒，送生物公司測序。將分離的互作蛋白表達(dá)質(zhì)粒，與pGBKT7或pGBKT7+OsZFP分別共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H，取100 μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于DDO/X和QDO/X/A固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3 d，回復(fù)驗證陽性互作蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 含OsZFP基因的釣餌載體獲得

PCR擴增OsZFP基因獲得大小為828 bp的目的片段（圖1A），與預(yù)期條帶相符；利用EcoRI和SalI酶切位點酶切酵母表達(dá)載體pGBKT7及目的基因OsZFP（圖1B），T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，提取重組表達(dá)載體后進行雙酶切驗證（圖1C），陽性克隆送生物公司測序驗證。

2.2 釣餌表達(dá)載體毒性及自激活分析

酵母表達(dá)載體pGBKT7和釣餌載體pGBKT7+OsZFP轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布于SDO，SDO/X和SDO/X/A固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5 d。結(jié)果顯示：SDO培養(yǎng)基中，含有pGBKT7與pGBKT7+OsZFP載體的酵母菌株單克隆大小相近（圖2A和2B），表明含有OsZFP基因的釣餌表達(dá)載體對酵母菌株的生長沒有毒性作用；同時，含有pGBKT7+OsZFP載體的酵母菌株在SDO/X固體培養(yǎng)基中呈白色（圖2C），且在SDO/X/A固體培養(yǎng)基中不能生長（圖2D），表明pGBKT7+OsZFP載體在酵母菌株Y2H中無自激活現(xiàn)象，適合互作蛋白的文庫篩選。

圖1 含OsZFP基因的酵母表達(dá)載體構(gòu)建Figure 1 Construction of bait vector which containing OsZFP

圖2 OsZFP基因?qū)湍妇闥2H的毒性及自激活驗證Figure 2 Testing bait vector which contained OsZFP for toxicity and autoactivation

2.3 互作蛋白的篩選與分離

將pGBKT7+OsZFP載體與水稻cDNA文庫共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H感受態(tài)細(xì)胞，涂布于DDO/X/A固體培養(yǎng)基進行篩選；挑選候選陽性單克隆進一步接種至QDO/X/A固體培養(yǎng)基進行篩選。將候選陽性單克?。?3號和87號）轉(zhuǎn)接至DDO/X固體培養(yǎng)基2～3次，篩選分離出藍(lán)色（箭頭所示）陽性單克隆（圖3）。

圖3 候選互作蛋白（83號和87號）在DDO/X固體培養(yǎng)基中的篩選Figure 3 Segregation of candidate positive interactors （blue） from non-interactors （white）

2.4 互作蛋白的分離和回復(fù)驗證

利用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取DDO/X固體培養(yǎng)基中藍(lán)色單克隆表達(dá)質(zhì)粒。將分離互作蛋白表達(dá)載體 pGADT7+83（AD-83）和 pGADT7+87（AD-87）分別與 pGBKT7（BD）或 pGBKT7+OsZFP（BD-ZFP）共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H，涂布于DDO/X和QDO/X/A固體培養(yǎng)基進行篩選。結(jié)果顯示，BD-ZFP/AD-83和87以及BD/AD-83和87共轉(zhuǎn)化后，酵母Y2H均能在DDO/X固體培養(yǎng)基中生長；但是只有BD-ZFP/AD-87共轉(zhuǎn)化后酵母Y2H能在QDO/X/A固體培養(yǎng)基中生長且呈藍(lán)色（圖4），表明87號篩選蛋白可能為陽性互作蛋白。進一步對87號互作蛋白的文庫表達(dá)載體進行測序和同源性比對，鑒定為含有T-complex polypeptide 1（TCP-1）結(jié)構(gòu)域的分子伴侶蛋白第7個亞基（LOC4341893），命名為chaperonin containing TCP-1 eta subunit（CCT-eta）；該基因mRNA全長為2 123 bp，編碼560個氨基酸。

圖4 酵母雙雜交回復(fù)驗證Figure 4 Confirmation of positive interaction by yesat two-hybrid

3 討論

鋅指結(jié)構(gòu)蛋白是一類含有指狀結(jié)構(gòu)域的基因表達(dá)調(diào)控蛋白，依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)中半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)目和順序可以將鋅指結(jié)構(gòu)分為C2H2，C2HC和C2C2等類型。在真核生物中，C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的類型最多，研究也較為深入。水稻基因組中存在189個編碼含有QALGGH保守結(jié)構(gòu)域的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，其中有18個基因是調(diào)控水稻穗發(fā)育，12個是種子特異表達(dá)基因［16］；另外，含有C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)的水稻蛋白ZFP36被證實參與脫落酸誘導(dǎo)的抗氧化防御機制［17］。這些結(jié)果都表明：鋅指結(jié)構(gòu)蛋白廣泛參與調(diào)控水稻的生長發(fā)育及生理生化途徑。

本研究以調(diào)控水稻側(cè)根生長發(fā)育的CCHC型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白為釣餌，通過酵母雙雜交技術(shù)從水稻cDNA文庫中篩選獲得2個互作蛋白；酵母雙雜交一對一回復(fù)驗證顯示BD/AD-87共轉(zhuǎn)化酵母在QDO培養(yǎng)基中不能生長，但BD-ZFP/AD-87能在QDO培養(yǎng)基中生長且呈藍(lán)色（圖4），表明87號蛋白為陽性互作蛋白。另外，BD/AD-83在QDO培養(yǎng)基中呈白色，但BD-ZFP/AD-83共轉(zhuǎn)化酵母在QDO培養(yǎng)基上不能生長，因此，83號篩選蛋白為假陽性。

含有TCP-1結(jié)構(gòu)域的分子伴侶蛋白已被證實在真核生物細(xì)胞中參與蛋白的折疊與復(fù)性［18］。該蛋白至少由8個不同功能亞基組成，各個亞基同源性僅為30%；同時，各個蛋白亞基也含有相對保守的結(jié)構(gòu)域，可能與ATP酶活性相關(guān)［19］。本研究篩選到的編碼CCT蛋白的第7個亞基與C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白存在互作，推測它可能參與鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的折疊與形成，從而調(diào)控水稻根系的生長發(fā)育，其相關(guān)生物學(xué)功能需要通過反向遺傳學(xué)進一步研究。

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Screening and identification of a protein for controlling lateral root development in Oryza sativa

ZHENG Xiuwen1,CUI Peng1,SHI Jiawei1,YANG Jingjing1,CHEN Minmin2,ZHENG Yao2,XU Ling2,LIU Hongbo1
（1.School of Agricultural and Food Sciences,Zhejiang A＆F University,Hangzhou 311300,Zhejiang,China;2.School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,Zhejiang,China）

OsZFP,a CCHC-type zinc finger protein,has reportedly participated in lateral root development in rice.To determine the molecular mechanism and its interacting proteins in a regulated network,the OsZFP gene from Oryza sativa. ‘Nipponbare’ was cloned,and then a yeast bait vector,pGBKT7+OsZFP,was constructed by EcoRI and SalI for cDNA library screening of rice.Results showed no toxicity or autoactivation with transformation of the Y2H strain containing the pGBKT7+OsZFP bait vector.In a yeast two-hybrid assay,a positive interacted protein was obtained and confirmed from the cDNA library.Sequencing and homologous alignment from the National Center for Biotechnology Information （NCBI） showed that the interacting protein（named chaperonin containing a T-complex polypeptide 1 （TCP-1） eta subunit,CCT-eta）was the eta subunit of the chaperone which contained a TCP-1 domain.Based on the interaction between OsZFP and the CCT-eta subunit,it was speculated that the CCT-eta subunit of the chaperone protein may be involved in controlling lateral root development in rice. ［Ch,4 fig.19 ref.］

botany;Oryza sativa;regulated protein;vector construction;yeast two-hybrid;protein interaction

S511；Q943.2

A

2095-0756（2017）06-1024-05

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.06.008

2016-10-30；

2016-12-12

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（31301272）；浙江農(nóng)林大學(xué)人才啟動基金資助項目（2013FR022）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201510341001）；浙江省高校生物學(xué)重中之重（一級）學(xué)科開放基金資助項目（2015D19）

鄭秀文，從事水稻根系發(fā)育基因功能研究。E-mail:1327158979@qq.com。通信作者：劉宏波，副教授，博士，從事作物水稻根系發(fā)育與逆境相關(guān)基因功能研究。E-mail:hbliu@zafu.edu.cn