龍乾發(fā) 劉衛(wèi)平 高建忠 羅強 黑悅 伊西才

(1西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710003; 2第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032; 3榆林市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 榆林 719000)

·神經(jīng)損傷研究·

活體示蹤BMSCs在大鼠癲癇模型中的可行性研究

龍乾發(fā)1劉衛(wèi)平2*高建忠3羅強1黑悅2伊西才2

(1西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710003;2第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032;3榆林市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 榆林 719000)

目的探索活體示蹤骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在大鼠癲癇模型中的可行性。方法體外分離純化SD大鼠BMSCs，超微超順磁性氧化鐵(USPIO)納米顆粒標記，而后誘導(dǎo)大鼠癲癇模型并接受USPIO標記的BMSCs(U-BMSCs)移植，進而通過MRI檢測U-BMSCs體內(nèi)外影像，示蹤U-BMSCs在癲癇模型中的分布，最后通過免疫組化驗證USPIO標記對BMSCs抑制癲癇海馬神經(jīng)元損失的影響。結(jié)果USPIO體外標記BMSCs的效率為99.2%±1.24%，體內(nèi)外MRI T2W2顯示U-BMSCs為可與腦實質(zhì)區(qū)別明顯的低信號影像。細胞移植兩周后發(fā)現(xiàn)U-BMSCs低信號影像可分布于癲癇模型腦實質(zhì)包括海馬，免疫組化結(jié)果示U-BMSCs移植組海馬CA1和齒狀回門區(qū)(DH)神經(jīng)元數(shù)量明顯多于PBS組(Plt;0.05)，且與BMSCs移植組無明顯區(qū)別(Pgt;0.05)。結(jié)論USPIO標記BMSCs可依賴MRI檢測實現(xiàn)其在大鼠癲癇模型中的活體示蹤且不影響其神經(jīng)保護功能。

超微超順磁性氧化鐵; 骨髓間充質(zhì)干細胞; 癲癇; 神經(jīng)保護

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)作為來源發(fā)育早期中胚層和外胚層的多能干細胞，具有低免疫源性、低致瘤性、旁分泌作用和可塑性等特點已為眾多疾病模型和臨床研究所青睞[1]。大量研究表明BMSCs移植可能因其釋放免疫調(diào)節(jié)因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子對海馬神經(jīng)元損傷具有明顯的保護作用，且其治療潛能在海馬損傷模型包括癲癇中得以證實[2-3]，但對BMSCs的示蹤多停留在組織學(xué)研究上。為實現(xiàn)其臨床應(yīng)用潛能，BMSCs活體示蹤研究顯然具有重要支撐意義。核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)因其具有非侵入性和可直視性特點，已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究與應(yīng)用不可分割的部分。近來研究顯示超微超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)納米顆粒(直徑10～15 nm)因其無害于BMSCs一般生物學(xué)特性，USPIO作為對比劑在心肌缺血和中風(fēng)等模型中為BMSCs活體示蹤提供了良好支持方案[4-6]，但是在癲癇模型中還鮮有報道。因此，本實驗擬用USPIO標記BMSCs，探索其在大鼠癲癇模型中進行活體示蹤的可行性。

材料與方法

一、材料

40只4～6 w雄性SD大鼠(170～220 g)購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物飼養(yǎng)及操作均遵循實驗動物倫理學(xué)規(guī)定。USPIO納米顆粒由中國科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心邱本勝教授贈送。

二、BMSCs準備

BMSCs分離培養(yǎng)同我們前面所報道[3,7]。4只SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，75%酒精消毒，無菌解剖雙下肢取股骨和脛骨骨髓，利用Histopaques-1077 (Sigma-Aldrich)分離液密度梯度離心收集單核細胞，用標準培養(yǎng)基含α最小必需培養(yǎng)基(α-minimum essential medium, αMEM)和10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)培養(yǎng)純化(37 ℃, 5% CO2)，細胞融合達70%～80%傳代。第三代BMSCs應(yīng)用于本實驗。BMSCs鑒定采用免疫熒光細胞化學(xué)方法，一抗包括兔抗分化抗原簇(cluster of differentiation, CD)105 、兔抗CD90、兔抗CD73和兔抗CD34(均購至于公司北京博奧森公司，使用濃度均為1∶100)，4 ℃過夜，二抗應(yīng)用驢抗兔A488 (1∶500) (Invitrogen, A-21206)室溫孵育2 h，抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡(BX53，奧林巴斯)照相，計數(shù)取20倍物鏡下隨機10個視野。

三、USPIO標記BMSCs

BMSCs在6孔板中生長至70% 融合狀態(tài)，其標準培養(yǎng)及置換為無血清 α-MEM并含200 μg Fe/mL USPIO 納米顆粒及443 ng/mL 多聚賴氨酸繼續(xù)孵育24 h(37 ℃, 5% CO2)(按試劑說明)，而后去掉培養(yǎng)基用PBS洗3遍即完成USPIO標記。USPIO標記效率檢測采用普魯士藍染色，其具體方法參考HT20鐵染色試劑盒(HT20-1KT, Sigma-Aldrich)說明書，同時未標記的BMSCs設(shè)為陰性對照。

四、大鼠癲癇模型建立及細胞移植

32只SD大鼠分別腹腔注射127 mg/kg氯化鋰 (Sigma-Aldrich)，18 h后，1 mg/kg甲基東莨菪堿皮下注射予以降低毛果蕓香堿的外周膽堿能作用，30 min后，腹腔注射40 mg/kg的毛果蕓香堿誘發(fā)癲癇，4～5級發(fā)作(抽搐不能站立或摔倒)持續(xù)1.5 h后10 mg/kg地西泮皮下注射終止發(fā)作，而后SD大鼠右側(cè)腦室(中線旁開1.5 mm 前囟后1 mm，進針深度距硬膜4.5 mm)分別注射20 μL含5 × 106U-BMSCs(實驗組，n=7)，5×106BMSCs(對照組，n=7)和磷酸鹽緩沖生理鹽水)(phosphate buffered saline, PBS)(對照組Ⅱ,n=5)，剩余4只未經(jīng)處理的SD大鼠設(shè)為正常對照。

五、核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)

我國基層水利設(shè)施大都修建于20世紀六七十年代，受當(dāng)時資金、技術(shù)等因素的制約，部分工程沒有嚴格按照基建程序和遵守設(shè)計審批、竣工驗收等制度進行建設(shè)，造成水利基礎(chǔ)設(shè)施先天不足。同時，由于基層水利自身資產(chǎn)造血功能不足，經(jīng)費短缺，我國基層水利設(shè)施普遍存在著工程老化失修、設(shè)施損壞嚴重等現(xiàn)象。截至2007年年底，我國自流灌區(qū)渠系的完好率只有36%，渠系建筑物完好率為51%；揚水灌區(qū)的設(shè)備完好率僅為35%，配套渠系的完好率為42%，渠系建筑物的完好率為47%；井灌區(qū)的機井完好率為59%，配套渠系的完好率為52%。

MRI使用西京醫(yī)院影像科 3.0 T MRI 掃描儀 (SIEMENS Magnetom verio 3.0 T)，MRI 參數(shù)設(shè)定為T2加權(quán)像(T2W2)，視域6.4×6.4 cm，矩陣256×256，層厚1 mm，多重回波時間89 ms，重復(fù)時間3500 ms。U-BMSCs體外示蹤用PBS直接制備5×106U-BMSCs懸液，未標記的5×106BMSCs設(shè)為對照，及時使用MRI掃描。U-BMSCs體內(nèi)示蹤選細胞移植后24 h和2 w，各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉充分后，置入大鼠線圈進行MRI掃描分析。

六、免疫組織化學(xué)

MRI檢測完成后，各組SD大鼠斷頭取腦組織，4%多聚甲醛固定并石蠟包埋后冠狀位切片，片厚30 μm。前囟后2.64～3.48 mm[3]的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和酒精水化后，檸檬酸高溫高壓修復(fù)抗原，3%過氧化氫處理后10%山羊血清封閉，后加兔抗神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclei, NeuN) (1∶1000; Millipore, MABN140) 4 ℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗后滴加生物素標記二抗室溫孵育1 h，ABC試劑處理1 h后用二氨基聯(lián)苯氨(3, 3-diaminobenzidine, DAB)顯色，酒精脫水和二甲苯透明后，中性樹膠封片。染色中未應(yīng)用一抗的組織切片設(shè)為陰性對照。顯微鏡觀察照相，每組隨機選取4張組織切片在20倍物鏡下照相，Image J軟件予以計數(shù)分析。

七、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、BMSCs 鑒定及USPIO標記效率

二、體內(nèi)外MRI檢測

5×106BMSCs(圖1A)和U-BMSCs(圖1D)充分混懸，經(jīng)MRI檢測結(jié)果顯示BMSCs混懸液呈現(xiàn)明顯高信號(圖1B，白色)，而U-BMSCs混懸液呈現(xiàn)低信號(圖1D，黑白相間，多為黑色)。細胞移植24 h，MRI 結(jié)果可見單純BMSCs右側(cè)腦室移植僅見腦室高信號(同腦脊液影像)(圖1C)，而USPIO標記的BMSCs移植后可見右側(cè)腦室呈現(xiàn)與腦實質(zhì)或腦脊液區(qū)別的低信號影像，并部分向腦室對側(cè)及周圍擴散(圖1F)。綜合提示USPIO的體外MRI低信號影像可應(yīng)用于體內(nèi)示蹤研究。

三、體內(nèi)MRI示蹤

U-BMSCs移植2 w后，MRI 掃描(圖2D)T2W2結(jié)果顯示在右側(cè)腦室內(nèi)低信號明顯減退，而腦室周圍、皮層和海馬均可在水平位(圖2A)，冠狀位(圖2B)和矢狀位(圖2C)圖像上見散在低信號。而BMSCs移植組(對照組 Ⅰ)和PBS注射組(對照組 Ⅱ)和正常對照組(圖2E和2F)，低信號影像則不明顯。因此提示USPIO標記可示蹤BMSCs在大鼠癲癇模型內(nèi)的遷移。

四、U-BMSCs對癲癇海馬神經(jīng)元的保護

免疫組化結(jié)果顯示，相比正常SD大鼠CA1區(qū)(圖3A)和齒狀回門區(qū)(dentate gyrus hilus, DH)(圖3E)，毛果蕓香堿誘導(dǎo)大鼠癲癇2 w后，NeuN陽性細胞在海馬CA1區(qū)(圖3B)和DH(圖3F)出現(xiàn)明顯下降。U-BMSCs移植兩周結(jié)果顯示，NeuN陽性細胞在海馬CA1區(qū)(圖3C)和DH(圖3G)則明顯多于PBS注射組，但跟BMSCs移植組海馬CA1區(qū)(圖3D)和DH(圖3H)區(qū)別不明顯。其one way ANOVA 分析結(jié)果顯示各組NeuN陽性細胞數(shù)量在CA1(F=63.16,Plt;0.01)和DH(F=38.33,Plt;0.01)均具有明顯差異，組間比較結(jié)果顯示SD大鼠癲癇模型PBS注射后，CA1(Plt;0.01)和DH(Plt;0.01)區(qū)神經(jīng)元(NeuN陽性細胞)數(shù)量較正常SD大鼠明顯減少。U-BMSCs移植后， CA1(Plt; 0.01)和DH(Plt;0.05)神經(jīng)元卻明顯多于PBS組，同時與BMSCs移植組CA1(Pgt;0.05)和DH(Pgt;0.05)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量卻無明顯差別。綜合提示USPIO標記BMSCs不影響其對癲癇海馬神經(jīng)元的保護功能。

圖1 體外MRI及早期體內(nèi)示蹤
Fig 1 In vitro and in vivo (early stage) tracking using MRI
A: Pre-suspension of 5×106BMSCs; B: MRI of suspended BMSCs; C: After BMSCs transplantation, the right ventricle presented white signal in T2W2MRI; D: Pre-suspension of 5×106U-MSCs; E: MRI of suspended U-MSCs; F: After U-MSCs transplantation, the right ventricle showed dark signal in T2W2MRI.

圖2 體內(nèi)MRI
Fig 2 MRI in vivo
A: Axial image of T2W2MRI after U-BMSCs transplantation for 2 w; B: Coronal image of T2W2MRI after U-BMSCs transplantation for 2 w; C: Sagittal image of T2W2MRI after U-BMSCs transplantation for 2 w; D: Ideograph of MRI scanning for rat; E: Coronal image of T2W2MRI in the normal SD rat; F: Sagittal image of T2W2MRI in the normal SD rat.

圖3 海馬區(qū)免疫組織化學(xué)
Fig 3 Immunohistochemistry in hippocampus

A, B, C and D: NeuN expression in the hippocampal CA1 region of normal SD rats, PBS group, U-BMSCs group and BMSCs group, respectively; E, F, G and H: NeuN expression in the hippocampal DH region of normal SD rats, PBS group, U-BMSCs group and BMSCs group, respectively.

Bar = 50 μm.

討 論

研究表明USPIO標記干細胞不影響其表面抗原表達、增殖、分化等一般生物學(xué)特性，因此越來越多的學(xué)者應(yīng)用USPIO作為干細胞對比劑在動物模型甚至臨床試驗中進行活體示蹤研究[4, 8-10]，但是應(yīng)用USPIO標記示蹤BMSCs在癲癇模型中的遷移趨向，以及U-BMSCs對神經(jīng)元保護作用方面的研究仍然少見。BMSCs作為臨床應(yīng)用最有潛力的干細胞，國內(nèi)外研究和我們前期報道均顯示BMSCs對中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬神經(jīng)元損傷具有重要保護作用，其作用機制可能為BMSCs向海馬部位遷移后提供神經(jīng)營養(yǎng)支持、抗氧化或免疫調(diào)節(jié)等[2,11]，因此應(yīng)用USPIO標記BMSCs進行活體示蹤研究將為這些功能發(fā)揮提供更為直接的試驗依據(jù)。

本實驗首先通過免疫熒光細胞化學(xué)試驗，依賴特異性抗體檢測證實獲取細胞符合BMSCs的一般抗原表達，為后續(xù)試驗提供了可靠細胞源。USPIO納米顆粒的干細胞標記應(yīng)用已非常成熟，因此實驗中僅按推薦濃度(200 μg Fe/mL)，并未再次探索不同濃度的示蹤影像，且本研究中普魯士藍染色證實該濃度的USPIO能高效標記BMSCs，可為后續(xù)試驗提供示蹤基礎(chǔ)。本研究為探索BMSCs的體內(nèi)示蹤影像，首先按孟增東等[12]的實驗方法制備U-BMSCs細胞懸液，通過U-BMSCs與未標記BMSCs對比，體外證實U-BMSCs在MRI T2W2中呈現(xiàn)低信號。而后進一步通過癲癇模型移植U-BMSCs與BMSCs的早期MRI T2W2對比，發(fā)現(xiàn)U-BMSCs的低信號影像呈現(xiàn)于側(cè)腦室中，提示MRI可活體示蹤U-BMSCs在癲癇模型中的遷移或分布。但是實驗也發(fā)現(xiàn)一些不足，如高濃度的細胞移植充斥于腦室中，是否影響腦脊液循環(huán)尚待進一步研究探索；3.0T MRI檢測U-BMSCs的分辨率還有待提高等。結(jié)合我們前期研究和國外報道[3,13]，BMSCs移植后向腦實質(zhì)遷移一般兩周達到高峰，因此本實驗體內(nèi)示蹤U-BMSCs在大鼠癲癇模型中的分布時間點設(shè)為移植后兩周，MRI檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)U-BMSCs可廣泛分布于腦實質(zhì)內(nèi)，特別是能向海馬部位遷移。同時考慮海馬為癲癇形成的主要部位，綜合提示側(cè)腦室注射BMSCs后的細胞遷移為癲癇治療提供了微環(huán)境，該遷移趨向也可能為BMSCs在海馬神經(jīng)元損傷中發(fā)揮一系列旁分泌作用提供直接證據(jù)。不僅如此，鑒于癲癇模型海馬神經(jīng)元損傷在CA1和DH尤為明顯[14]，實驗進一步通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與未標記的BMSCs移植組相比較，USPIO納米顆粒標記的BMSCs并不影響的海馬CA1和DH區(qū)的NeuN陽性細胞數(shù)量，結(jié)果提示U-BMSCs在癲癇模型中具有與BMSCs相當(dāng)?shù)暮ｑR神經(jīng)元保護功能，因此便于體內(nèi)示蹤研究和應(yīng)用。綜上所述，本實驗證實USPIO標記BMSCs，可通過MRI實現(xiàn)BMSCs在癲癇模型中的活體示蹤且不影響其對癲癇的神經(jīng)保護功能。

1KOBOLAK J, DINNYES A, MEMIC A, et al. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche [J]. Methods, 2016, 99: 62-68.

2AGADI S, SHETTY A K. Concise review: prospects of bone marrow mononuclear cells and mesenchymal stem cells for treating status epilepticus and chronic epilepsy [J]. Stem Cells, 2015, 33(7): 2093-2103.

3LONG Q, QIU B, LIU W, et al. Functional recovery and neuronal regeneration of a rat model of epilepsy by transplantation of Hes1-down regulated bone marrow stromal cells [J]. Neuroscience, 2012, 212: 214-224.

4楊志軍, 白妙春, 陳中燦, 等. USPIO標記大鼠骨髓源神經(jīng)干細胞體外磁共振成像研究 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2016, 15(3): 230-233.

5CAO J, LI X, CHANG N, et al. Dual-modular molecular imaging to trace transplanted bone mesenchymal stromal cells in an acute myocardial infarction model [J]. Cytotherapy, 2015, 17(10): 1365-1373.

6TARULLI E, CHAUDHURI J D, GRETKA V, et al. Effectiveness of micron-sized superparamagnetic iron oxide particles as markers for detection of migration of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in a stroke model [J]. J Magn Reson Imaging, 2013, 37(6): 1409-1418.

7龍乾發(fā), 汪平, 王安生, 等. Hes1基因沉默促進骨髓間充質(zhì)干細胞向GABA能神經(jīng)元分化的實驗研究 [J]. 中華神經(jīng)外科雜志, 2014, 30(2): 186-189.

8EAMEGDOOL S S, WEIBLE M W, 2ND, PHAM B T, et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticle prelabelling of human neural precursor cells [J]. Biomaterials, 2014, 35(21): 5549-5564.

9YILMAZ A, DENGLER M A, VAN DER KUIP H, et al. Imaging of myocardial infarction using ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles: a human study using a multi-parametric cardiovascular magnetic resonance imaging approach [J]. Eur Heart J, 2013, 34(6): 462-475.

10王海龍, 張良, 郭艾. 超順磁性氧化鐵納米顆粒的理化性質(zhì)及其標記BMSCs的安全性、示蹤時效性研究進展 [J]. 山東醫(yī)藥, 2015, 55(24): 99-101.

11LONG Q, HEI Y, LUO Q, et al. BMSCs transplantation improves cognitive impairment via up-regulation of hippocampal GABAergic system in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion [J]. Neuroscience, 2015, 311: 464-473.

12孟增東, 邱偉, 胡彪, 等. 超順磁性氧化鐵納米顆粒體外標記兔骨髓間充質(zhì)干細胞的安全性以及MRI成像特征 [J]. 中國組織工程研究, 2012, 16(6): 951-957.

13LONGO B, ROMARIZ S, BLANCO M M, et al. Distribution and proliferation of bone marrow cells in the brain after pilocarpine-induced status epilepticus in mice [J]. Epilepsia, 2010, 51(8): 1628-1632.

14ZHANG S, KHANNA S, TANG F R. Patterns of hippocampal neuronal loss and axon reorganization of the dentate gyrus in the mouse pilocarpine model of temporal lobe epilepsy [J]. J Neurosci Res, 2009, 87(5): 1135-1149.

Feasibilityoftrackingbonemarrowmesenchymalstemcellsinaratmodelofepilepsy

LONGQianfa1,LIUWeiping2,GAOJianzhong,3LUOQiang1,HEIYue2,YIXicai2

1DepartmentofNeurosurgery,Xi'anCentralHospital,Xi'an710003;2DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;3DepartmentofNeurosurgery,FirstHospitalofYulin,Yulin719000, China

ObjectiveThe feasibility of real time tracking of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in a rat model of epilepsy is explored.MethodsBMSCs were isolated from 4 SD rats and labeled with ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) nanoparticles, and then the epileptic models were induced by Pilocarpine and

USPIO labeled BMSCs (U-BMSCs) administration. After that, MRI was performed to detect the U-BMSCs imaging in vitro and in vivo, as well as the distribution of U-BMSCs in a rat model of epilepsy. Finally, the neuroprotection of U-BMSCs on the epilepsy-induced hippocampal neuronal loss was verified by immunohistochemistry.ResultsPrussian blue staining results showed the uptaken efficiency of USPIO in BMSCs was 99.20%+1.24%. In vitro study manifested that U-BMSCs displayed as darker signal in MRI T2W2, and in vivo study showed that the darker signal distinguished from brain or cerebrospinal fluid imaging was observed in the right lateral after U-BMSCs transplantation for 24 h. After cell transplantation for 2 w, the darker signals of U-BMSCs were observed in the cortex, hippocampus and other areas of the brain. Furthermore, immunohistochemistry results showed that U-BMSCs transplantation prevented the neuronal loss in CA1 and dentate gyrus hilus (DH) of the hippocampus in comparison to PBS group (Plt;0.01), and no significant difference (Pgt;0.05) was shown between U-BMSCs and BMSCs transplantation in the epileptic model.ConclusionUSPIO labeling BMSCs can be detected in vivo using MRI and do not affect their neuroprotection in a rat model of epilepsy.

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide; Bone marrow mesenchymal stem cells; Temporal lobe epilepsy; Neuroprotection

1671-2897(2017)16-115-05

R 329.2

A

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃基金資助項目(2014KJXX-29)；榆林市科技計劃基金資助項目(SF13-33)

龍乾發(fā)，副主任醫(yī)師，E-mail: lonva@live.cn

*通訊作者： 劉衛(wèi)平，教授、主任醫(yī)師，E-mail: liuwp@fmmu.edu.cn

2016-08-14；

2016-10-17)