牟云+汪文倫+許萬云+胡夢薇+王丹+嚴(yán)國+王會敏+高劍峰
摘要:為獲得人乳鐵蛋白的沙漠小球藻(Chlorella sp. GTD8A1)的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的小球藻GTD8A1-hLF工程藻種,將人乳鐵蛋白基因?qū)胄∏蛟寮?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)鑒定。以人血cDNA為模板,RT-PCR擴增得到人乳鐵蛋白基因(GenBank登錄號NM-002343.4),經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切后,連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS中,獲得重組質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS,將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入GTD8A1中,通過菌落PCR鑒定后擴大培養(yǎng),在DNA和RNA水平分析人乳鐵蛋白基因的整合和轉(zhuǎn)錄,SDS-PAGE和Western Blot分析獲得70 ku的目的蛋白;將轉(zhuǎn)基因藻種(GTD8A1-hLF)在BBM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)周期優(yōu)化。結(jié)果表明,重組人乳鐵蛋白在沙漠小球藻細(xì)胞中表達(dá)成功;通過Elisa測其人乳鐵蛋白表達(dá)量在20 d時達(dá)到最大,濃度為13.28 mg/L。
關(guān)鍵詞:小球藻;人乳鐵蛋白;表達(dá)系統(tǒng);SDS-PAGE;Western Blot;構(gòu)建;鑒定
中圖分類號: S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)19-0138-05
收稿日期:2016-05-06
基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:31460276)。
作者簡介:牟 云(1992—),女,四川華鎣人,碩士研究生,從事可再生能源的開發(fā)與利用相關(guān)研究。E-mail:1171534413@qq.com。
通信作者:高劍峰,教授。E-mail:jianfengg@shzu.edu.cn。 新疆古爾班通古特沙漠位于準(zhǔn)噶爾盆地的中央,是我國第二大沙漠和面積最大的固定、半固定沙漠。年降水量70~150 mm,冬季有積雪,春季和初夏降水略多,冬季最低地表溫度可達(dá)-25 ℃,夏季最高地表溫度可達(dá)30 ℃[1]。生長在此的小球藻及其他藻類與高等植物經(jīng)過百萬年的進(jìn)化,已經(jīng)完全適應(yīng)了沙漠的極端環(huán)境。從20世紀(jì)80年代末開始,對沙漠微藻的研究與開發(fā)受到國內(nèi)外研究者的重視[2]。研究表明,在新疆沙漠中生長著百余種藻類,小球藻是其中重要的組成部分[3]。小球藻為球形或橢圓形綠色單細(xì)胞藻類植物,也是真核微生物的一種。其細(xì)胞直徑3~8 μm,是地球上最早的生命之一,出現(xiàn)在20多億年前,遺傳相對保守,其廣泛分布于土壤、湖泊、海洋、南北極生態(tài)系統(tǒng)和荒漠,是生物量豐富、生產(chǎn)力較高的單細(xì)胞生物[4]。作為廣泛分布的單細(xì)胞藻類植物,小球藻是在單細(xì)胞水平上研究和建立轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)及其相關(guān)條件優(yōu)化和其他具有藥用價值的副產(chǎn)品開發(fā)和研究的絕佳材料。目前,由于四代生物燃料崛起,國內(nèi)外關(guān)于小球藻基因組學(xué)、基因工程[5]的研究與開發(fā)日趨活躍。近幾年,隨著小球藻基因組測序[6]的完成,以及對其外源蛋白基因排斥與免疫[7-8]的深入研究,使得小球藻這種單細(xì)胞微生物成為最佳生物反應(yīng)器的研究焦點,也是研究外源基因表達(dá)的最佳材料。
乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白,是一種糖基化蛋白,分子量為70~80 ku、約700個氨基酸,基因的大小在2 112~2 530 bp之間;廣泛分布在初乳、牛奶及其相應(yīng)的分泌物如眼淚、唾液中,是一種多功能性糖蛋白,在各種動物之間的同源性較高[9]。它能螯合生物體液中的鐵(Fe2+或Fe3+)或者破壞微生物的細(xì)胞膜,使其減少微生物(細(xì)菌、病毒和寄生蟲)的增殖、黏附或者將其殺死,從而表現(xiàn)出抗菌的作用[10]。人乳鐵蛋白(human lactoferrin,hLF)是一條多肽鏈折疊形成2個對稱的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(N and C lobes),包含部分α-螺旋鏈接域[11]。人乳鐵蛋白對免疫、細(xì)菌、病毒、微生物、抗寄生蟲和真菌都有相應(yīng)的保護(hù)和抗性的作用,從而被開發(fā)成食品添加劑和保健品等。同時,科學(xué)界也將乳鐵蛋白列為新型抗生素的候選者[12]。目前,人乳鐵蛋白也被加工成嬰幼兒奶粉的食品添加劑,受到廣大消費者的青睞。但是,人乳鐵蛋白主要由初乳和血液來提取獲得,這就使得人乳鐵蛋白的產(chǎn)量少之又少,價格昂貴。因此,有科學(xué)家提出采用分子的手段去開發(fā)不同種類的乳鐵蛋白的重組體,以增加乳鐵蛋白開發(fā)和利用價值。
本試驗結(jié)合小球藻的優(yōu)勢和人乳鐵蛋白的優(yōu)點,首次以真核為宿主,在沙漠小球藻GTD8A1基因組上整合外源人乳鐵蛋白基因(hLF),利用小球藻細(xì)胞作為生物反應(yīng)器及其生長周期短、傳代快速、代謝可控的優(yōu)點,獲得穩(wěn)定表達(dá)人乳鐵蛋白小球藻菌株,進(jìn)而為小球藻生產(chǎn)人乳鐵蛋白下游工業(yè)提供優(yōu)良的藻種。這將為人乳鐵蛋白的下游工業(yè)、商業(yè)化和推廣使用提供試驗基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 小球藻GTD8A1由筆者所在實驗室分離、純化和鑒定得到。小球藻GTD8A1所用BBM培養(yǎng)基[13]:NaNO3 250.00 mg/L,KH2PO4 175.00 mg/L,K2HPO4 75.00 mg/L,MgSO4·7H2O 75.00 mg/L,CaCl2·2H2O 25.00 mg/L,NaCl 25.00 mg/L,EDTA 50.00 mg/L,KOH 31.00 mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 4.98 mg/L,H3PO4 11.42 mg/L,ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L,MnCl2 1.44 mg/L,MoO3 0.71 mg/L,CaSO4·5H2O 1.57 mg/L,Co(NO3)2·6H2O 0.49 mg/L,98% H2SO4 2 μl/L。
1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α菌株為筆者所在實驗室保存;植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS,由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃先忠老師饋贈。endprint
1.1.3 引物設(shè)計及合成 從NCBI上獲取人乳鐵蛋白的基因序列(NM-002343.4),通過Primer 5軟件設(shè)計引物(表1)。
1.2 方法
1.2.1 藻種培養(yǎng)及其條件 取對數(shù)生長末期的小球藻培養(yǎng)液,按10%的接種量接入裝有100 mL BBM培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,置于光照培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:光照度100 μmol/(m2·s),光-暗周期12 h-12 h,培養(yǎng)溫度(23.0±05 ℃)。
1.2.2 人全血RNA的提取和人乳鐵蛋白基因的克隆 采用Trizol試劑提取人血總RNA,試驗步驟按說明書進(jìn)行??俁NA產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)檢測。以提取的RNA為對象,采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific,EU)說明書合成cDNA第一鏈。再以此cDNA為模板,以hLF-F2/hLF-R2為特異性引物,對人乳鐵蛋白基因進(jìn)行PCR擴增,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 變性60 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸 2.5 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存,1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收,得到人乳鐵蛋白基因,將目的基因連接到T4(TaKaRa,China)載體中,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含有卡那霉素(30 mg/L)平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。最后將鑒定的陽性克隆送深圳華大基因科技有限公司測序,對測序結(jié)果進(jìn)行blast比對。
1.2.3 構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS 將目的基因hLF的回收產(chǎn)物和載體pCAMBIA2300-35S-OCS用KpnⅠ和XbaⅠ分別雙酶切4 h,其過程和反應(yīng)體系按TaKaRa的說明書進(jìn)行。將hLF酶切產(chǎn)物與載體酶切產(chǎn)物在連接酶的作用下16 ℃連接過夜,其過程和反應(yīng)體系也按TaKaRa的說明書進(jìn)行。通過熱激法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。然后將感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有卡那霉素(30.0 mg/L)平板培養(yǎng)基上,挑取白斑菌落作為模板,以hLF-F1/ hLF-R1為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定,采用質(zhì)粒小提試劑盒所述步驟提取重組載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS,并用KpnⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切驗證。
1.2.4 表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS轉(zhuǎn)化小球藻情況的檢測 利用電轉(zhuǎn)化方法[14]將構(gòu)建好的表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS導(dǎo)入小球藻GTD8A1中,將電擊后的小球藻細(xì)胞涂于含30 mg/L卡那霉素的BBM培養(yǎng)基上,挑取平板上長出的單藻落,放在10 μL的ddH2O中,95 ℃ 變性后作為模板,以hLF-F1/hLF-R1為引物進(jìn)行PCR驗證。陽性轉(zhuǎn)基因藻種GTD8A1-hLF轉(zhuǎn)入到含有 50 mg/L 卡那霉素的BBM培養(yǎng)基中培養(yǎng),用于后續(xù)試驗。
1.2.5 SDS-PAGE和Western Blot分析 小球藻蛋白的提取采用植物蛋白提取試劑盒(TIANGEN,China),具體操作步驟見說明書。Western Blot 過程參照Lin等的試驗方法[15]。
1.2.6 培養(yǎng)周期的優(yōu)化 在含有50 mg/L卡那霉素的BBM培養(yǎng)基中,分別于處理后0、4、8、12、16、20、24、28 d測定其總蛋白含量(g/L)和人乳鐵蛋白含量(mg/L)。其中,總蛋白含量(g/L)按考馬斯亮藍(lán)說明書進(jìn)行,人乳鐵蛋白含量(mg/L)按Elisa試劑盒說明書進(jìn)行。
2 結(jié)果與分析
2.1 人全血RNA提取和人乳鐵蛋白基因的克隆
通過Trizol法提取人全血的RNA后,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR克隆得到2 133 bp的人乳鐵蛋白基因,經(jīng)測序分析證實,人乳鐵蛋白基因序列與GenBank(登錄號NM-002343.4)公開的人乳鐵蛋白基因全長序列99%相同,說明目的基因克隆成功,其中電泳檢出了200 bp的條帶可能是由于引物添加過多而引起的引物二聚體造成的試驗現(xiàn)象,這對目的基因回收不產(chǎn)生影響,可以進(jìn)行后續(xù)試驗,其結(jié)果見圖1。
2.2 植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS構(gòu)建和驗證
本試驗采用雙酶切和DNA酶連接的試驗方法構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS,表達(dá)載體構(gòu)建過程見圖2。構(gòu)建好的載體通過熱激的方法導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α細(xì)胞中,然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,試驗結(jié)果見圖3。由圖3可知,挑選白斑菌落擴大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS,將提取好重組質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS送深圳華大基因科技有限公司測序分析證實,人乳鐵蛋白基因也整合到重組質(zhì)粒當(dāng)中。同時對重組質(zhì)粒載體PCR和雙酶切檢測,得到2 133 bp的目的條帶。
2.3 DNA和RNA分析
將菌落PCR檢測為陽性小球藻菌落,經(jīng)過含有抗性BMM液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后。采用植物DNA提取試劑盒和Trizol分別提取DNA和RNA,以hLF-F1/hLF-R1為引物進(jìn)行分子水平上分析,通過PRC和RT-PCR分析得到5、6、8、10號小球藻含有2 133 bp的目的條帶,通過結(jié)果表明,人乳鐵蛋白基因也能整合到小球藻細(xì)胞中,并且得到轉(zhuǎn)錄,結(jié)果與預(yù)期一致(圖4)。
2.4 SDS-PAGE和Western Blot分析
將DNA和RNA分子水平上鑒定的5、6、8、10藻種再一次在含有抗性的BBM液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后,采用植物總蛋白提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因藻的總蛋白,通過SDS-PAGE和Western Blot檢測得到70 ku的目的蛋白條帶。其中,圖 5-A 中條帶 5 為 5 號藻蛋白SDS-PAGE試驗結(jié)果;條帶6endprint
為6號藻蛋白SDS-PAGE試驗結(jié)果;條帶8為8號藻蛋白SDS-PAGE試驗結(jié)果;條帶10為10號藻蛋白SDS-PAGE試驗結(jié)果;11號為空白對照SDS-PAGE試驗結(jié)果。圖5-B中序號與圖5-A一致,只是圖5-B是Western Blot的試驗結(jié)果。
2.5 培養(yǎng)周期的優(yōu)化
將藻種(GTD8A1-hLF)在不同的培養(yǎng)時間下,測定人乳鐵蛋白的人乳鐵蛋白含量和總蛋白含量,進(jìn)行3次測量試驗結(jié)果的平均值。由圖6可知,最佳的培養(yǎng)周期為20 d,其人乳鐵蛋白含量和總蛋白含量分別為 13.28 mg/L、12.73 g/L。其中,通過RT-PCR預(yù)測人乳鐵蛋白的表達(dá)結(jié)果與用Elisa測定的試驗結(jié)果一致,獲得的最適培養(yǎng)周期將作為以下試驗的培養(yǎng)周期。
3 討論
試驗在宿主小球藻GTD8A1的基因組上插入外源hLF基因?qū)ζ溥M(jìn)行基因改造并成功表達(dá),建立了人乳鐵蛋白的沙漠小球藻的表達(dá)系統(tǒng),并通過相關(guān)的手段進(jìn)行鑒定。從人血中獲取RNA克隆出cDNA到人乳鐵蛋白的表達(dá),其相關(guān)的試驗結(jié)果都得到驗證(圖1~圖6)。圖1-B中出現(xiàn)200 bp左右的條帶,這與所需要的目的條帶2 133 bp條帶不在同一位置上,造成這樣的原因可能是引物二聚體的出現(xiàn),但這不會對后續(xù)試驗造成影響;圖5-A中獲得了70 ku目標(biāo)條帶和雜帶,同時在11號空載樣的位置上沒有看見目標(biāo)條帶的出現(xiàn),但是通過Western Blot試驗后在圖5-B中11號空載樣的位置也沒有出現(xiàn)目標(biāo)條帶,結(jié)果表明,人乳鐵蛋白的沙漠小球藻的表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功。
人乳鐵蛋白的最初生產(chǎn)主要來自于初乳的分離和純化,其產(chǎn)量小不利于規(guī)?;a(chǎn),這就須要探索一種技術(shù)來解決其所存在的問題。藻類早期研究主要利用其自身細(xì)胞合成產(chǎn)物,如β-胡蘿卜素、二十二碳六烯酸(DHA)和蝦青素等[16-17],來開發(fā)具有商業(yè)和藥用價值的生物產(chǎn)品,隨后也有研究者利用藻類(如螺旋藻、小球藻和柵藻)生物反應(yīng)器來生產(chǎn)一些蛋白保健食品[18]。例如,Koo等成功構(gòu)建牛乳鐵蛋白的小球藻表達(dá)系統(tǒng)并且表達(dá)成功,使得藻類為轉(zhuǎn)基因宿主以及構(gòu)建人乳鐵蛋白的表達(dá)系統(tǒng)提供可能,利用帶CaMv35s啟動子的表達(dá)載體pCAMBIA1304成功構(gòu)建牛乳鐵蛋白的小球藻表達(dá)系統(tǒng)并且表達(dá)成功,獲得目標(biāo)基因序列部分長為 1.1 kb,通過SDS-PAGE和Western Blot技術(shù)檢測到35 ku的蛋白條帶[14],盡管筆者沒有獲得牛乳鐵蛋白的全長,但是其研究使得藻類成為轉(zhuǎn)基因宿主以及在其細(xì)胞中構(gòu)建人乳鐵蛋白的表達(dá)系統(tǒng)可能。然而,本研究通過帶CaMv35s啟動子的表達(dá)載體pCAMBIA2300的植物表達(dá)載體,成功構(gòu)建了人乳鐵蛋白基因全長的沙漠小球藻表達(dá)系統(tǒng),獲得轉(zhuǎn)基因藻種GTD8A1-hLF,并通過PCR手段檢測到人乳鐵蛋白基因全長為2 133 bp,以及通過SDS-PAGE和Western Blot技術(shù)檢測到70 ku的蛋白條帶,這將為小球藻生產(chǎn)人乳鐵蛋白全長提供了可能。
然而,國內(nèi)對人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因的研究主要集中在酵母、水稻和動物(牛)等真菌和高等動物中,Jiang等在畢赤酵母細(xì)胞中成功表達(dá)了人乳鐵蛋白,其蛋白濃度高達(dá)1 200 mg/L,但是蛋白活性不高,促使人們進(jìn)一步的開發(fā)其他表達(dá)系統(tǒng)[19];吳景歡在水稻種成功表達(dá)重組人乳鐵蛋白,其蛋白含量為05%[20];文勝通過基因工程的手段獲得轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白的牛初乳,并且構(gòu)建了相應(yīng)的表達(dá)體系,其蛋白濃度在2.5~3.5 mg/L 之間[21]。國外對乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因研究主要集中在馬鈴薯和動物(小鼠)等高等植物和動物中,Chong等在馬鈴薯中成功的構(gòu)建和表達(dá)了人乳鐵蛋白,其蛋白表達(dá)濃度為可溶性蛋白總濃度的0.1%[22];Choi等在馬鈴薯中成功建立了人乳鐵蛋白的表達(dá)載體,其蛋白表達(dá)濃度為可溶性蛋白總濃度的3%[23];Hwang等在小鼠中構(gòu)建完成人乳鐵蛋白的表達(dá)體系[24]。通過對國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因人乳鐵蛋白研究發(fā)現(xiàn),在沙漠小球藻進(jìn)行人乳鐵蛋白的表達(dá)還鮮有研究,本研究獲得的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的人乳鐵蛋白的含量在13.28 mg/L,與前人的研究有相似之處,但是該表達(dá)系統(tǒng)還有待進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)物優(yōu)化研究。
本試驗通過目的基因的克隆、載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、分子水平分析以及SDS-PAGE和Western Blot驗證,最終獲得了能成功表達(dá)人乳鐵蛋白的植物表達(dá)載體,同時上游重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)也構(gòu)建完成,可以為下游提供必要的技術(shù)基礎(chǔ)和早期的藻種。雖然,人乳鐵蛋白能在小球藻中表達(dá),但是想要將此技術(shù)運用到下游工業(yè)中還有一定的困難,原因在于:第一,本試驗只是獲得能表達(dá)人乳鐵蛋白的沙漠小球藻,所有的試驗都是在實驗室的條件下進(jìn)行的,若是想要運用到下游工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中,還須要進(jìn)一步對其產(chǎn)物條件進(jìn)行優(yōu)化研究和摸索,影響規(guī)模發(fā)酵的諸多條件如重組小球藻在反應(yīng)器當(dāng)中的最適溫度、pH值、光照條件和培養(yǎng)基等。第二,想要重組人乳鐵蛋白的小球藻能夠生產(chǎn)安全、穩(wěn)定的人乳鐵蛋白,那么分離和提取工藝還須要進(jìn)一步地探索。如何在分離提取的過程中不產(chǎn)生對人體有毒害物質(zhì),而且又不損失應(yīng)用價值和功能,是重組人乳鐵蛋白作為功能性食品和食品添加劑的重要條件之一。第三,后期處理的成本也是發(fā)展的關(guān)鍵問題。相信隨著對微藻研究和認(rèn)識的進(jìn)一步深入,以及下游工業(yè)的分離和提取技術(shù)的發(fā)展,這些問題都將在短時間內(nèi)得以解決,未來運用微藻生產(chǎn)人乳鐵蛋的應(yīng)用前景將不可限量。
4 結(jié)論
本試驗通過RNA和DNA的提取,采用PCR、RT-PCR、測序以及SDS-PAGE和Western Blot等技術(shù)手段,成功地在沙漠小球藻中建立了人乳鐵蛋白的表達(dá)系統(tǒng),獲得了能夠表達(dá)人乳鐵蛋白的重組表達(dá)載體pCANBIA2300-35S-hLF-OCS,其人乳鐵蛋白的表達(dá)濃度為13.28 mg/L。
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