任 鵬,龔 堃,鮑毅新，黃相相, 周 曉, 韓金巧

浙江師范大學生態(tài)研究所, 金華 321004

基于糞便DNA的小麂親權鑒定和婚配制研究

任 鵬,龔 堃,鮑毅新*，黃相相, 周 曉, 韓金巧

浙江師范大學生態(tài)研究所, 金華 321004

2014年4月至2015年1月,在古田山國家級自然保護區(qū)內共收集634份糞便樣本,2份肌肉樣本。通過嚴格篩選,最終獲得390份可用于PCR擴增的樣本。用多態(tài)性較高的8個微衛(wèi)星位點進行基因型分型,共識別出177個小麂個體。SRY基因性別鑒定顯示研究樣本中雄性84只,雌性93只。所使用的8個微衛(wèi)星位點在177個樣本中,平均等位基因數(shù)(A)為11,平均觀測雜合度(Ho)在0.960—1.000之間,平均值為0.9685,平均期望雜合度(He)在0.799—0.887之間,平均值為0.8429,多態(tài)信息含量(PIC)在0.766—0.872之間,平均多態(tài)信息含量為0.8214,基因雜合度水平較高,為遺傳多樣性豐富的種群。采用Cervus3.0進行親權分析,當置信度為95%和80%時,8個微衛(wèi)星位點的鑒定率均達到100%。共鑒定出父-母-子24對,母-子23對,父-子19對,涉及到104只個體。根據(jù)親緣關系分析小麂的婚配制,結果發(fā)現(xiàn)小麂的婚配制屬于1雄多雌,但并不是目前所知的亞型,而可能是一種被稱作“檢查策略”的一雄多雌制。

小麂；親權鑒定；遺傳多樣性；婚配制

小麂(Muntiacusreevesi)屬偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Cervidae)麂屬(Muntiacus),是我國特有的小型鹿科動物,廣泛分布于中國中部和南部地區(qū)[1],有重要的經(jīng)濟價值。2008年國際自然與自然資源保護聯(lián)盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄將其列入低危(Least concerned,LC)級[2]。由于營獨居生活的鹿科動物不僅活動范圍大,且多生活在密林中,在野外難以直接觀察,所以鹿科動物的社會結構和婚配制的研究較少,且主要是在圈養(yǎng)狀態(tài)下直接觀察[3],或通過無線電遙測技術進行研究[4]。目前對小麂的研究主要集中在宏觀生態(tài)學[5]、細胞遺傳學[6]和進化生物學[7]等方面。近年來,隨著野生動物非損傷性取樣(noninvasive sampling)技術的應用,糞便樣品以其易于采集的特點而成為最具潛在價值的研究材料[8]。利用糞便DNA結合微衛(wèi)星標記在進行鹿科動物個體識別[9]、親權鑒定[10]、遺傳多樣性[11]、家域[12]等方面得到了廣泛應用。目前通過微衛(wèi)星標記來研究婚配制的報道有很多,如北極熊(Ursusmaritimus)[13]、寬吻凱門鱷(Caimanlatirostris)[14]、扇尾噪刺鶯(Gerygoneflavolateralis)[15]等。用糞便DNA來研究婚配制的報道較少,僅見黑犀牛(Dicerosbicornis)[16]、黑麂(Muntiacuscrinifrons)[17]。這使得分子生物學的手段成為研究小麂婚配制的新視角,同時可以進一步分析小麂種群的遺傳多樣性、種群內成員之間的關系、物種的進化潛力和抵抗不良環(huán)境的能力、繁殖策略等。

本文基于小麂糞便樣本,通過微衛(wèi)星標記進行個體識別和性別鑒定,對小麂進行親權鑒定,分析小麂種群的遺傳多樣性,探討小麂的婚配制度,以及婚配制對維持種群遺傳多樣性的作用,為其它物種進行婚配制的研究提供了新的研究視角,對制定有效的保護和管理策略有重要意義。

1 材料和方法

1.1 樣本的采集

本研究的采樣點是古田山國家級自然保護區(qū),位于浙江省衢州市開化縣蘇莊鎮(zhèn)西北,與江西婺源、德興毗鄰,約在118°03′49.7″—118°11′12.2″E,29°10′19.4″—29°17′41.4″N之間,總面積為81.07 km2。主峰青尖海拔1258 m,屬中亞熱帶季風候帶,有明顯的季節(jié)變化。年均降水量1963.7 mm,年均溫度15.3℃,無霜期約為250 d。分布著典型的中亞熱帶常綠闊葉林,小麂種群資源豐富,具有一定的代表性。為了最大限度地收集保護區(qū)內的小麂新鮮糞便,分別于2014年4月(春)、7月(夏)、10月(秋)和2015年1月(冬)進行了4次重復采樣,采樣樣線的設置參考鄭祥[16]等的研究,在核心區(qū)(5條)、緩沖區(qū)(2條)、實驗區(qū)(4條)共設置11條樣帶。樣帶單側寬度為10 m,長度在3—6 km不等,相互之間的間距大于1500 m,避免了單次采樣獲得小麂的糞便樣本較少。在調查區(qū)域內,成年黑麂和小麂的糞便較易區(qū)分,容易混淆的是小麂和黑麂幼齡個體排出的糞便,由于幼齡個體的腸道發(fā)育不成熟,小麂和黑麂排出的糞便差異不大,很容易誤判,在采樣時,對于那些幼齡個體的糞便,如果完全無法判斷,則舍棄,不采集。采樣時使用一次性滅菌手套,將糞便樣品放入盛有無水乙醇的滅菌封口袋中,標注采集時間、地點、海拔和經(jīng)緯度等,帶回實驗室-20℃保存。4次采樣共獲得634份糞便樣本,并從當?shù)孬@得兩份肌肉樣本(一雌一雄)。

1.2 基因組DNA的提取和PCR擴增

1.2.1 DNA的提取

糞便和肌肉組織分別使用OMEGA-Stool DNA Kit試劑盒和酚氯仿抽提法[18],提取的DNA樣本保存于-20℃,用于后期的PCR實驗。在根據(jù)糞便形態(tài)初步鑒定的基礎上,利用線粒體細胞色素b基因(Cytb)進行驗證[19],作為物種鑒定的補充,該方法作為分子標記進行物種鑒定具有簡單、快速、準確等優(yōu)點,已在哺乳動物中廣泛應用[20- 21]。

1.2.2 微衛(wèi)星引物的確定和PCR擴增

本研究所用引物和PCR反應體系參照Wang等[22-23]的研究,經(jīng)多次實驗后選定8個擴增穩(wěn)定且多態(tài)信息含量高的微衛(wèi)星位點(表1),進行小麂的微衛(wèi)星DNA分型分析,分別選用TAMRA、FAM和HEX進行熒光標記(由上海生工合成)。對SRY性別決定基因進行擴增時,為減少假陰性對實驗的影響,對每個樣本的SRY基因進行3次擴增,出現(xiàn)條帶在2次以上的判斷為雄性,SRY引物及擴增體系參考魯曉瑄等[24]的研究。

表1 8個微衛(wèi)星引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

微衛(wèi)星位點的擴增產(chǎn)物,用ABI 3700 DNA序列測定儀進行分型(上海生工)。分型結果使用GeneMarker 1.91軟件讀取,通過對比由8個微衛(wèi)星標記基因型組合成的指紋圖譜,對小麂進行個體識別[25]。利用Cervus 3.0計算等位基因數(shù)(A)、平均觀測雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)、親本排除概率(E- 1P；E- 2P；E-PP)、多態(tài)信息含量(PIC)和Hardy-Weinberg平衡檢測,并進行親權鑒定[26]。由于實驗樣本的父本和母本均未知,因此以所有識別出的雄性為候選父本、所有雌性為候選母本,取樣概率均為1.0,使用Kingroup v2[19,27]計算個體間的親緣系數(shù)(r),作為親權鑒定的補充,運用POPGENE 32[28]計算種群的近交系數(shù)Fis值。

2 結果

2.1 個體識別和親權鑒定

2.1.1 性別鑒定和個體識別

643份小麂糞便樣本中有442份可以多次穩(wěn)定提取DNA(重復次數(shù)≥3次)且能擴增獲得PCR產(chǎn)物,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,部分結果如圖1所示。通過對比可知,等體積的糞便DNA和肌肉DNA電泳條帶亮度差異較小,糞便中DNA的獲得量能滿足后續(xù)PCR實驗的需求。為進一步證實采集的樣本為小麂,隨機抽取100份糞便DNA樣本,PCR擴增線粒體細胞b基因(Cytb),將PCR產(chǎn)物進行測序,結果表明,除3份樣本測序失敗外,97%的樣本均與數(shù)據(jù)庫中的小麂Cytb基因片段有極高的相似度,均達到99%以上。

對442份糞便DNA樣本進行微衛(wèi)星位點的擴增R產(chǎn)物進行檢測,舍棄那些位點數(shù)≤5的樣本,最終保留390份樣本進行Sry性別決定基因的擴增,同時以兩份肌肉樣本(性別已知)作為對照,用2%的瓊糖凝膠電泳檢測,目標片段大小為220bp[24],部分結果如圖1。共鑒定出177個小麂個體,其中雄性84只,雌性93只。

圖1 小麂Sry基因PCR結果Fig.1 The PCR amplification results of Sry gene in Muntiacus reevesi1—22:不同糞便樣本DNA；23:雌性小麂肌肉DNA；24:雄性小麂肌肉DN A

2.1.2 微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析

分析8個微衛(wèi)星位點在177個個體中的遺傳信息參數(shù)(表 2),結果表明,平均等位基因數(shù)(A)為11.00,多態(tài)信息含量(PIC)在0.766—0.872之間,平均多態(tài)信息含量為0.8214,屬于高度多態(tài)位點(PIC>0.5)；觀測雜合度(Ho)在0.960—1.000之間,平均值為0.9685,期望雜合度(He)在0.799—0.887之間,平均值為0.8429,Ho>He。Fis均為負值,平均值為-0.1886；基因雜合度水平較高,無效等位基因(F(Null))頻率極低,平均為-0.0779。8個位點的累積雙親排除概率大于99.99%。Hardy-Weinberg平衡檢測結果顯示微衛(wèi)星位點Mreg260、Mre61和Mreg283均偏離平衡,其它5個位點均符合。

表2 8個微衛(wèi)星位點在177個小麂中的遺傳信息參數(shù)分析

A：位點等位基因數(shù)allele number of 1oci；N：樣本數(shù)sample sizes;Ho：位點觀測雜合度observed heterozygosiry；He：位點期望雜合度heterozygosiry；PIC：位點多態(tài)信息含量polymorphic informafion content；E- 1P：第1個親本的排除概率exclusion probability of the first parent；E- 2P：第2個親本的排除概率exclusion probability of the second parent；E-PP：雙親的排除概率exclusion probability of parent pair；Fis：近交系數(shù)的F-統(tǒng)計量檢測值inbreeding coefficient with F-statistics；HWE：哈迪溫伯格平衡Hardy-Weinberg equilibrium；F(Null):無效等位基因頻率frequency with null；NS：不顯著偏離no significant deviation；*顯著偏離the locus which showed deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.05)

圖2 微衛(wèi)星位點數(shù)與累積排除概率之間的關系 Fig.2 Relationship between the combined probability of exculotion and the number of microsatellite lociCE- 1P,CE- 2P,CE-PP：PIC由高到低排列的累積排除概率；CE- 1P′,CE- 2P′,CE-PP′：PIC由低到高排列的累積排除概率

2.1.3 微衛(wèi)星位點的親權排除率分析

根據(jù)8個微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量(PIC)大小,按由高到低和由低到高的順序進行組合,依次增加微衛(wèi)星位點數(shù)進行累積排除率分析,由圖2可知,當微衛(wèi)星位點達到6個時,不論PIC是由高到低還是或由低到高,累積排除概率除E- 1P′為0.9845外,其余均大于0.9900,說明所選的8個微衛(wèi)星位點可以對親權關系進行準確的判定。

2.1.4 親權鑒定

通過Cervus3.0軟件的Parent pair(Sex knowm)功能進行親權鑒定,結果見附錄1和附錄2。共鑒定出父-母-子24對,母-子24對,父-子18對,所涉及到的104只個體隸屬于26個系譜,另外73只個體沒有鑒定出它們的親子代關系。42對父-子的親緣系數(shù)(r)值在0.5044—0.6332之間,平均值為0.5273,48對母-子在0.5044—0.6083之間,平均值為0.5359(表3)。由于系譜1、2和3較為復雜,畫出了親緣關系結構示意圖(圖3)。

圖3 系譜1、2和3的親緣關系結構示意圖Fig.3 Genetic pedigree chart of 1, 2 and 3

2.1.5 婚配制度

根據(jù)表3的系譜分析,可知小麂的婚配關系：1個雌性和3個雄性發(fā)生過交配的現(xiàn)象出現(xiàn)2次(家系1,3),1個雄性和3個雌性發(fā)生交配的現(xiàn)象出現(xiàn)3次(家系1,2,4),1個雌性和2個雄性發(fā)生過交配的現(xiàn)象出現(xiàn)9次(家系1,2,3,5,7,8,9,15),1個雄性和2個雌性發(fā)生交配的現(xiàn)象出現(xiàn)5次(家系1,2,6,16,18),其余均為1雄1雌。依據(jù)表3中的系譜,計算1個雌性和多個雄性交配以及1個雄性和多個雌性交配所產(chǎn)生后代之間的親緣系數(shù),結果表明,這些后代之間的親緣系數(shù)(r)值在0.2759—0.3844之間,平均值為0.3064(表4)。由1個雄性和多個雌性發(fā)生交配的現(xiàn)象,可知小麂的婚配制仍屬一雄多雌。

表3 小麂的親子關系和親緣系數(shù)

A,B,C,D,E為樣本的采樣編號；r(m,o)：母子間親緣系數(shù)the relationship coefficient between mother and offspring；r(f,o)：父子間親緣系數(shù)the relationship coefficient between father and offspring

表4 后代之間的親緣系數(shù)

3 討論

3.1 親權鑒定和遺傳多樣性分析

研究表明,利用微衛(wèi)星標記進行親權鑒定時,其排除非親本的能力依賴于微衛(wèi)星位點數(shù)和等位基因的多樣性,隨著微衛(wèi)星位點數(shù)的增多,排除概率隨之增高[29]。本研究所選用的8個微衛(wèi)星位點共獲得88個等位基因位點,平均等位基因數(shù)(A)為11.00；多態(tài)信息含量PIC是衡量基因變異程度高低的指標,當PIC>0.5時,該基因座位為高度多態(tài)性位點[30],本研究中8個微衛(wèi)星標記的多態(tài)信息含量范圍在0.767—0.873之間,平均為0.823,均為高度多態(tài)位點。與其它鹿科動物相比,如麋鹿(Elaphurusdavidianus)[31]的平均等位基因數(shù)為2.11,PIC在0.053—0.519之間,平均為0.303、黑麂(Muntiacuscrinifrons)[32]的平均等位基因數(shù)為8.88,PIC在0.523—0.803之間,平均為0.661、馬鹿(Cervuselaphus)[11]的平均等位基因數(shù)為9.00,PIC在0.53—0.78之間,平均值為0.69、白尾鹿(Odocoileusvirginianus)[33]的平均等位基因數(shù)為8.38,PIC在0.356—0.898之間,平均值為0.684、梅花鹿(Cervusnippon)[10]的平均等位基因數(shù)為5.93,PIC在0.217—0.825之間、平均值為0.606。遺傳多樣性是指種內基因的變化,包括種內顯著不同種群和同一種群內不同個體之間的遺傳變異,是物種進化的潛力[11]。本研究選用的8個微衛(wèi)星位點在古田山小麂種群中檢測出豐富的遺傳多樣性水平。基因雜合度又稱基因多樣度,一般認為它是度量群體遺傳變異的一個最適參數(shù)[34],其值越大則說明群體遺傳變異越大。在鹿科動物中麋鹿(Elaphurusdavidianus)[31]的He為0.056—0.598,平均為0.374；黑麂(Muntiacuscrinifrons)[32]為0.680—0.836,平均為0.78；馬鹿(Cervuselaphus)[11]為0.61—0.81,平均為0.74；白尾鹿(Odocoileusvirginianus)[33]為0.289—0.919,平均為0.723；梅花鹿[10](Cervusnippon)為0.257—0.863,平均為0.685。而研究中的8個微衛(wèi)星位點,平均期望雜合度(He)在0.799—0.887之間,平均為0.8429,與其它鹿科動物相比,雜合度較高。由此可知,和上述5種鹿科動物相比,小麂的等位基因數(shù)和PIC值均較高,表明本研究所選的8個微衛(wèi)星位點具有較高的使用價值,同時也說明古田山小麂種群含有豐富的遺傳多樣性。小麂的遺傳多樣性高于其他鹿科動物,這也是其分布廣泛,生存能力和適應性強的原因所在。

無效等位基因是應用微衛(wèi)星DNA進行親權鑒定中影響其準確性的主要因素[10],本研究所使用的8個微衛(wèi)星位點,雜合子豐富,其無效等位基因頻率極低,所有實驗樣品,包括3個偏離Hardy-Weinberg 平衡的位點,至少均能穩(wěn)定擴增出5個等位基因,因此無效等位基因的頻率不會影響到鑒定的準確性。在Cervus的模擬分析中,從8個微衛(wèi)星位點中隨機選取,當位點數(shù)達到6個時,從93個雌性小麂中找到其母本和從84個雄性中找出其父本的概率均超過99%,為提高鑒定的準確性, 將8個位點全部用于親權鑒定分析。在實際種群中,利用微衛(wèi)星數(shù)據(jù)得到的親緣系數(shù)通常會在理論值上下浮動,本研究所有父-子,母-子單元中,父子和母子間的平均親緣系數(shù)為0.5316,接近理論值0.50,子代間的親緣系數(shù)平均為0.3064,接近理論值0.25[9,35],進一步驗證了親權鑒定的準確性。本試驗采用X2檢驗和G統(tǒng)計檢驗Hardy-Weinberg平衡,結果發(fā)現(xiàn),共3個微衛(wèi)星位點出現(xiàn)偏離Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象。Hardy-Weinberg平衡種群的實質是指針對于一個較大的、隨機交配的群體來說,在無外界選擇,沒有個體遷入、遷出和無突變位點產(chǎn)生的假設基礎之上。Ardren等[36]指出,在瀕危物種種群中出現(xiàn)不符合Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象,主要原因有近親繁殖、種群亞結構和無效等位基因導致的雜合度不足[37]。Fis是評價種群是否存在近親繁殖的一個重要參數(shù),當Fis為正值時,表示群體內存在近交,如果是負值,則群體內不存在近交[38]。本研究中古田山小麂群體的Fis為-0.1886,可知種群之間不存在近交現(xiàn)象,排除由近交導致的種群偏離Hardy-Weinberg平衡。小麂具有較大的活動范圍,在古田山范圍內沒有任何地理障礙阻隔個體間的遷移和基因交流,小麂種群不會存在亞結構,無效等位基因頻率極低,雜合子豐富,因此排除種群亞結構和無效等位基因導致其偏離Hardy-Weinberg平衡的可能。但小麂大范圍的遷移使得保護區(qū)范圍內可能存在一定的遷入和遷出,使采樣點的小麂種群不符合理想種群的條件,導致其偏離Hardy-Weinberg平衡。同時保護區(qū)內小麂的棲息地存在片段化,破碎的棲息地使得小麂不能隨機交配,這是導致微衛(wèi)星位點偏離Hardy-Weinberg平衡的原因。

3.2 小麂的婚配制度

婚配制度是一種進化穩(wěn)定策略(evolutionarily stable strategy,ESS)[39],動物在繁殖行為中采取哪一種婚配制度,取決于動物個體之間相互作用和對外界環(huán)境的適應,影響動物婚配制度的主要生態(tài)因素可能是食物和營巢地在時間和空間上的分布情況[40],鹿科動物的婚配制度多是一雄多雌[41]。一雄多雌制主要有三種亞型[42]：資源保衛(wèi)型一雄多雌制(resource-defense polygyny),特點是雄性個體之間經(jīng)過激烈的競爭建立各自的領域,占有繁殖必需的資源,吸引處于繁殖期雌性群體的到來,從而獲得與多個雌性交配的機會；雌性或后宮保衛(wèi)型一雄多雌制(female or harem defense),特點是雄性直接占有多個配偶,雌性通常集群生活；雄性優(yōu)勢型或求偶場一雄多雌制(male dominance or lek polypyny),特點是與雄性是否占用繁殖必需的資源無關,雄性之間通過確立社會等級或求偶炫耀來競爭。小麂、黑麂、赤麂(Muntiacusmuntjak)等麂屬動物的繁殖特點是沒有季節(jié)性[41],全年均可繁殖,沒有固定的發(fā)情期和交配期,同時小麂喜獨居,個體之間的交往頻次不高[43],因此,小麂的婚配制仍屬于一雄多雌,但并不是目前所知的亞型。Odden[44]和Wegge[4]對赤麂婚配制的研究認為,赤麂的婚配類型不是一雄一雌,也不是目前所知的一雄多雌中的任何一種亞型,而是一種被稱作“檢查或搜索策略(inspection or roaming strategy)”下的一雄多雌制,即雄性通過定期檢查是否有經(jīng)過自己領域的的發(fā)情雌性,以期與多個雌性發(fā)生交配。小麂和赤麂不僅在進化上屬于近親,而且行為和生活方式也極為相似,兩者在野外都是營獨居生活的,發(fā)情期和交配期均不固定,雄性個體有各自的領域[4,45],由此可以推斷,小麂的婚配制應和赤麂相似。小麂在發(fā)情期內有明顯的標記行為,尤其是進入發(fā)情期時雄性個體的標記行為變得更為頻繁[46],雄性個體在留下自身信息的同時,也通過檢查自己領域內雌性的信息,以便和更多的雌性發(fā)生交配。在雌性的繁殖期內,雌性個體一旦受孕,便不再和其它雄性交配[47],但這種婚配關系并不固定,在下一個繁殖期,雌性個體又可以和另外一個雄性交配,因此本研究中出現(xiàn)的一個雌性和多個雄性交配的現(xiàn)象應出現(xiàn)在雌性不同的繁殖期之間。小麂的這種婚配制度,使得搜索能力強的雄性能和多個在繁殖期的雌性進行交配,增加了營獨居生活的小麂個體在繁殖期成功交配的概率。對于雌性來說,不固定的婚配關系,促進了雌雄之間的基因交流,使得子代的雜合性增加,是古田山小麂種群遺傳多樣性較高的重要原因。

3.3 保護對策

為了更好地發(fā)揮古田山保護區(qū)的作用,建議每5a復查1次,開展常規(guī)化的小麂種群數(shù)量動態(tài)監(jiān)測,這有利于掌握小麂種群數(shù)量的變化規(guī)律,同時加強對保護區(qū)內小麂棲息環(huán)境質量的監(jiān)測,包括食物(種類、可利用量、質量)、隱蔽所(類型、數(shù)量和質量)等變化特征,估算保護區(qū)內小麂的環(huán)境容納量,以及時制定和調整相應的保護對策和措施。應繼續(xù)加強當?shù)鼐用駥σ吧鷦游锏谋Ｗo意識,減少對小麂的捕獵,使小麂種群進一步擴大。同時應加強對小麂的科研力度,對影響保護區(qū)內小麂生存和繁殖的因素有較全面的理解和把握。對小麂進行人工繁育,在自然保護區(qū)的實驗區(qū),可以考慮建立以小麂為主的養(yǎng)殖場,馴養(yǎng)和繁殖人工種群,為小麂的就地保護和異地保護以及資源利用開拓新的途徑。

附錄1 Cervus 3.0軟件分析的母子鑒定結果

*：Δ值>標準Δ值(95%水平下)=0.62；+：0.62>Δ值>標準Δ值(80%水平下)=0.00

附錄2 Cervus 3.0軟件分析的父子鑒定結果

*：Δ值>標準Δ值(95%水平下)=0.51；+：0.51>Δ值>標準Δ值(80%水平下)=0.00

[1] 辜永河, 徐龍輝. 小麂一新亞種——江口亞種(偶蹄目, 鹿科). 動物學報, 1998, 44(3): 264- 270.

[2] 楊奇森, 巖崑. 中國獸類彩色圖譜. 北京: 科學出版社, 2007.

[3] Miura S. Social Behavior and Territoriality in Male Sika Deer (CervusnipponTemminck 1838) during the Rut. Ethology, 1984, 64(1): 33- 73.

[4] Wegge P, Mosand HM. Can the mating system of the size-monomorphic Indian muntjac (Muntiacusmuntjak) be inferred from its social structure, spacing behaviour and habitat? A case study from lowland Nepal. Ethology Ecology & Evolution, 2015, 27(2): 220- 232.

[5] Hemami M R, Watkinson A R, Gill R M A, Dolman P M. Estimating abundance of introduced Chinese muntjacMuntiacusreevesiand native roe deerCapreoluscapreolususing portable thermal imaging equipment. Mammal Review, 2007, 37(3): 246- 254.

[6] Yang F, O′Brien P C M, Wienberg J, Neitzel H, Lin C C, Ferguson-Smith M A. Chromosomal evolution of the Chinese muntjac (Muntiacusreevesi). Chromosoma, 1997, 106(1): 37- 43.

[7] Huang L, Jing M, Nie W, Robinson T J, Yang F. Chromosome homologies between tsessebe (Damaliscuslunatus) and Chinese muntjac (Muntiacusreevesi) facilitate tracing the evolutionary history of Damaliscus (Bovidae, Antilopinae, Alcelaphini). Cytogenetic & Genome Research, 2011, 132(4): 264- 270.

[8] 魏輔文, 饒剛, 李明, 方盛國, 馮祚建. 分子糞便學及其應用—可靠性、局限性和展望.獸類學報, 2001, 21(2): 143- 152.

[9] Blouin M S, Parsons M, Lacaille V, Lotz S. Use of microsatellite loci to classify individuals by relatedness. Molecular Ecology, 1996, 5(3): 393- 401.

[10] Castro J, Bouza C, Presa P, Pino-Querido A, Riaza A, Ferreiro I, Sánchez L, Martínez P. Potential sources of error in parentage assessment of turbot (Scophthalmusmaximus) using microsatellite loci. Aquaculture, 2004, 242(1/4): 119- 135.

[11] 田新民,張明海,張輝, 楊春文, 金志民. 黑龍江省完達山東部林區(qū)馬鹿種群遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析.生態(tài)學雜志, 2010, 29(3): 543- 548.

[12] 周璨林,艾斯卡爾·買買提,日沙來提·吐爾地,馬合木提·哈力克.非損傷技術研究天山馬鹿性別比與冬季家域.科技導報, 2015, 33(4): 91- 96.

[13] Zeyl E, Aars J, Ehrich D, Bachmann L, Wiig ?. The mating system of polar bears: a genetic approach. Canadian Journal of Zoology, 2009, 87(12): 1195- 1209.

[14] Amavet P S, Vilardi J C, Rueda E C, Larriera A, Saidman B O. Mating system and population analysis of the broad-snouted caiman (Caimanlatirostris) using microsatellite markers. Amphibia-Reptilia, 2012, 33(1): 83- 93.

[15] Gazda G, Kuehn R, Sato N J, Keita D Tanaka, Okahisa Y, Ueda K. Establishment of microsatellite markers to assess the mating system of the fan-tailed gerygone (Gerygoneflavolateralis) for studying cuckoo-host arms race. Annales Zoologici Fennici, 2016, 52(5/6): 280- 284.

[16] Garnier J N, Bruford M W, Goossens B. Mating system and reproductive skew in the black rhinoceros. Molecular Ecology, 2001, 10(8): 2031- 2041.

[17] Chen X, Jiang K, Bao Y, Wang H, Shi W, Zheng W. The mating system study of black muntjac (Muntiacuscrinifrons) based on fecal DNA. Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(5): 137- 141.

[18] 程宏毅,鮑毅新,鄭榮泉, 陳良, 葛寶明. 黑麂糞便DNA提取及其PCR檢測.生態(tài)科學, 2006, 25(2): 158- 161.

[19] 李晉,陶艾艾,孟凱, 吳海龍. 一種鹿科動物標本的分子鑒定.獸類學報, 2009, 29(1): 106- 108.

[20] 華育平,張瓊,徐艷春,鄭冬.虎物種特異性鑒定的PCR方法研究.獸類學報, 2004, 24(2): 103- 108.

[21] Yan P,Wu X B,Shi Y, Gu C M, Wang R P, Wang C L. Identification of Chinese alligators (Alligatorsinensis) meat by diagnostic PCR of the mitochondrial cytochromebgene. Biological Conservation, 2005, 121(1): 45- 51.

[22] Wang H, Luo X, Shi W B, Zhang B W. Development and characterization of fourteen novel microsatellite loci in Chinese muntjac (Muntiacusreevesi). Conservation Genetics Resources, 2013, 5(4): 1083- 1085.

[23] Wang H, Luo X, Shi W B, Zhang B W. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci of the Chinese muntjac (Muntiacusreevesi). Genetics & Molecular Research, 2014, 13(1): 1905- 1908.

[24] 魯曉瑄, 張悅, 單祥年. 小麂Sry基因的克隆和測序. 遺傳, 2003, 25(3): 299- 301.

[25] Bellemain E, Swenson J E, Tallmon D, Brunberg S, Taberlet P. Estimating population size of elusive animals with DNA from hunter-collected feces: four methods for brown bears. Conservation Biology, 2005, 19(1): 150- 161.

[26] Kalinowski S T, Taper M L, Marshall T C. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology, 2007, 16(5): 1099- 1106.

[27] Konovalov D A, Manning C, Henshaw M T. KINGROUP: a program for pedigree relationship reconstruction and kin group assignments using genetic markers. Molecular Ecology Notes, 2004, 4(4): 779- 782.

[28] Raymond M, Rousset F. GENEPOP (Version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism. Journal of Heredity, 1995, 86(3): 248- 249.

[29] Louis Bernatchez P D. Individual-based genotype analysis in studies of parentage and population assignment: how many loci, how many alleles?. Canadian Journal of Fisheries & Aquatic Sciences, 2000, 57(1): 1- 12.

[30] Botstein D, White R L, Skolnick M, Davis R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, 1980, 32(3): 314- 331.

[31] Wu H L, Ni X W, Zhang L Y, Xia J S, Zhong Z Y, Zhu G P, Wan Q H. Eighteen novel polymorphic microsatellite loci developed from the Père David′s deer (Elaphurusdavidianus). Conservation Genetics, 2008, 9(6): 1679- 1682.

[32] Wu H L, Wan Q H, Fang S G. Microsatellite analysis of genetic variation and population subdivision for the black muntjac,Muntiacuscrinifrons. Biochemical Genetics, 2008, 45(11- 12): 775- 788.

[33] Anderson J D, Honeycutt R L, Gonzales R A, Gee K L, Skow L C, Gallagher R L, Honeycutt D A, DeYoung R W. Development of microsatellite DNA markers for the automated genetic characterization of white-tailed deer populations. Journal of Wildlife Management, 2002, 66(1): 67- 74.

[34] Nei M. Molecular population genetics and evolution. Frontiers of Biology, 1975, 40: 1-208.

[35] Queller D C, Goodnight K F. Estimating relatedness using genetic markers. Evolution, 1989, 43(2): 258- 275.

[36] Ardren W R, Borer S, Thrower F, Joyce J E, Kapuscinski A R. Inheritance of 12 microsatellite loci inOncorhynchusmykiss. Journal of Heredity, 1999, 90(5): 529- 536.

[37] Lade J A, Murray N D, Marks C A, Robinson N A. Microsatellite differentiation between Phillip Island and mainland Australian populations of the red foxVulpesvulpes. Molecular Ecology, 1996, 5(1): 81-87.

[38] Weir B S, Cockerham C C. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution, 1984, 38(6): 1358- 1370.

[39] Odng L W. Avian mating system//Famer D S, King J R ed. Avinn Biology (VI). New York: Academic Press, 1982: 1- 92.

[40] 張建軍,張知彬.動物的婚配制度.動物學雜志, 2004, 38(2): 84- 89.

[41] 盛和林.中國鹿科動物.生物學通報, 1992, (5): 4- 7.

[42] Krasnec M O, Cook C N, Breed M D. Mating systems in sexual animals. Nature Education Knowledge, 2012, 3(10): 72- 72.

[43] 徐宏發(fā),周自力,盛和林.黃麂習性的初步觀察.野生動物學報, 1990, (2): 18- 19.

[44] Odden M, Wegge P. Predicting spacing behavior and mating systems of solitary cervids: A study of hog deer and Indian muntjac. Zoology, 2007, 110(4): 261- 270.

[45] Mccullough D R, Pei K C J, Wang Y. Home range, activity patterns, and habitat relations of Reeves′ muntjacs in Taiwan. The Journal of Wildlife Management, 2000, 64(2): 430- 441.

[46] 吳玥,康藹黎,蘇鐵,張恩迪. 黃麂標記行為初探.四川動物, 2004, 22(2): 73- 75.

[47] Yahner R H. Temporal patterns in male mating behavior of captive reeve′s Muntjac (Muntiacusreevesi). Journal of Mammalogy, 1979, 60(3): 560- 567.

ParentageverificationandmatingsystemofChinesemuntjac(Muntiacusreevesi)basedonfecalDNA

REN Peng,GONG Kun,BAO Yixin*,HUANG Xiangxiang,ZHOU Xiao,HAN Jinqiao

InstituteofEcology,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China

Microsatellite technology was utilized in the present study to investigate paternity testing, mating system, genetic diversity, and population quantity of Chinese muntjac (Muntiacusreevesi) to increase the knowledge of relationships between members of the species, reproductive strategies, and evolution potential. Therefore, the present study aims to assist the facilitation of in-depth research and protection of the species. We collected 634 fecal samples and 2 muscle samples from Chinese muntjac (M.reevesi) in Gutianshan National Nature Reserve in January 2013 and April 2014. After repeated experiments, 8 microsatellite loci were selected, which had stable amplification and high polymorphism information, and 442 samples were utilized for polymerase chain reaction (PCR) amplification. Based on the preliminary identification in terms of the fecal morphology, a verification test was conducted with the mitochondrial cytochrome b gene (Cyt b), which was regarded as a supplement to the species identification. Individual identification for Chinese muntjac was conducted by contrasting the fingerprints synthesized by the eight microsatellite marker genotypes. The SRY gene was amplified at three times to reduce any false negative influence on the fecal samples, where the target band was identified as male when it appeared more than two times. The SRY gene and 8 microsatellite loci were utilized for sexual and individual identification, respectively, and 177 individuals, including 94 females and 83 males, were identified. The results showed that the total number of microsatellite alleles were 88, and the mean number of alleles was 11, ranging from 8 to 16, and the mean observed and expected heterozygosities were 0.9685 (0.960—1.000) and 0.8429 (0.799—0.887), respectively. The polymorphism information content ranged from 0.766 to 0.872, with an average of 0.821. Based on the above data, the Chinese muntjac population in Gutianshan National Nature Reserve has a high level of genetic diversity. The identification of 8 microsatellite loci identification rate from Cervus3.0 was 100%, when the confidence level was 95% and 80%. Among 24 parentage groups, 19 father-child relationships and 23 mother-child relationships were obtained among 104 individuals. The result of the relationship analysis showed that the mating system of Chinese muntjac belongs to a polygyny. However, it does not belong to any known subtypes, and this polygyny might be called a “check strategy”. During the female reproductive period, once the female individual is pregnant she will not mate with any other males. However, the relationship is not fixed and the female might still mate with another male in the next breeding season. Therefore, in the present study, the mating phenomenon of a female and several males appeared in different breeding periods.

Chinese muntjac (Muntiacusreevesi); parentage identification; genetic diversity; mating system

古田山國家級自然保護區(qū)資助項目

2016- 08- 02; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡出版日期

日期:2017- 06- 01

*通訊作者Corresponding author.E-mail: baoyix@21cn.com

10.5846/stxb201608021591

任鵬,龔堃,鮑毅新，黃相相, 周曉, 韓金巧.基于糞便DNA的小麂親權鑒定和婚配制研究.生態(tài)學報,2017,37(20):6933- 6944.

Ren P,Gong K,Bao Y X,Huang X X,Zhou X,Han J Q.Parentage verification and mating system of Chinese muntjac (Muntiacusreevesi) based on fecal DNA.Acta Ecologica Sinica,2017,37(20):6933- 6944.