程 華，楊梅燕，吳佳輝，孫 楠，黃健子，鄭易之，劉 昀

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省植物表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060

【生物工程/Bioengineering】

利用數(shù)字表達(dá)譜分析擬南芥葉片中鹽響應(yīng)基因

程 華，楊梅燕，吳佳輝，孫 楠，黃健子，鄭易之，劉 昀

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省植物表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060

為揭示擬南芥在鹽脅迫下基因表達(dá)譜的變化，為解決鹽害提出新的方向，以哥倫比亞野生型擬南芥為材料，利用數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)(digital gene expression profiling，DGEP)分析鹽脅迫組(200 mmol/L NaCl處理2 h)和對(duì)照組的擬南芥葉片互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)文庫(kù)，鑒定鹽脅迫下擬南芥中差異表達(dá)的基因．結(jié)果顯示，鹽脅迫組中共有4 400個(gè)基因發(fā)生了差異表達(dá)，其中，1 513個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，約占34.39%；2 887個(gè)下調(diào)表達(dá)，約占65.61%．這些基因主要富集于22個(gè)基因本體(gene ontology, GO)條目，包括核糖體構(gòu)成、細(xì)胞膜和細(xì)胞器組成、應(yīng)答脅迫、脯氨酸代謝等過程．進(jìn)一步的KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析表明，基礎(chǔ)代謝、次生代謝以及光合和氧化代謝等32個(gè)通路的基因顯著富集．此外，本研究篩選到6個(gè)顯著差異表達(dá)的胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant, LEA)基因，其中，3個(gè)LEA基因在鹽脅迫條件下上調(diào)表達(dá)，3個(gè)下調(diào)表達(dá)，暗示著這6個(gè)LEA基因可能是擬南芥在應(yīng)答鹽脅迫過程發(fā)揮關(guān)鍵作用的抗逆基因．

擬南芥；LEA基因；乙烯應(yīng)答因子；鹽脅迫；數(shù)字基因表達(dá)譜；差異表達(dá)基因

土壤鹽堿化是一種嚴(yán)重破壞植物生長(zhǎng)的非生物脅迫因子[1]．鹽脅迫對(duì)植物的影響主要表現(xiàn)為離子毒害、滲透失衡、產(chǎn)生氧化自由基以及積累有毒物質(zhì)等．不過在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程，植物體形成了一定的模式來適應(yīng)環(huán)境的改變[2-3]．在鹽脅迫過程中植物會(huì)誘導(dǎo)合成一系列蛋白，如離子通道蛋白、胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant, LEA)、滲調(diào)蛋白和毒性降解酶(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、可溶性環(huán)氧化物水解酶)等，以保護(hù)植物體細(xì)胞在脅迫條件下免受傷害[4]．

植物耐鹽性受多基因共同調(diào)控[2-3]，分離和鑒定這些耐鹽基因是植物基因資源研究的重要內(nèi)容．目前很多研究是利用模式生物擬南芥作為挖掘植物抗逆基因資源的來源，通過遺傳突變法、基因芯片、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)獲得了5組鹽超敏感(salt overly sensitive, SOS)[5-7]、分子伴侶、轉(zhuǎn)錄因子、小核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)[8]、參與乙烯信號(hào)通路關(guān)鍵基因MAPK6 (mitogen-activatedproteinkinase6)[9]和LEA基因[10]等大量的擬南芥鹽脅迫響應(yīng)的功能基因．其他物種耐鹽基因挖掘工作也有很多，如鹽脅迫下在紫花苜蓿中發(fā)現(xiàn)了膽汁酸：Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、LEA蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)因子[11]；鹽脅迫的下香蕉葉片中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)鈣調(diào)素(CaM)基因參與脅迫響應(yīng)[12]；番茄響應(yīng)鹽脅迫基因主要集中在氨基酸代謝途徑和碳水化合物途徑[13]．許多關(guān)于植物抵抗逆境脅迫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都涉及眾多代謝途徑和大量基因，是一個(gè)復(fù)雜的過程，這在一定程度上限制了人們對(duì)植物抗逆性的研究．隨著數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)的應(yīng)用，大量響應(yīng)干旱、低溫和高鹽等耐脅迫基因的發(fā)現(xiàn)，大大地加快了植物遺傳育種和新品種培育的步伐[14]．

數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)具有不依賴基因組序列信息，數(shù)字化信號(hào)更精確、檢測(cè)質(zhì)量更高、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，成為挖掘和研究功能基因的重要技術(shù)[14]．相對(duì)基因芯片技術(shù)，王興春等[15]利用數(shù)字表達(dá)譜檢測(cè)擬南芥不定芽時(shí)發(fā)現(xiàn)了一批新基因(如Clavata3/Esr-related2CLE2、ERF13和GretchenHagen3GH3等)， 同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)Responseregulator5(ARR5)和RAP2.6L表達(dá)上調(diào)，與Che等[16]基因芯片結(jié)果一致．這從側(cè)面反映了數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)所獲得的表達(dá)譜信息具有可靠性并能真實(shí)反映生物脅迫響應(yīng)機(jī)制[17]，因此，數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)成為研究植物脅迫響應(yīng)基因差異表達(dá)的有效方法．目前，利用數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)已經(jīng)對(duì)大豆、鹽芥和花生等植物的逆境響應(yīng)基因展開了研究[18-20]，但未見利用數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)分析擬南芥鹽脅迫應(yīng)答基因的報(bào)道．

本研究以哥倫比亞野生型擬南芥為材料，利用數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)對(duì)鹽脅迫處理的擬南芥在轉(zhuǎn)錄水平上的基因變化進(jìn)行分析，全面研究鹽脅迫條件下差異表達(dá)的基因及LEA基因的表達(dá)，為深入探究植物耐鹽機(jī)制奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬南芥為哥倫比亞野生型．萌發(fā)培養(yǎng)基含1/2 MS、20 g/L蔗糖和8 g/L瓊脂粉，pH=5.8．

1.2 方 法

1.2.1 擬南芥幼苗的培養(yǎng)

擬南芥種子經(jīng)過消毒后點(diǎn)播在1/2 MS培養(yǎng)基平板上，4 ℃避光春化48 h后，置于溫室培養(yǎng)．培養(yǎng)條件是22 ℃，16 h光照/8 h黑暗．7 d后，將幼苗轉(zhuǎn)移到泥炭蘚土里繼續(xù)培養(yǎng)，到第15 天選取長(zhǎng)勢(shì)相近植株設(shè)置2組，1組幼苗正常澆水作為對(duì)照組，另1組幼苗澆濃度200 mmol/L NaCl溶液作為脅迫組，2 h后分別提取對(duì)照組和脅迫組幼葉，用作提取RNA的材料．

1.2.2 擬南芥幼苗RNA的提取和數(shù)字基因表達(dá)譜檢測(cè)

利用TRIzol Reagent(Invitrogen，Carisbad，CA，USA)法提取葉片總RNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證質(zhì)量合格后，用Dynabeads Oligo(dT)25磁珠從總RNA中分離并富集mRNA．以mRNA為模板，在磁珠上合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)第1鏈，再合成第2鏈．用限制內(nèi)切酶酶切cDNA后接上Adaptor Ⅰ，隨后用Ⅱ類限制內(nèi)切酶切割cDNA產(chǎn)生小片段，并從磁珠上釋放到溶液中，再接上Adaptor Ⅱ．最后PCR擴(kuò)增及對(duì)選擇片段進(jìn)行富集，建好文庫(kù)后利用PSTAR-Ⅱ Plus測(cè)序儀(深圳華因康基因科技有限公司)進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序．

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)量的計(jì)算使用RPKM(reads per kilobases per million reads)法，該方法可以消除基因的長(zhǎng)度和測(cè)序深度差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)量的影響，因此，可用RPKM直接比較不同樣本的基因表達(dá)差異．差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)≤0.001，且差異表達(dá)倍數(shù)k≥2的基因．

GO功能顯著性富集采用GO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)進(jìn)行，將差異表達(dá)的基因向GO數(shù)據(jù)庫(kù)的各條目(term)映射．計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)目，P≤0.05為顯著富集的GO term．分析GO注釋的結(jié)果，尋找與生物學(xué)意義的關(guān)聯(lián)性．顯著性富集分析(pathway enrichment analysis)采用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行，將差異表達(dá)基因向KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)映射，并統(tǒng)計(jì)基因在每個(gè)通路的富集程度．

從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)TAIR下載擬南芥LEA基因序列，通過blast2GO比對(duì)測(cè)序結(jié)果．同樣用RPKM值來表示LEA基因的表達(dá)量，將FDR≤0.001，且k≥2的LEA基因認(rèn)為是在HYK-1和HYK-2中差異表達(dá)的LEA基因．

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序與質(zhì)量評(píng)估

本研究以濃度為200 mmol/L NaCl處理2 h樣品為鹽脅迫組(HYK-2)，沒有鹽處理樣品為對(duì)照組(HYK-1)．利用數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，去除冗余后分別得到13 205 155和14 909 158個(gè)過濾后序列(clean reads)；能有效匹配擬南芥參考基因組序列(https://www.arabidopsis.org/)的分別為12 566 271和14 174 347個(gè)．通過進(jìn)一步篩選，最終得到6 846 014和7 691 706個(gè)高質(zhì)量 reads，用作DEGs的篩選．此外，HYK-1和HYK-2的 Q30 Bases 均達(dá)91.15%，其中，Q30 Bases指堿基識(shí)別正確率達(dá)99.9%.以上表明，數(shù)據(jù)產(chǎn)出各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)較一致，未見異常．基因覆蓋度分析表明兩樣本大致呈略帶偏度的正態(tài)分布，說明測(cè)序通量基本滿足表達(dá)譜分析的要求．

2.2 差異表達(dá)基因的分析

通過比對(duì)測(cè)序得到的reads和廣泛通用的基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Unigene)的序列，可以得到Unigene在對(duì)應(yīng)樣品中的表達(dá)豐度，計(jì)算RPKM值來反映對(duì)應(yīng)Unigene的表達(dá)豐度．以FDR≤0.001， 且k≥2作為篩選HYK-1及HYK-2組之間DEG的標(biāo)準(zhǔn)．當(dāng)一個(gè)基因在鹽脅迫組中有更高的表達(dá)水平，把該基因定義為上調(diào)表達(dá)(up-regulated)；而當(dāng)一個(gè)基因在HYK-1中有更高的表達(dá)水平，則把該基因定義為下調(diào)表達(dá)(down-regulated)．由此共篩選到4 400個(gè)DEG，其中，1 513個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，占34.39%左右，2 887個(gè)下調(diào)表達(dá)，占65.61%左右，這些在鹽脅迫后表達(dá)差異的基因，可能在擬南芥的抗鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用．

圖1 正常和鹽脅迫條件下擬南芥差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Fig.1 Statistical analysis of differentially expressed genes in Arabidopsis thaliana

通過DEG差異表達(dá)倍數(shù)分級(jí)比較可見，基因表達(dá)水平變化主要集中在4倍以內(nèi)，尤其是2～4倍，這類DEG占差異表達(dá)基因總數(shù)的69.68%．而表達(dá)差異在4～30倍的基因占總DEG的24.43%，表達(dá)差異為30～1 000倍的基因占總DEG的0.25%．表達(dá)差異1 000倍以上的所有基因只有總DEG的5.64%(圖1)．以上表明，脅迫條件下大多數(shù)基因表達(dá)差異發(fā)生在低水平上，僅少數(shù)基因可以發(fā)生相對(duì)較高水平表達(dá)變化．經(jīng)基因功能注釋后發(fā)現(xiàn)，這些差異1 000倍以上的差異基因主要是與蛋白調(diào)控、脅迫及能量合成有關(guān)的基因，如At5g15960、At5g03840、At5g59970、At2g40350(表1)． 此外，擬南芥在鹽脅迫條件下多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也發(fā)生較大變化，如At1g09540(屬于MYB(myeloblastosis)家族蛋白)和At2g42150分別上調(diào)213.05和213.75； At4g28815(屬于bHLH(basic helix-loop-helix)家族蛋白)和At5g67060分別下調(diào)213.79和213.77；At4g34410、At1g06160和At1g71130(屬于乙烯應(yīng)答因子(ethylene-responsive transcriptional factor, ERF))分別下調(diào)213.59、214.04和214.48．

表1 擬南芥鹽脅迫差異表達(dá)215倍以上的基因

2.3 差異基因的GO聚類分析

GO功能分析一方面給出差異表達(dá)基因的GO功能分類注釋，另一方面給出差異表達(dá)基因的GO功能顯著性富集分析．為了進(jìn)一步分析在HYK-1和HYK-2中的基因表達(dá)變化特征，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出了與整個(gè)基因組背景相比、在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO功能條目，由此篩選出與差異表達(dá)基因顯著相關(guān)的生物學(xué)功能．

以差異基因GO條目P≤0.05為GO富集的選擇標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到22個(gè)GO具有顯著性富集．其中，描述分子功能(molecular function)的有2類，描述生物過程(biological process)的有4類，描述細(xì)胞組成(cellular component)的有16類(圖2)．差異基因GO聚類分析表明，差異表達(dá)基因的功能具有多樣性．在鹽脅迫條件下氨基酸、蛋白質(zhì)的合成及蛋白質(zhì)運(yùn)輸和光合作用等過程中，相關(guān)的酶類出現(xiàn)了活性降低的情況，這與杜仲葉片及大豆葉片等轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相似[21-22]，說明植物轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是相對(duì)穩(wěn)定但又高度靈敏的．這些顯著富集的GO條目說明了與應(yīng)答脅迫和刺激、細(xì)胞膜和細(xì)胞器組成等相關(guān)基因在擬南芥鹽脅迫過程發(fā)揮重要作用．

圖2 差異基因GO功能注釋聚類圖Fig.2 GO categories of differentially expressed genes under salt stress

2.4 差異基因的Pathway聚類分析

在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和分類，通過顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑．在Q值(P值的校正值)≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)的顯著性富集分析中，鹽脅迫下總共有2 354個(gè)基因得到注釋，分布于32個(gè)代謝通路中．這些差異表達(dá)基因廣泛涉及4類生物大分子物質(zhì)代謝、光合作用、次生代謝和氧化代謝等．其中，涉及蛋白代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)通路所占比例最多，占35.84%，主要包括蛋白酶體、內(nèi)吞作用、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等過程；其次是糖代謝通路，占21.09%，如糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、果糖及甘露糖代謝途徑等；光合作用相關(guān)通路如光合作用、葉綠素代謝、固氮作用等過程占11.81%；氧化磷酸化代謝如過氧化物酶體及次生產(chǎn)物，如維生素B6、硒化合物代謝也有發(fā)生改變．這些富集代謝途徑表明，鹽脅迫影響擬南芥基礎(chǔ)代謝、次生代謝和光合及氧化磷酸化作用等各個(gè)方面，如脯氨酸積累、果糖和甘露糖積累等富集途徑都是典型的滲透脅迫防御機(jī)制．總的來說，在這些能夠注釋到通路圖的DEGs中，與糖類、蛋白、脂類和核酸等4類生物大分子代謝相關(guān)基因共占83.01%；光合作用及氧化磷酸化相關(guān)基因占15.25%；次生代謝的所占比例為1.74%．

2.5 LEA基因響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)答的分析

擬南芥共有51個(gè)LEA基因[10,23]，參考文獻(xiàn)[10]對(duì)脅迫組和對(duì)照組表達(dá)的LEA基因分組結(jié)果如圖3．由圖3可知，HYK-1和HYK-2中分別檢測(cè)到擬南芥LEA基因25個(gè)(49.02%)和27個(gè)(52.9%)， 覆蓋了9個(gè)組[10]， 差異表達(dá)基因主要源自LEA-4、PvLEA18和SMP(seed maturation protein)3個(gè)組．由表2可知，HYK-1和HYK-2差異表達(dá)的LEA基因中受鹽誘導(dǎo)的分別為15個(gè)和14個(gè)；在表達(dá)譜中沒有被檢測(cè)到LEA基因大部分是種子特異表達(dá)的LEA基因(如At2g18340和At2g21490)．與HYK-1相比，HYK-2中At1g02820、At5g06760和At2g36640三個(gè)LEA基因表達(dá)量上調(diào)約2.5倍，At1g01470、At2g23120和At4g36600三個(gè)LEA基因下調(diào)至原來的1/3．文獻(xiàn)[10]報(bào)道了14個(gè)能在葉中表達(dá)的LEA基因，本研究HYK-1中檢測(cè)到9個(gè)，HYK-2中7個(gè)． 這表明LEA蛋白各成員在不同鹽脅迫的條件下可能發(fā)揮不同的功能或者響應(yīng)信號(hào)各異．

圖3 對(duì)照組和脅迫組表達(dá)的LEA基因分組Fig.3 The number of different group of LEA genes under normal and salt stress

序號(hào)基因ID樣本1基因表達(dá)值樣本2基因表達(dá)值差異倍數(shù)表達(dá)情況分組[10]在葉中表達(dá)[10]受鹽誘導(dǎo)[10]1At1g01470126.4560.32-1.07-LEA-2√√2At1g028202.566.241.29+dehydrin3At1g031200.240.64×LEA-34At1g20440442.58528.19×SMP√√5At1g325600.75×LEA-46At1g526900.65×LEA-4√√7At1g544106137.553828.07×dehydrin√√8At1g721000.07×PvLEA189At1g761800.780.12×LEA-410At2g03740×AtM11At2g038500.17×AtM12At2g231101.510.84×LEA-413At2g23120416.67130.28-1.68-SMP√√14At2g336900.3×dehydrin15At2g353000.24×LEA-516At2g366400.330.881.42+LEA-417At2g401701.070.19×LEA-4√√18At2g412800.220.19×LEA-419At2g42530393.41163.71×SMP√√20At2g4254079.6259.55×SMP√√21At2g425600.21×dehydrin22At2g440601.192.2×LEA-123At2g461400.340.3×dehydrin24At3g156700.13×dehydrin25At3g225000.590.42×LEA-426At3g5097012.647.03×LEA-2√√27At3g537700.19×LEA-428At4g02380LEA-4√√29At4g132300.19×LEA-430At4g1356022.5423.27×LEA-431At4g159100.39×PvLEA18√√32At4g210200.33×LEA-433At4g366000.880.39-1.17-SMP34At5g067602.144.761.15+LEA-5√√35At5g279800.47×dehydrin36At5g66400SMP√√

1)“+”表示在HYK-2中上調(diào)表達(dá)；“-”表示在鹽脅迫組中下調(diào)表達(dá)；“×”表示在HYK-1及HYK-2中表達(dá)沒有差異；“表達(dá)情況”列空白表示在表達(dá)譜沒有檢測(cè)到；“在葉中表達(dá)”及“鹽誘導(dǎo)”列“√”表示Hundertmark等[10]發(fā)現(xiàn)在葉中并受鹽誘導(dǎo)的LEA基因，空白表示在葉中沒有檢測(cè)到的LEA基因且不受鹽誘導(dǎo)．

3 討 論

數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于許多植物的功能性基因組學(xué)研究. 文獻(xiàn)[15,24]對(duì)擬南芥和甘藍(lán)不定芽的數(shù)字表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)，能與參考基因組匹配的reads分別約為92.96%和85.80%，特異匹配(unique match)約為58.76%和87.7%. 而本研究HYK-1和HYK-2各有95.16%和95.07%的reads 能比對(duì)到參考序列上，unique match分別達(dá)到51.84%和51.59%，這說明本研究測(cè)序結(jié)果和參考序列可靠；在鹽脅迫條件下，本研究共獲得了4 400個(gè)DEGs，結(jié)果比較理想，基因覆蓋度也未見異常，說明數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)能得到廣泛的基因表達(dá)信息[25]，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)在質(zhì)量上可靠，在測(cè)序深度上相對(duì)要好.

擬南芥在干旱、低溫等脅迫條件下的差異基因主要富集在糖、脂類和蛋白等4大類基礎(chǔ)物質(zhì)代謝途徑中，也有少部分富集在光合作用途徑中[9]．對(duì)番茄、花生和油菜干旱應(yīng)答的研究中發(fā)現(xiàn)了約400個(gè)干旱脅迫相關(guān)基因，包括許多轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)蛋白，如ERF、bHLH、WRKY、C2H2(Cys2/His2)型鋅指蛋白、MYB 和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)等[26-28]. 本研究結(jié)果表明，鹽脅迫條件下，大部分的DEG在基礎(chǔ)代謝和光合作用途徑方面占很大比重，其中，光合作用途徑占11.87%，涵蓋從光合作用到卟啉和葉綠素代謝等途徑，且多為下調(diào)表達(dá)，與徐照龍等[29]研究結(jié)果類似．一些參與了離子轉(zhuǎn)運(yùn)、滲透調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及分子伴侶的合成等過程的基因表達(dá)量差異較大，甚至達(dá)1 000倍以上(表1)．例如，調(diào)控細(xì)胞分裂素激活信號(hào)通路的At1g31880基因表達(dá)量顯著下調(diào)，這與植物在受到鹽脅迫時(shí)，生長(zhǎng)減緩，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂的基因下調(diào)，以保存能量的特性相符[30]．但在Shen等[9]的研究結(jié)果中，參與細(xì)胞壁修飾(木質(zhì)素合成和細(xì)胞壁松動(dòng)等)基因上調(diào)，結(jié)合本研究調(diào)控細(xì)胞分裂素激活信號(hào)通路的At1g31880基因表達(dá)量顯著下調(diào)的結(jié)果可以推測(cè)，在長(zhǎng)期脅迫下植物細(xì)胞分裂減慢從而能導(dǎo)致生長(zhǎng)減緩，而木質(zhì)素合成增加，增強(qiáng)了植物細(xì)胞壁的剛性和不滲透性，還會(huì)提高木質(zhì)化程度減少水分的蒸騰，且保持正常的膨脹壓力[31-32]，從而更好地適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境；同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子MYB(At2g42150和At1g09540)上調(diào)，ERF(At4g34410、At1g06160和At1g71130)下調(diào)，與Shen等[9]結(jié)果一致，升高的轉(zhuǎn)錄因子有效的誘導(dǎo)下游防御基因，而作為乙烯信號(hào)傳導(dǎo)中早期的ERF減少，減弱了乙烯信號(hào)的傳導(dǎo)，減少乙烯的合成從而提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性，許多研究認(rèn)為植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力與乙烯合成呈負(fù)相關(guān)，乙烯合成越多植物對(duì)鹽脅迫的耐受力越差[9]．At3g12320和At3g55740等基因上調(diào)表達(dá)，這與鹽脅迫誘導(dǎo)能增加脯氨酸含量，減少活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量，從而加強(qiáng)了植物的鹽脅迫抗性、降低脂質(zhì)過氧化及保持膜的完整性等途徑來減少鹽脅迫下細(xì)胞的死亡相關(guān)[28,33]．因此，在鹽脅迫下擬南芥通過改變多種代謝途徑和信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，尤其是增加部分氧化系統(tǒng)、滲透系統(tǒng)和光合系統(tǒng)等基因的表達(dá)，有利于其減少細(xì)胞膜和質(zhì)體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷．

LEA蛋白是參與植物逆境應(yīng)答的一類重要蛋白質(zhì)家族．它們廣泛存在于棉花、擬南芥、大豆、小麥和玉米[34]等植物中．其中，擬南芥中有51個(gè)LEA基因[10,23]．根據(jù)LEA蛋白的保守序列特性可將其分為9組[10]，各組成員的時(shí)空表達(dá)是不同的．Hundertmark等[10]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，14個(gè)LEA基因能在擬南芥葉中表達(dá)，其中，有12個(gè)LEA基因可被干旱、冷和鹽等脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，且LEA4可以增強(qiáng)植株的抗旱能力[35]．本研究共檢測(cè)到34個(gè)LEA基因能在擬南芥葉中表達(dá)．在鹽脅迫條件下3個(gè)上調(diào)表達(dá)，3個(gè)下調(diào)表達(dá)，28個(gè)表達(dá)沒有差異．其中，有3個(gè)LEA基因(At1g02820、At2g36640和At4g36600)在鹽脅迫下的差異表達(dá)是首次報(bào)道. 此外，At5g06760和At1g01470基因的表達(dá)變化與Hundertmark等[10]研究結(jié)果不一致，這可能是由擬南芥培養(yǎng)方法、鹽脅迫濃度和時(shí)間存在差異等引起的．這些在鹽脅迫條件下發(fā)生差異表達(dá)的LEA基因，可能在響應(yīng)鹽脅迫過程中起重要作用，使生物對(duì)滲透脅迫作出快速響應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透，有效地減少傷害．

結(jié) 語(yǔ)

本研究以哥倫比亞野生型擬南芥為材料， 以正常培養(yǎng)和鹽脅迫條件下的兩個(gè)樣品葉片進(jìn)行表達(dá)譜分析，鑒定出4 400個(gè)差異表達(dá)基因，其中，1 513個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，2 887個(gè)基因下調(diào)表達(dá)．GO和KEGG代謝途徑分析明確了差異表達(dá)基因富集的分子功能和代謝途徑．篩選到6個(gè)顯著差異表達(dá)的LEA基因，可能是擬南芥在應(yīng)答鹽脅迫過程發(fā)揮關(guān)鍵作用的抗逆基因，為進(jìn)一步深入研究植物的耐鹽機(jī)制以及LEA蛋白在植物抗逆功能中的作用奠定了基礎(chǔ)．

致謝：感謝深圳華因康基因科技有限公司在基因表達(dá)譜分析中的幫助以及深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院姜亮博士在數(shù)據(jù)分析中的悉心指導(dǎo)！

引文：程 華，楊梅燕，吳佳輝，等．利用數(shù)字表達(dá)譜分析擬南芥葉片中鹽響應(yīng)基因 [J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2017，34(6)：631-639.

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【中文責(zé)編：晨兮；英文責(zé)編：艾琳】

2017-05-30；Revised2017-09-20；Accepted2017-09-25

Associote professor Liu Yun．E-mail: sunshine@szu.edu.cn

DigitalgeneexpressionprofilesofArabidopsisthalianaundersaltstress

ChengHua,YangMeiyan,WuJiahui,SunNan,HuangJianzi,ZhengYizhi,andLiuYun

College of Life Sciences and Oceanography, Guangdong Provincial Key Laboratory for Plant Epigenetic, Shenzhen Key Laboratory of Microbiology and Gene Engineering, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

Salt stress is one of the most serious abiotic stresses limiting crop growth and yield. Exploring the salt stress response gene can provide a new direction for solving salt damage. In order to reveal theArabidopsisthalianagenes expression under salt stress, we explore the digital gene expression profiles (DGEP) ofArabidopsisthaliana(Columbia-0) leaves treated with water (control) or 200 mmol/L NaCl for 2 h. By comparison of gene expression of the treatment and control, 4 400 genes are identified to be differentially expressed, among which 1 513 genes are up-regulated, 2 887 genes are down-regulated. Gene ontology (GO) reveals that these genes are involved in 22 GO terms such as structural constituent of ribosome, membrane, response to stimulus, response to stress, and proline metabolism. Thirty-two pathways are enriched by Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG), including basic metabolism, secondary metabolism and oxidation-reduction processes. Meanwhile, 6 genes encoding late embryogenesis abundant (LEA) proteins are identified to express differently, which indicates that theseLEAgenes might be important in stress response process.

Arabidopsisthaliana; late embryogenesis abundant (LEA) gene; ethylene-responsive transcriptional factor (ERF); salt stress; digital gene expression profiling (DGEP); differentially expressed gene (DEG)

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31300215, 31370289 )

：Cheng Hua, Yang Meiyan, Wu Jiahui, et al．Digital gene expression profiles ofArabidopsisthalianaunder salt stress[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(6): 631-639.(in Chinese)

Q 943.2；Q 786

A

10.3724/SP.J.1249.2017.06631

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31300215, 31370289)

程 華(1992—)，男，深圳大學(xué)碩士研究生．研究方向：植物抗逆. E-mail:648577459@qq.com