孫錦霞，王 瑞，譚 笑，焦琛琛，黃 鐘

1)深圳大學醫(yī)學部中心實驗室，廣東深圳518060；2)聊城大學藥學院，山東聊城252059；3)上海市第十人民醫(yī)院中心實驗室，上海200072；4)同濟大學醫(yī)學院，上海200072

【生物工程/Bioengineering】

2-BP對中性粒細胞趨化性的抑制作用

孫錦霞1，王 瑞2，譚 笑3，焦琛琛4，黃 鐘1

1)深圳大學醫(yī)學部中心實驗室，廣東深圳518060；2)聊城大學藥學院，山東聊城252059；3)上海市第十人民醫(yī)院中心實驗室，上海200072；4)同濟大學醫(yī)學院，上海200072

為研究棕櫚酰化對中性粒細胞趨化性的調節(jié)作用，利用2-溴棕櫚酸(2-bromopalmitate, 2-BP)或棕櫚酸(palmitate)預處理來源于骨髓的中性粒細胞．采用流式細胞術(flow cytometry, FCM)檢測中性粒細胞的存活率和中性粒細胞內F-肌動蛋白(F-actin)的生成；通過免疫熒光分析中性粒細胞內F-actin的極化；利用細胞遷移試驗檢測中性粒細胞的遷移能力；通過免疫印跡的實驗方法檢測蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和磷酸化AKT的表達．結果發(fā)現，2-BP預處理顯著抑制了中性粒細胞內F-actin極化，且抑制了中性粒細胞向趨化肽N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)遷移的能力，而棕櫚酸預處理顯著促進了中性粒細胞內F-肌動蛋白極化．兩者對F-actin生成和AKT的磷酸化均無影響．研究結果表明，2-BP處理可能通過影響F-actin的極化抑制了中性粒細胞向fMLP的趨化活性．

中性粒細胞；2-溴棕櫚酸；F-肌動蛋白極化；趨化性；免疫熒光；流式細胞術；免疫印跡；細胞遷移；磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號通路

中性粒細胞是外周血中含量最多的白細胞，可參與調節(jié)急性以及一些慢性炎癥反應進程. 其源自骨髓造血干細胞，壽命較短，在粒細胞集落刺激因子( granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage CSF，GM-CSF)的作用下，可從骨髓中釋放出來，進入循環(huán)系統(tǒng). 靜息狀態(tài)下，中性粒細胞在循環(huán)系統(tǒng)中約存活6 h，隨后被肝臟、脾臟或骨髓清除[1-3]．當感染發(fā)生時，中性粒細胞被快速且選擇性的動員起來，以確保在感染部位大量聚集. 一旦中性粒細胞到達目的地，它們的短暫壽命也得到了延長[4-5].作為一線免疫細胞，中性粒細胞可快速穿過血管內皮細胞到達感染部位，通過吞噬、脫顆粒和中性粒細胞胞外網絡(neutrophil extracellular traps, NET)清除病原菌，隨后凋亡，被巨噬細胞清除以控制炎癥進程[6-10].長期以來，科學家們認為吞噬和脫顆粒是中性粒細胞抵抗病原菌感染的唯一機制，直至中性粒NET的發(fā)現，科學家們意識到這樣一個問題，針對不同的病原菌感染，中性粒細胞是否可以選擇性殺傷病原菌，從而激發(fā)最優(yōu)的免疫反應[11-12]．

趨化性是中性粒細胞得以遷移的生物學基礎，包括對趨化物濃度梯度的感應、細胞極化和定向遷移的過程，首先F-actin發(fā)生極化并在細胞前端行成偽足，后端行成腹足，F-actin的持續(xù)生成使得中性粒細胞得以向著趨化物濃度梯度發(fā)生定向遷移[13].研究表明，抑癌蛋白PTEN(phosphatase and tensin homolog)[14]、PI3K-AKT[15]信號通路、小G蛋白(Cdc42、Rac和RhoA)[15]等在細胞極化和遷移過程中發(fā)揮至關重要的調節(jié)作用.

櫚?；揎検且环N可逆的共價脂肪酸化修飾，指16碳棕櫚酸(palmitate)通過不穩(wěn)定硫酯鍵結合至細胞質特定的半胱氨酸殘基側鏈上. 研究表明，棕櫚?；揎椏烧{節(jié)蛋白質功能的所有階段，包括蛋白質的成熟加工、胞內運輸、細胞器定位、蛋白質穩(wěn)定性以及與其他蛋白的相互作用[16-18]．因此，棕櫚?；揎棇Φ鞍踪|功能的正常發(fā)揮、突觸的可塑性和免疫調節(jié)等多種生物學過程的影響至關重要[19-20]．棕櫚酰化和脫棕櫚?；^程分別由蛋白質酰基轉移酶和?；鞍琢蝓ッ复呋痆21-22]．2-BP通過抑制棕櫚酰?；D移酶的活性，不可逆地抑制蛋白質發(fā)生棕櫚酰化修飾[23]. 本研究就2-BP和palmitate預處理對中性粒細胞內F-actin極化、 F-actin生成、細胞遷移和AKT磷酸化(phosphorylated AKT, p-AKT)的作用展開研究，以闡明2-BP對中性粒細胞趨化性的調節(jié)作用及其潛在調控機制.

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Hank’s平衡鹽緩沖液(Hank’s balanced salt solution，HBSS) 緩沖液購自美國Gibco公司；NH4Cl、KHCO3、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和體積分數為4%的多聚甲醛等化學試劑購自上海生工生物工程股份有限公司；Percoll細胞分離液購自美國GE Healthcare公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、2-BP、palmitate、fMLP和溶血卵磷脂均購自美國Sigma公司，鬼筆環(huán)肽購自美國Invitrogen公司；染料DAPI(2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride)購自上海碧云天生物技術有限公司；碘化丙啶-膜聯蛋白V(propidium iodide-annexin V，PI-Annexin V)凋亡檢測試劑盒購自美國 BD公司；Trans-well購自美國Corning公司；抗p-AKT、抗AKT抗體和熒光標記二抗購自美國CST公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司；高速冷凍離心機購自美國Beckman公司；流式細胞儀購自美國BD公司；Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司.

1.2 中性粒細胞提取

8～12周C57BL/6小鼠處死后，取股骨和脛骨，用10 mL HBSS 緩沖液(無Ca2+和Mg2+)(含有10 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和5 mmol/L Hepes)沖出骨髓細胞. 經紅細胞裂解液(含有0.15 mol/L NH4Cl、10.0 mmol/L KHCO3和0.1 mmol/L EDTA)裂解紅細胞后，加入3 mL體積分數為45%的Percoll細胞分離液重懸骨髓細胞，置于冰上. 在15 mL離心管中依次加入3 mL體積分數分別為81%和62%的Percoll及細胞懸液. 密度梯度離心30 min后，吸取體積分數為81%和62% 的Percoll中間細胞層，即成熟中性粒細胞.

1.3 免疫熒光

HBSS 緩沖液(含Ca2+和Mg2+)稀釋提取的中性粒細胞至1×106mL-1，每孔20 μL加至鋪有載玻片的24孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃貼壁5 min. 加入等體積濃度為20 μmol/L的N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)刺激不同時間，迅速加入體積分數為4%多聚甲醛固定20 min. PBS洗滌后加入體積分數為0.1% TritonX-100孵育5 min. PBS洗滌后加入鬼筆環(huán)肽染色F-actin 30 min. PBS洗滌后加入DAPI染色細胞核5 min，洗后封片，利用激光共聚焦顯微鏡采集圖片.

1.4 流式細胞術

用HBSS 緩沖液(含Ca2+和Mg2+)稀釋提取的中性粒細胞至1×107mL-1，設7個組，分別取100 μL細胞懸液，做如下預處理，組號分別為：① 加入終濃度為1 μmol/L的2-BP；② 加入終濃度為10 μmol/L的2-BP；③ 加入終濃度為20 μmol/L的2-BP；④ 加入終濃度為40 μmol/L的2-BP；⑤ 加入終濃度為50 μmol/L的2-BP；⑥ 加入體積分數為0.1%的DMSO；⑦ 加入終濃度為50 μmol/L的palmitate.將7組細胞分別放入37 ℃孵育2 h，然后按照PI/Annexin V凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入PI和異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的AnnexinV染色15 min，通過流式細胞術檢測各組樣品中細胞存活率的差異.

另取100 μL細胞懸液，加入終濃度為20 μmol/L的palmitate，記做預處理⑧，分別將預處理③、⑥和⑧組細胞于37 ℃孵育2 h，經PBS洗滌后用10 μmol/L fMLP刺激不同時間，加入體積分數為4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌后加入20 mg/mL溶血卵磷脂和鬼筆環(huán)肽染色F-actin 30 min，流式細胞術檢測不同處理后F-actin生成的差異.

1.5 細胞遷移

分別將預處理的③、⑥和⑧組細胞于37 ℃孵育2 h，然后取20 μL細胞加入96孔Trans-well上室，下室加入60 μL的10 μmol/L fMLP，37 ℃培養(yǎng)1 h，倒置顯微鏡下隨機采集5個視野，細胞計數后統(tǒng)計不同處理后細胞遷移的差異.

1.6 免疫印跡

HBSS 緩沖液(含Ca2+和Mg2+)稀釋提取的中性粒細胞至1×108mL-1，分別將預處理③、⑥和⑧組細胞于37 ℃孵育2 h．經PBS洗滌后，于37 ℃用10 μmol/L fMLP分別刺激不同時間，加入SDS上樣緩沖液終止反應并裂解細胞. 樣品于100 ℃煮沸10 min，用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)凝膠電泳檢測. 抗p-AKT和抗AKT一抗于4 ℃孵育過夜，熒光標記的二抗室溫孵育1 h，使用Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)采集圖片.

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果與分析

2.1 不同濃度2-BP對中性粒細胞存活率的影響

為檢測棕櫚酰化對中性粒細胞趨化性的調控作用，本研究先檢測了2-BP和palmitate對其存活率的影響．將流式細胞術處理后的①～⑦組細胞分別進行檢測，結果如圖1．從圖1中可見，與對照組DMSO相比，當2-BP的濃度增加至40～50 μmol/L時可以促進細胞凋亡，而濃度為50 μmol/L的palmitate對細胞存活率仍沒有影響. 因此，后續(xù)實驗將選用濃度為20 μmol/L 的2-BP和palmitate的預處理方式.

圖1 2-BP、palmitate和DMSO對中性粒細胞存活率的影響Fig.1 Effects of f 2-BP, palmitate and DMSO on neutrophil viability

2.2 2-BP對中性粒細胞遷移的抑制作用

將1.4節(jié)預處理的③、⑥和⑧組細胞分別加入Trans-well上室，于37 ℃向含有fMLP的下室定向遷移1 h，隨后通過后倒置顯微鏡采集圖片，分析2-BP和palmitate對中性粒細胞遷移的影響，結果如圖2．由圖2可見，20 μmol/L 2-BP顯著抑制中性粒細胞向fMLP的遷移，而20 μmol/L palmitate對中性粒細胞向fMLP的遷移則沒有影響.

2.3 2-BP對中性粒細胞內F-actin極化和生成的調節(jié)作用

將預處理③、⑥和⑧組細胞于37 ℃孵育2 h，然后分作2組，1組分別加入10 μmol/L fMLP分別刺激0、1和3 min，固定后依次染色鬼筆環(huán)肽和DAPI，激光共聚焦顯微鏡檢測F-actin極化的差異，結果如圖3；另1組分別加入10 μmol/L fMLP分別刺激0、1和3 min，固定后加入20 mg/mL溶血卵磷脂和鬼筆環(huán)肽孵育30 min，流式細胞術檢測F-actin生成的差異，結果如圖4． 由圖3可見， 2-BP預處理顯著抑制fMLP介導的F-actin在偽足極化，palmitate則促進了fMLP介導的F-actin在偽足極化. 由圖4可見，2-BP和palmitate預處理對F-actin的生成均無影響.

圖2 2-BP、palmitat和DMSO對中性粒細胞向fMLP遷移能力的調節(jié)作用Fig.2 Regulation of 2-BP, palmitate and DMSO on neutrophil migration toward fMLP

圖3 2-BP、palmitate和DMSO對中性粒細胞內F-actin極化的調節(jié)作用Fig.3 Regulation of 2-BP, palmitate and DMSO on F-actin polarization in neutrophil

圖4 2-BP、palmitate和DMSO對中性粒細胞內F-acin生成的調節(jié)作用Fig.4 Regulation of 2-BP, palmitate and DMSO on F-actin formation in neutrophil

2.4 2-BP對AKT磷酸化的調節(jié)作用

分別將預處理③、⑥和⑧組細胞于37 ℃孵育2 h，然后加入10 μmol/L fMLP分別刺激0、1和3 min，加入SDS上樣緩沖液終止反應并裂解細胞，樣品用于SDS-PAGE凝膠電泳，Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)檢測p-AKT和AKT表達的差異，結果如圖5．由圖5可見，2-BP和palmitate預處理對AKT的磷酸化均無影響.

圖5 2-BP、palmitate和DMSO對中性粒細胞內AKT磷酸化的調節(jié)作用Fig.5 Effects of 2-BP, palmitate and DMSO on AKT phosphorylation in neutrophil

3 討 論

棕櫚?；怯蓹磅ｕ；D移酶催化發(fā)生的一種動態(tài)翻譯后修飾，1979年首次發(fā)現于水泡性口膜炎病毒跨膜糖蛋白[24]. 棕櫚酰?；D移酶為高度保守天冬氨酸-組氨酸-組氨酸-半胱氨酸(Asp-His-His-Cys, DHHC)家族蛋白，其中哺乳細胞內有23種[25]. 與豆蔻酰化和異戊?；嗨疲瑱磅；揎椧部梢栽黾拥鞍踪|疏水性，介導靶蛋白定位于細胞膜，增加靶蛋白與細胞膜的結合進而調節(jié)蛋白的功能[26]. 迄今尚無棕櫚酰化與中性粒細胞趨化性的報道，本研究采用2-BP和palmitate分別預處理中性粒細胞，首次證明2-BP顯著抑制中性粒細胞內F-acin的極化且不影響其生成，Trans-well實驗結果顯示，2-BP顯著抑制了中性粒細胞向fMLP的遷移. 因此，2-BP可能通過抑制F-acin極化參與調節(jié)中性粒細胞的趨化性. 此外，本研究還發(fā)現隨著2-BP濃度的增高，可以不同程度的促進中性粒細胞凋亡，但其促凋亡機制尚不清楚．

中性粒細胞是先天免疫和急性炎癥反應的關鍵效應細胞，它們在外圍組織中的招募是機體發(fā)揮宿主防御功能必不可少的.由于它們具有潛在的破壞性，因此中性粒細胞進入外周組織必須受到嚴格的控制，以避免對機體造成不必要的傷害[27].趨化因子、白三烯、補體、炎性因子及細菌釋放的多肽(如fMLP)都可以趨化中性粒細胞快速穿過血管壁到達感染部位[9]. palmitate與AKT信號通路的關系已有報道，如palmitate通過抑制PIP3K/AKT通路抑制內皮細胞介導的血管生成[28]．但在中性粒細胞中，兩者關系未知．研究表明，阻斷PIP3K的激酶活性顯著抑制中性粒細胞在體內外的遷移和向感染部位的募集，且促進了中性粒細胞的程序性死亡[29]. 此外，Rho家族小GTPase在中性粒細胞內極性分布，參與調節(jié)F-actin的定位和生成[15]. 本研究結果顯示，2-BP和palmitate均對PI3K/AKT信號通路的活化沒有影響，提示2-BP對中性粒細胞趨化性的抑制作用可能通過其他調控機制，如小GTPase等.

結 語

中性粒細胞參與調節(jié)宿主防御、腫瘤免疫和創(chuàng)傷修復等生理、病理進程，其中趨化性是中性粒細胞快速募集至感染部位行使殺傷作用所必需的，研究表明，2-BP顯著抑制中性粒細胞的F-actin極化和遷移，提示棕櫚?；揎椏蓞⑴c調節(jié)在中性粒細胞的趨化性，其調節(jié)機制尚待后續(xù)深入研究.

引文：孫錦霞，王 瑞，譚 笑，等. 2-BP對中性粒細胞趨化性的抑制作用[J]. 深圳大學學報理工版，2017，34(6)：625-630.

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【中文責編：晨兮；英文責編：艾琳】

2016-11-14；Revised2017-09-12；Accepted2017-09-22

Professor Huang Zhong. E-mail: zhuang809@126.com

Theinhibitoryeffectof2-BPonneutrophilchemotaxis

SunJinxia1,WangRui2,TanXiao3,JiaoChenchen4,andHuangZhong1

1) Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China2) College of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252059, Shandong Province, P.R.China3) Central Laboratory of Shanghai Tenth People’s Hospital, Shanghai 200072, P.R.China4) School of Medicine, Tongji University, Shanghai 200072, P.R.China

Bone marrow derived neutrophil was pretreated with 2-BP or palmitate in order to explore regulatory roles of palmitoylation on neutrophil chemotaxis. Flow cytometry (FCM) was used to detect viability and F-actin formation of neutrophil. Polarization of F-actin in neutrophil was analyzed via immune-fluorescence (IF) analysis. Cell migration assay was performed to analyz migration ability of neutrophil. Expression of protein kinase B (AKT) and phosphorylated AKT was tested through Western Blot (WB). The results indicate that neutrophil pretreated with 2-BP display significantly reduces F-actin polarization and poor ability of migration toward chemotactic peptideN-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP). However, palmitate pretreatment obviously increases polarization of F-actin in neutrophil. Furthermore, both 2-BP and palmitate have no effects on F-actin formation and AKT phosphorylation. Thus, these data suggest that 2-BP pretreatment inhibition on neutrophil chemotaxis toward fMLP may be through regulating F-actin polarization.

neutrophil; 2-bromopalmitate(2-BP); F-actin polarization; chemotaxis; immuno-fluorescence; flow cytometry; western blot; cell migration; phosphatidylinositol 3-kinase-AKT signaling pathway

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31401217); Postdoctral Science Foundation of China (2014M0560672); Shenzhen Science and Technology Basic Research Foundation (JCYJ20150403091443312)

：Sun Jinxia, Wang Rui, Tan Xiao, et al. The inhibitory effect of 2-BP on neutrophil chemotaxis[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(6): 625-630.(in Chinese)

R 392

A

10.3724/SP.J.1249.2017.06625

國家自然科學基金資助項目(31401217)；中國博士后科學基金資助項目(2014M0560672); 深圳市科技基礎研究計劃資助項目(JCYJ20150403091443312)

孫錦霞(1986—)，女，深圳大學博士后研究人員. 研究方向：免疫學. E-mail：jinxia8608@126.com