于 輝,李金磊,狄元冉,王 丹,董 鵬,方忠意,高延玲,吳志明

(1.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 鄭州 450008;2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所;3.焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心)

實(shí)驗(yàn)研究

河南省豬、雞源糞腸球菌的分離鑒定

于 輝1,李金磊2,狄元冉2,王 丹3,董 鵬2,方忠意2,高延玲2,吳志明2

(1.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 鄭州 450008;2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所;3.焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心)

為了掌握河南省豬、雞源糞腸球菌的分布情況,從規(guī)?；i、雞場分別抽取樣品300批和180批,通過對細(xì)菌的分離培養(yǎng)、純化,采用PCR和BDPhoenix自動微生物鑒定系統(tǒng)對分離的糞腸球菌進(jìn)行鑒定.結(jié)果共分離菌株254,分離率為52.9%,其中豬源分離率為51.3%(154/300),雞源分離率為55.6%(100/180).試驗(yàn)結(jié)果表明,河南省規(guī)?；B(yǎng)殖場雞源糞腸球菌的分離率高于豬源,為今后的進(jìn)一步研究提供了數(shù)據(jù).

糞腸球菌;分離;鑒定

糞腸球菌是一種革蘭氏陽性菌,是重要的條件致病菌[1],廣泛分布于自然界中,常棲居于人和動物的腸道中.前期研究認(rèn)為糞腸球菌是人和動物的共生菌,但近些年來糞腸球菌已逐漸成為人和動物體革蘭氏陽性菌感染中僅次于葡萄球菌的第二大病原菌[2].糞腸球菌可以導(dǎo)致動物和人多個臟器的感染,包括皮膚軟組織感染、尿路感染、盆腔感染、傷口感染、腹腔感染、心內(nèi)膜炎、菌血癥和心內(nèi)膜炎腦膜炎[3].在獸醫(yī)臨床研究中,由腸球菌引起的動物疾病日益增多[4],豬和雞感染糞腸球菌發(fā)病以及死亡的報道也越來越多[5].感染豬的腸球菌主要是屎腸球菌和糞腸球菌,它們也是醫(yī)院里感染的優(yōu)勢菌群,這給人畜臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn).因此,對豬、雞源糞腸球菌的分離、鑒定,掌握其分布情況,對臨床防治由該菌引起的感染具有重要意義.該試驗(yàn)從河南省規(guī)?；i、雞場抽取樣品進(jìn)行糞腸球菌分離、鑒定,以期掌握河南省豬、雞源糞腸球菌的分布情況,為糞腸球菌的控制預(yù)防提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.

1.1.2 樣品來源

2016年1月至2016年12月抽取河南省A、B、C、D4個地區(qū)規(guī)?；i場肛門拭子樣品300批,規(guī)?；u場肛門拭子180批,具體抽樣數(shù)量見表1.

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

一次性無菌采樣棒(BHI)購自鄭州君越科萊特健康科技有限公司,革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定板(購自BD公司),K-F鏈球菌瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、腦心浸液瓊脂(購自北京路橋技術(shù)有限公司).

表1 2016年樣品抽樣數(shù)量統(tǒng)計

1.1.4 儀器設(shè)備

低溫可疊放搖床;細(xì)菌濁度儀自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng);梯度PCR儀,凝膠成像系統(tǒng).

1.1.5 引物

糞腸球菌引物P1:5'-ACTTATGTGACTAAC TTAACC-3',P2:5'-TAATGGTGAATCTTGGTTTG G-3',擴(kuò)增片段長度為326bp.

1.2 方法

1.2.1 預(yù)增菌

將一次性無菌采樣棒采集的樣品盡快送到實(shí)驗(yàn)室,37℃培養(yǎng)16～20h,同時設(shè)陽性和陰性對照.

1.2.2 樣品的分離、純化

取預(yù)增菌菌液1～2環(huán),劃線于K-F鏈球菌瓊脂上,37℃培養(yǎng)16～20h,選取單個典型菌落進(jìn)行純化,最后將純化好的菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 PCR鑒定

用滅菌棉簽挑取純化好的菌落,加入裝有無菌生理鹽水的1.5ml離心管中,反復(fù)冷凍煮沸2～3次,12000rpm離心取上清作為PCR擴(kuò)增模板.同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照.

50μl總反應(yīng)體系為:

預(yù)混酶ddH2O P1 P2模板25μl 18μl 1μl 1μl 5μl

反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環(huán);72℃后延伸5min;4℃保存.同時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照.

PCR結(jié)束后,取8μlPCR產(chǎn)物,用1.5%瓊脂糖進(jìn)行電泳,15V/cm電泳20～30min,凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果.

1.2.3.2 鑒定系統(tǒng)鑒定

對PCR鑒定為糞腸球菌陽性的樣品,取營養(yǎng)瓊脂上純化好的菌落,用稀釋液調(diào)整到0.5MCF,加入到革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定板中,采用全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定.

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)預(yù)增菌培養(yǎng),K-F鏈球菌瓊脂分離純化,最后經(jīng)PCR及全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定,糞腸球菌在K-F鏈球菌瓊脂上形成暗紅色至粉紅色菌落,邊緣整齊,瓊脂表面下菌落呈橢圓或晶體狀.

2.2 不同動物來源分離情況

河南地區(qū)規(guī)模化豬、雞場共分離糞腸球菌254株,分離率為52.9%(254/480),其中豬源、雞源分離率分別為51.3%(154/300)、55.6%(100/180).具體情況見表2.

2.3 不同地區(qū)分離情況

A、B、C、D四個地區(qū)糞腸球菌總體分離率分別為55.0%(66/120)、41.7%(75/180)、66.7%(60/90)、58.9%(53/90),其中A地區(qū)豬源、雞源分離率分別為50.0%(45/90)、70.0%(21/30),B地區(qū)豬源、雞源分離率分別為44.4%(40/90)、38.9%(35/90),C地區(qū)豬源、雞源分離率分別為55.0%(33/60)、90.0%(27/30),D地區(qū)豬源、雞源分離率分別為60.0%(36/60)、56.7%(17/30),具體結(jié)果見表2.

3 討論

該研究通過對河南省規(guī)?；i場、雞場的糞腸球菌進(jìn)行分離純化,鑒定,共分離糞腸球菌254株,分離率52.9%,與趙麗青[6]等研究的山東青島分離率82.1%和黃雁[7]等研究的福建某雞場的糞腸球菌分離率為77.8%相比,相對較低,比蘇崴藝[8]等從遼寧省雞場分離率為24.0%要高.這種差異可能是由樣品的來源不同所致,也可能是不同地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境的不同所致.

表2 2016年河南省各地區(qū)豬、雞源糞腸球菌分離情況

總體而言,豬源糞腸球菌的分離率51.5%(154/300)比雞源糞腸球菌的分離率55.6%(100/180)較低.4個地區(qū)豬源糞腸球菌分離率最高的是D地區(qū),分離率為60.0%(36/60),其次是C和A地區(qū),分離率分別為55.0%(3/60)和50.0%(45/90),最低的為B地區(qū),分離率為44.4%(40/90);雞源糞腸球菌分離率最高的是C地區(qū),分離率為90.0%(27/30),其次是A和D地區(qū),分離率分別為70.0%(21/30)和56.7%(17/30),最低的為B地區(qū),分離率為38.9%(35/90);就不同地區(qū)不同來源之間來說,A和C地區(qū)的雞源糞腸球菌分離率高于豬源,B和D地區(qū)雞源糞腸球菌的分離率低于豬源.該試驗(yàn)結(jié)果表明不同動物來源的糞腸球菌分離率存在差異,不同地區(qū)之間糞腸球菌的分離率也存在差異,這種差異可能是由于菌株的偏好所致,也可能是不同地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境及用藥情況不同所致.

該試驗(yàn)通過對河南省豬源、雞源糞腸球菌的分離、鑒定,初步掌握了豬、雞源糞腸球菌的分布情況,為下一步制定防控措施提供了數(shù)據(jù).

[1]王亞賓,陳麗穎,胡慧,等.豬源糞腸球菌和屎腸球菌多重PCR快速鑒定方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2011,31(8):1123-1127.

[2]幸文定.江西部分地區(qū)豬源糞腸球菌耐藥性及毒力基因檢測與分析[D].江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[3]商軍,顧欣,張文剛,等.豬、雞源分離糞腸球菌的核糖體分型及耐藥性分析[J].中國抗生素雜志,2017,42(3):230-236.

[4]朱娜,方超,周成捷,等.湖南省豬源腸球菌的分離鑒定[J].湖南畜牧獸醫(yī),2016,(2):41-44.

[5]錢曉璐,商軍,田愷,等.豬、雞源分離糞腸球菌的核糖體分型及耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(8):2176-2182.

[6]趙麗青,雷質(zhì)文,王樹峰,等.動物源性腸球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國動物檢疫,2008,25(1):31-32.

[7]黃雁,劉美容.福建某雞場糞腸球菌耐藥情況調(diào)查[J].國外畜牧獸醫(yī)學(xué)(豬與禽),2008,(4):91-93.

[8]蘇崴藝,李欣南,韓鐫竹.某養(yǎng)殖場雞源糞腸球菌分離鑒定及耐藥性研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2014,(4):48-50.

S852.61+1

B

1004-5090(2017)09-0007-02

2017-07-20)