鄒 勇， 林哲生， 陳玉嬋， 廖思紅， 袁 青， 林東軍, 2△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1輸血科， 2血液科， 廣東 廣州 510630)

過表達(dá)B7-H6在自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中的作用*

鄒 勇1△， 林哲生1， 陳玉嬋1， 廖思紅1， 袁 青1， 林東軍1, 2△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1輸血科，2血液科， 廣東 廣州 510630)

目的探討過表達(dá)B7同源物6(B7-H6)在自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中的作用。方法設(shè)計(jì)針對B7-H6全長的寡核苷酸引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增調(diào)取B7-H6全長，并將其亞克隆入線性化的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP，構(gòu)建重組B7-H6過表達(dá)載體pIRES2-EGFP-B7-H6，通過雙酶切、PCR及測序進(jìn)行鑒定。利用脂質(zhì)體將pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞系L02，采用熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率，qRT-PCR 和Western blot 檢測B7-H6 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒的L02細(xì)胞與NK-92細(xì)胞以不同的效靶比共培養(yǎng)，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)分析檢測NK-92細(xì)胞對L02細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果經(jīng)PCR、酶切及測序等方法證實(shí)成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-B7-H6過表達(dá)載體；經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到較強(qiáng)綠色熒光表達(dá)，流式檢測顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)到92.6%；qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示L02細(xì)胞B7-H6的mRNA和蛋白高表達(dá)；CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)相對于轉(zhuǎn)染空載體pIRES2-EGFP， NK-92細(xì)胞對轉(zhuǎn)染了pIRES2-EGFP-B7-H6的L02細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建過表達(dá)B7-H6的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-B7-H6，并進(jìn)一步證實(shí)NK-92細(xì)胞對過表達(dá)B7-H6的L02細(xì)胞具有顯著的殺傷效應(yīng)。

B7同源物6； 真核表達(dá)載體； 自然殺傷細(xì)胞； 肝細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

B7同源物6(B7 homologue 6, B7-H6)又稱自然殺傷細(xì)胞細(xì)胞毒性受體3配體1(natural killer cell cytotoxicity receptor 3 ligand 1，NCR3LG1)，屬于B7免疫球蛋白超家族，是近年來利用生物信息學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)等發(fā)現(xiàn)的新型共刺激分子。已經(jīng)證實(shí)，B7-H6為人類自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的配體，可以與NK細(xì)胞表面細(xì)胞毒性受體NKp30特異性結(jié)合而激活并促進(jìn)NK細(xì)胞釋放TNF-α和IFN-γ，從而殺傷靶細(xì)胞[1-3]。本研究通過構(gòu)建重組B7-H6過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系L02，以驗(yàn)證NK細(xì)胞對過表達(dá)B7-H6的肝細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，為進(jìn)一步研究B7-H6表達(dá)在重癥乙型肝炎肝細(xì)胞損傷中的作用提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1主要試劑

DH5α感受態(tài)細(xì)胞、L02細(xì)胞和NK-92細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存)；DNA限制性內(nèi)切酶(Thermo Scienti-fic)；PrimeSTAR高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和2×PrimeSTAR Max Premix (TaKaRa)；柱離心式膠回收試劑盒、DNA抽提純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和PCR引物(中美泰和)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；pIRES2-EGFP慢病毒載體(Promega)。

2主要方法

2.1引物設(shè)計(jì)與目的基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank的B7-H6基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。上游引物為5’-GGAATTCACCATGACGTGGAGGGCTGC-3’，下游引物為5’-CGGGATCCTTACTGTAGGGGTAACAG-3’，劃線部分為引入酶切位點(diǎn)(EcoR I和BamH I)，酶切位點(diǎn)前為保護(hù)堿基。利用 TRIzol試劑(Invitrogen)提取K562細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)參數(shù)如下： 94 ℃ 預(yù)變性5 min； 94 ℃ 變性30 s， 55 ℃ 退火30 s， 72 ℃ 延伸30 s，完成30個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min，置于4 ℃ 保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，鑒定PCR 擴(kuò)增結(jié)果。

2.2pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別以EcoR I和BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物及pIRES2-EGFP，將含酶切位點(diǎn)黏性末端的B7-H6全長ORF序列和線性化質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreen按(2～6)∶1混合，經(jīng)T4 DNA連接酶連接過夜。連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選后，挑取單克隆菌株培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，并以之為模板行PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞接種于24孔板，按Lipofectamine 2000 使用說明書轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h用熒光顯微鏡觀察標(biāo)簽蛋白 EGFP 的表達(dá)。

2.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 采用qRT-PCR檢測L02細(xì)胞B7-H6的mRNA表達(dá)。L02細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-B7-H6 48 h后收集細(xì)胞，利用 TRIzol試劑提取總RNA。隨后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green PCR試劑盒，通過ABI 7500序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。用于擴(kuò)增B7-H6的引物序列是5’-TCACCAAGAGGCATTCCGACCT-3’(正義)和5’-ACCACCTCACATCGGTACTCTC-3’(反義)。管家基因GAPDH用作內(nèi)部對照。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 收獲轉(zhuǎn)染后 293T 細(xì)胞，利用裂解液(RIPA，含蛋白酶抑制劑)裂解細(xì)胞，收集上清，然后通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)提取物(30 μg)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜中。5%脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入抗B7-H6兔多克隆抗體(Abcam)，4 ℃ 孵育過夜。TBST液洗膜5次，每次5 min，過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1∶5 000)室溫孵育 1 h，TBST液洗膜5次，每次5 min。ECL法檢測B7-H6的表達(dá)。

2.6細(xì)胞毒分析 利用CCK-8實(shí)驗(yàn)分析評估NK細(xì)胞對L02細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。將轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒48 h的L02細(xì)胞用作靶細(xì)胞，NK-92細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞。將靶細(xì)胞接種在96孔板中，每孔1×104個細(xì)胞。將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞分別以效/靶比1∶1、1∶5、1∶10或1∶25混合，同時每孔加入15 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h后，利用酶標(biāo)儀檢測540 nm和630 nm處的吸光度(A)值。NK細(xì)胞溶解L02細(xì)胞的百分率(%)=(AT-AE+T)/AT×100%，其中T為靶細(xì)胞，E為效應(yīng)細(xì)胞，E+T為靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞共孵育4 h。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1人B7-H6基因全長片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

人B7-H6基因全長擴(kuò)增片段在約1.3 kb處出現(xiàn)明顯的條帶，與目的片段大小相符，見圖1。

Figure 1. Amplification of the full-length fragment ofB7-H6 gene by PCR.

圖1B7-H6基因全長片段的PCR擴(kuò)增圖

2pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒用EcoR I和BamH I雙酶切，會切出長片段及短片段，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖2。質(zhì)粒和菌液測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒酶切位點(diǎn)及起始密碼子和終止密碼子均被測出，經(jīng)拼接技術(shù)拼接后再經(jīng)過GeneBank BLAST比對證實(shí)pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Figure 2. The map of restriction enzyme double digestion for recombinant plasmid pIRES2-EGFP-B7-H6.

圖2重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-B7-H6雙酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖

3pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞后B7-H6的mRNA和蛋白表達(dá)

pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞后48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到較強(qiáng)綠色熒光表達(dá)，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測pIRES2-EGFP-B7-H6的轉(zhuǎn)染效率為92.6%，見圖3A；qRT-PCR和Western blot結(jié)果證實(shí)L02細(xì)胞中B7-H6的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，見圖3B、C。

Figure 3. The expression of B7-H6 at mRNA and protein levels in the L02 cells transfected with recombinant pIRES2-EGFP-B7-H6 plasmid. EGFP expression was detected under fluorescence microscope (A)， and B7-H6 expression was confirmed by qRT-PCR (B) and Western blot(C). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmock group.

圖3重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-B7-H6轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞后B7-H6mRNA和蛋白表達(dá)分析

4NK-92細(xì)胞對轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6質(zhì)粒的L02細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

當(dāng)NK-92細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6質(zhì)粒48 h的 L02細(xì)胞以不同的效靶比共培養(yǎng)4 h后, 通過CCK-8實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，相對于正常L02細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了空載體pIRES2-EGFP的L02細(xì)胞，NK-92細(xì)胞對轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6質(zhì)粒的L02細(xì)胞具有顯著的殺傷效應(yīng)(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The cytotoxic effect of NK-92 cells against L02 cells transfected with recombinant plasmid pIRES2-EGFP-B7-H6. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsother groups.

圖4NK-92細(xì)胞對轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒的L02細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

討 論

B7-H6 分子是近年來發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員[1-3]。Brandt等[1]應(yīng)用生物素化的NKp30-Fc 蛋白作為探針，通過免疫共沉淀技術(shù)將與NKp30-Fc 蛋白結(jié)合的相反結(jié)構(gòu)的多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析捕獲了假定蛋白DKFZp686024166。DKFZp686024166編碼454個氨基酸的I型跨膜蛋白, 胞內(nèi)區(qū)含有SaYtpL、SH2和SH3等多種信號分子以及一個Gag同源序列。DKFZp686024166與B7家族成員B7-H1和B7-H3具有序列相似性，其中與B7-H1的序列相似性達(dá)20%。受體NKp30序列和結(jié)構(gòu)分析表明NKp30與CD28家族成員cTLA4同源，進(jìn)一步證實(shí)了DKFZp686024166來源于B7家族，將之命名為B7-H6。Brandt等[1]進(jìn)一步證實(shí)，B7家族成員B7-H6為人類NK細(xì)胞細(xì)胞毒性受體NKp30的配體，可以選擇性地表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞和惡性血液病細(xì)胞的血和骨髓，但在大多數(shù)正常組織細(xì)胞表達(dá)缺失或弱表達(dá)。

最近的研究進(jìn)一步表明，B7-H6 可被誘導(dǎo)表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)表面，參與NK-APC 對話[4]。而且B7-H6在某些炎癥環(huán)境中也可以被誘導(dǎo)表達(dá)。Matta等[5]發(fā)現(xiàn)膿毒血癥患者外周血促炎癥單核細(xì)胞(CD14+CD16+)表達(dá)B7-H6，并且與死亡率升高密切相關(guān)。體外通過Toll樣受體配體及炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α刺激單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，B7-H6也可以被誘導(dǎo)表達(dá)。我們前期的研究報(bào)道，NK細(xì)胞在人類重癥乙型肝炎患者肝臟顯著活化和大量募集，外周血NK細(xì)胞細(xì)胞毒性受體(NKp30和NKp46)的表達(dá)也顯著增強(qiáng)[6]。最近我們又發(fā)現(xiàn)，在重癥乙型肝炎病人肝組織中，B7-H6可以被誘導(dǎo)表達(dá)，這可能與重癥乙型肝炎肝臟的高炎癥狀態(tài)及細(xì)胞因子的“瀑布級聯(lián)效應(yīng)”密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究重癥乙型肝炎B7-H6的表達(dá)在NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中的作用,我們構(gòu)建了B7-H6過表達(dá)真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系L02實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞B7-H6的過表達(dá)，進(jìn)一步通過CCK-8分析評估了NK-92細(xì)胞對過表達(dá)B7-H6的肝細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。我們的研究結(jié)果顯示, NK-92細(xì)胞對轉(zhuǎn)染過表達(dá)B7-H6真核表達(dá)載體的肝細(xì)胞具有顯著的殺傷效應(yīng)，表明在重癥乙型肝炎中，NK細(xì)胞可能通過NKp30-B7-H6識別通路介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，其精確的分子機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Role of B7-H6 over-expression in NK cell-mediated apoptosis of hepatocytes

ZOU Yong1, LIN Zhe-sheng1, CHEN Yu-chan1，LIAO Si-hong1, YUAN Qing1, LIN Dong-jun1, 2

(1DepartmentofBloodTransfusion，2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:zouyong0205@163.com;lindongjun0168@163.com)

AIM: To investigate the role of B7 homologue 6 (B7-H6) over-expression in natural killer (NK) cell-mediated hepatocyte apoptosis.METHODSThe full-length fragment ofB7-H6 gene was amplified by PCR and subcloned into linearized eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP to construct recombinantB7-H6 over-expression vector pIRES2-EGFP-B7-H6. The recombinant plasmid was identified by double digestion, PCR and sequencing, and was then transfected into L02 cells. The expression of EGFP was observed by fluorescence microscopy and the transfection efficiency was evaluated by flow cytometry. B7-H6 expression was confirmed by qRT-PCR and Western blot. The L02 cells transfected with pIRES2-EGFP-B7-H6 recombinant plasmid were co-cultured with NK-92 cells at different effector/target ratios, and the cytotoxicity of NK-92 cells was evaluated by CCK-8 assay.RESULTSThe strong green fluorescence in the L02 cells was observed under fluorescence microscope 48 h after transfection. The transfection efficiency reached 92.6%. The expression of B7-H6 at mRNA and protein levels was remarkably increased 48 h after transfection. The cytotoxicity of NK-92 cells against L02 cells transfected with pIRES2-EGFP-B7-H6 plasmid was significantly higher than that of the null vector transfection group (P<0.05).CONCLUSIONThe recombinant eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-B7-H6 was constructed successfully. The cytotoxic effect of NK-92 cells against L02 cells can be enhanced by transfecting L02 cells with pIRES2-EGFP-B7-H6 plasmid.

B7 homologue 6; Eukaryotic expression vector; Natural killer cells; Hepatocytes; Apoptosis

1000- 4718(2017)11- 2095- 04

2017- 05- 12

2017- 09- 01

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2014A020212575； No. 2016A020215215)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2016A030313357)

△通訊作者 鄒勇 Tel： 020-85252526； E-mail： zouyong0205@163.com； 林東軍 Tel: 020-85252389; E-mail： lindongjun0168@163.com

R329.21； R575.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.028