高 穩(wěn)， 李 劍， 倪喚春， 劉俊嶺， 羅心平

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科， 上海 200040)

ERK5對(duì)體外血小板活化及在體血栓的影響*

高 穩(wěn)， 李 劍， 倪喚春， 劉俊嶺， 羅心平△

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科， 上海 200040)

目的探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)對(duì)體外血小板聚集及在體血栓的影響及機(jī)制。方法采用Western blot對(duì)人血小板中ERK5的表達(dá)及其在血小板活化后的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)；采用血小板聚集儀檢測(cè)ERK5特異性抑制劑XMD8-92對(duì)血小板聚集及致密顆粒釋放的影響；采用FeCl3頸動(dòng)脈血栓模型檢測(cè)ERK5對(duì)在體血栓的影響；采用Western blot檢測(cè)XMD8-92對(duì)蛋白激酶B(Akt)和人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白(PTEN)磷酸化的影響。結(jié)果人血小板中存在ERK5的穩(wěn)定表達(dá)，其磷酸化水平在血小板活化后顯著升高(P<0.05)。XMD8-92可抑制多種血小板激活劑引起的血小板聚集和致密顆粒釋放(P<0.05)。Western blot結(jié)果表明，XMD8-92可通過(guò)下調(diào)PTEN Ser370位點(diǎn)磷酸化而增強(qiáng)PTEN的活性，從而抑制Akt的磷酸化，這種抑制效果也通過(guò)血小板特異PTEN基因敲除小鼠得到了驗(yàn)證。在體血栓研究表明，XMD8-92經(jīng)尾靜脈給藥，可顯著延長(zhǎng)小鼠第一次頸動(dòng)脈血栓的形成時(shí)間。結(jié)論ERK5可通過(guò)影響PTEN的磷酸化調(diào)節(jié)Akt的活化，進(jìn)而影響到體外血小板的聚集和在體血栓的形成。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5； 血小板； 血栓； 人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白

心血管疾病是人類健康的重大威脅，《中國(guó)心血管病報(bào)告2015》表明，2014年心血管病死亡率仍為我國(guó)各疾病之首，占居民死亡構(gòu)成的主要部分(農(nóng)村為44.60%，城市為42.51%)，其死亡率仍然高于腫瘤及其它疾病[1]。其中，急性心肌梗死的發(fā)病率和死亡率占到心血管疾病的首位，在心肌梗死的發(fā)病過(guò)程中，血小板的異常活化是急性血栓事件發(fā)生的起始因素，因此深入研究血小板的活化通路及調(diào)控機(jī)制對(duì)研發(fā)新型抗栓藥物并闡明動(dòng)脈血栓的發(fā)生機(jī)制都有重要意義[2]。

絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號(hào)通路在血小板活化中有重要作用，它負(fù)責(zé)承接來(lái)自受體傳入的刺激信號(hào)，并向血小板內(nèi)部傳遞，在與其它通路包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylino sitol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)通路和磷脂酶C (phospholipase C, PLC)通路完成交叉后活化整合素，從而完成血小板的活化。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5)是MAPK家族的新成員[3]，最新研究發(fā)現(xiàn)血小板中也存在ERK5的穩(wěn)定表達(dá)。2015年有研究通過(guò)對(duì)血小板特異ERK5基因敲除小鼠建立冠脈結(jié)扎模型，證實(shí)ERK5可以通過(guò)影響S6K1蛋白磷酸化影響到心肌梗死發(fā)生后心功能的惡化[4]。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)ERK5參與了膠原引起的血小板活化[5]，但ERK5是否參與了其它刺激引起的血小板的聚集，通過(guò)怎樣的機(jī)制發(fā)揮作用，對(duì)在體動(dòng)脈血栓有何影響，目前尚不明確。本研究擬采用ERK5選擇性抑制劑XMD8-92對(duì)其在血小板聚集和在體血栓中的作用進(jìn)行探討，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究，為尋找新的抗血小板靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1藥品與試劑

體外實(shí)驗(yàn)所用血小板來(lái)自健康志愿者，抽血前10 d無(wú)抗血小板藥物應(yīng)用史，參與者均簽署知情同意書(shū)。血小板特異人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)基因敲除(PTEN-/-)小鼠為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉俊嶺教授贈(zèng)予；野生型小鼠為C57BL/6背景，購(gòu)自南方模式動(dòng)物中心。所用膠原(collagen)和螢光素(luciferin)/螢光素酶(luciferase)購(gòu)自Chrono-Log；腺苷二磷酸(adenosine diphosphate， ADP)、腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)、前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)和血栓烷A2類似物U46619購(gòu)自Sigma；凝血酶(thrombin)購(gòu)自Enzyme Research Laboratories；XMD8-92購(gòu)自Selleck；抗p-Akt (Ser473)抗體、p-Akt (Thr308)抗體、p-PTEN (Ser370)抗體和GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1洗滌血小板的制備[6-7]人血小板制備方法：從健康志愿者肘靜脈取血后，向制得的全血中加入等體積0.9%的氯化鈉溶液，加入apyrase(終濃度1×103U/L)和PGE1(終濃度0.1 mg/L)混勻后室溫離心1 050 r/min，10 min；吸取上層富血小板血漿，加入apyrase(終濃度1×103U/L)和EDTA(終濃度為5 mmol/L)，混勻后室溫離心1 900 r/min，10 min，棄去上清后加入預(yù)熱好的Tyrodes Buffer(12 mmol/L NaHCO3、138 mmol/L NaCl、5.5 mmol/L 葡萄糖、2.9 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、0.42 mmol/L NaH2PO4和10 mmol/L HEPES，pH 7.4)，將血小板沉淀充分吹開(kāi)，得到云霧狀的血小板懸液，即為洗滌血小板；采用HEMAVET血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)血小板的濃度為3×1011/L。

經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(10 mL/kg)麻醉小鼠，采用腹主動(dòng)脈穿刺取血，將基因型相同的小鼠全血置于同一15 mL離心管中制備小鼠血小板，制備方法同人血小板。

2.2比濁法測(cè)定人血小板的體外聚集[7]將DMSO及終濃度分別為5、10和20 μmol/L的XMD8-92與洗滌血小板共孵育3 min，使用血小板聚集儀分別檢測(cè)在血小板常用激活劑(膠原、凝血酶、U46619和ADP)刺激下，不同濃度XMD8-92對(duì)人血小板聚集程度的影響。

2.3通過(guò)螢光素酶檢測(cè)人血小板的ATP分泌[8]在血小板聚集曲線達(dá)到平臺(tái)期后，向每個(gè)比濁管中加入10 μL的螢光素/螢光素酶，利用血小板聚集儀同時(shí)檢測(cè)血小板中ATP的分泌情況。

2.4Western blot法檢測(cè)Akt、PTEN及ERK5的磷酸化水平[9-10]向聚集反應(yīng)后的血小板中加入等體積的2×SDS裂解液。在冰上充分裂解后，煮沸使蛋白變性，采用SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。加入 I 抗孵育過(guò)夜，漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG，室溫振蕩孵育1 h。漂洗后顯色，終止反應(yīng)后拍照。采用ImageJ軟件對(duì)免疫印記條帶灰度值進(jìn)行分析。

2.5FeCl3頸動(dòng)脈血栓模型檢測(cè)在體血栓的形成[11]分別對(duì)2組野生型小鼠進(jìn)行尾靜脈給藥：實(shí)驗(yàn)組采用PBS稀釋XMD8-92，給藥劑量為2 mg/kg，對(duì)照組將等體積的DMSO稀釋于PBS溶液給藥。給藥30 min后，采用1%戊巴比妥鈉(10 mL/kg)麻醉小鼠后，將小鼠固定并游離一側(cè)頸動(dòng)脈，將多普勒超聲血流儀探頭勾在小鼠頸動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，待血流平穩(wěn)后，將浸潤(rùn)有10% FeCl3溶液的濾紙灼傷頸動(dòng)脈，計(jì)時(shí)3 min后取下濾紙并記錄開(kāi)始時(shí)間及血流速度，當(dāng)頸動(dòng)脈的血流速度低于0.06 mL/min時(shí)，記下時(shí)間，視為第一次血栓形成。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用Studentt檢驗(yàn)或單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用Cruskal-Wallis檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism 5.0軟件繪制柱形圖。以P<0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1Westernblot證實(shí)ERK5在人血小板上存在穩(wěn)定表達(dá)并參與血小板活化

Western blot證實(shí)人血小板中確有ERK5的穩(wěn)定表達(dá)，其磷酸化水平在分別以中濃度凝血酶(10 U/L)、ADP(10 μmol/L)、U46619(10 U/L)及膠原(2 mg/L)激活血小板后顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2ERK5抑制劑對(duì)血小板聚集和ATP分泌的影響

在中濃度凝血酶、ADP、膠原及U46619刺激下，XMD8-92對(duì)血小板聚集均呈現(xiàn)抑制作用，見(jiàn)圖2。

Figure 1. ERK5 was stably expressed in human platelets and was phosphorylated after platelet activation. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsresting.

圖1ERK5在人血小板中穩(wěn)定表達(dá)并參與血小板活化

Figure 2. XMD8-92 inhibited collagen-, U46619-, thrombin- and ADP-induced platelet aggregationinvitroin a concentration-dependent manner. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO.

圖2XMD8-92對(duì)血小板聚集的影響

在上述激活劑作用下，10 μmol/L的XMD8-92顯著抑制了ATP的分泌，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

3ERK5抑制劑對(duì)Akt473和Akt308磷酸化的影響

Akt是血小板中重要的效應(yīng)激酶[12]，也是ERK5的主要底物之一[13-14]。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血小板聚集反應(yīng)后，ERK5抑制劑對(duì)Akt Ser473和Thr308位點(diǎn)的磷酸化均呈現(xiàn)抑制作用，10 μmol/L的XMD8-92即可顯著抑制Akt的磷酸化水平，與DMSO組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。因此，我們認(rèn)為，血小板中也存在ERK5對(duì)Akt的調(diào)節(jié)作用。

4ERK5通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN磷酸化影響血小板活化

Akt的Ser473位點(diǎn)和Thr308位點(diǎn)磷酸化分別由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物[15]和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶[9]調(diào)控。那么ERK5是如何影響到Akt的活化呢？我們對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路中主要的調(diào)控激酶PTEN[7]的磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，XMD8-92顯著抑制了PTEN Ser370位點(diǎn)磷酸化水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5A。進(jìn)一步，我們采用血小板特異PTEN-/-小鼠對(duì)ERK5的調(diào)控作用進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，以膠原為激活劑時(shí)，PTEN-/-小鼠較對(duì)照組小鼠血小板聚集程度增高；在孵育了XMD8-92后，PTEN-/-小鼠血小板聚集程度受到的抑制程度較對(duì)照組減低，見(jiàn)圖5B。這些結(jié)果表明，ERK5抑制劑可通過(guò)PTEN調(diào)節(jié)血小板活化。

Figure 3. XMD8-92 significantly inhibited collagen-, U46619-, thrombin- and ADP- induced platelet dense granule secretion at 10 μmol/Linvitro. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsDMSO.

圖3XMD8-92對(duì)ATP分泌的影響

5ERK5對(duì)在體血栓形成的影響

我們采用了FeCl3頸動(dòng)脈損傷模型對(duì)ERK5在在體血栓中的作用進(jìn)行了研究?？梢钥闯?，實(shí)驗(yàn)組小鼠第一次穩(wěn)定動(dòng)脈血栓形成時(shí)間較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，第一次血栓形成時(shí)間在XMD8-92給藥組為(10.40±0.93) min，在對(duì)照組為(6.50±0.22) min，兩者差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖6A。給藥30 min后分離血小板進(jìn)行聚集實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，XMD8-92(2 mg/kg)給藥后顯著抑制了中濃度膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，證明血小板確實(shí)受到了抑制劑的抑制作用，見(jiàn)圖6B。因此我們認(rèn)為，ERK5也參與了在體血栓的形成過(guò)程。

Figure 4. XMD8-92 inhibited Akt phosphorylation in collagen-stimulated platelets. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsresting;##P<0.01vsDMSO.

圖4XMD8-92抑制膠原引起的Akt磷酸化

Figure 5. XMD8-92 reduced the phosphorylation level of PTEN at Ser370. A: XMD8-92 inhibited PTEN Ser370 phosphorylation in collagen-stimulated platelets; B:PTENdeficiency reduced inhibition of XMD8-92 on platelet aggregation induced by collagen.Mean±SD.n=3.△△P<0.01vsresting；*P<0.05,**P<0.01vsDMSO.

圖5XMD8-92通過(guò)抑制膠原引起的PTEN磷酸化而發(fā)揮作用

Figure 6. XMD8-92 extended the first occlusion time and decreased the activity of platelet induced by collagen. A: traces of blood flow and the first occlusion time in the carotid arteries of mice intravenously given XMD8-92 or PBS (control); B: anti-platelet effects of XMD8-92 were confirmed byinvitrostudy using platelets from mice intravenously given XMD8-92.Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol.

圖6尾靜脈給藥XMD8-92延長(zhǎng)了小鼠第一次頸動(dòng)脈血栓的形成時(shí)間并降低了血小板對(duì)膠原的反應(yīng)性

討 論

哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)ERK5參與了多種信號(hào)通路，在心臟發(fā)育、血管新生和成熟及神經(jīng)元軸突再生都扮演著非常重要的角色，但其對(duì)血小板活化的影響和機(jī)制目前尚不十分清楚。我們發(fā)現(xiàn)人血小板中也存在ERK5的穩(wěn)定表達(dá)，其磷酸化水平在血小板活化后顯著升高。XMD8-92是一種高選擇性ERK5抑制劑，它通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制ERK5羧基端自磷酸化位點(diǎn)的磷酸化而抑制ERK5的活性，由于該位點(diǎn)為ERK5所特有，目前研究表明該抑制劑對(duì)其它MAPK家族成員活性沒(méi)有影響[16]。我們采用XMD8-92對(duì)血小板進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)它對(duì)多種刺激劑引起的血小板的聚集和顆粒分泌都有濃度相關(guān)的抑制作用。此外，我們對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈注射ERK5抑制劑后分離血小板，發(fā)現(xiàn)血小板的最大聚集程度減低，對(duì)注射后的小鼠進(jìn)行頸動(dòng)脈血栓實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)第一次頸動(dòng)脈血栓的形成時(shí)間顯著延長(zhǎng)。這些研究表明，ERK5通過(guò)磷酸化參與了血小板的活化,并參與了動(dòng)脈血栓的形成。

那么ERK5是通過(guò)何機(jī)制影響到血小板的活化呢？目前對(duì)ERK5底物的研究以轉(zhuǎn)錄因子為主[17]，但血小板沒(méi)有細(xì)胞核，不存在ERK5的入核調(diào)控。多項(xiàng)研究表明，Akt也是ERK5的重要底物[13-14]。我們的研究表明，血小板中也存在ERK5對(duì)Akt的調(diào)節(jié)關(guān)系。

PI3K/Akt通路是生物系統(tǒng)中的重要信號(hào)通路，也是血小板活化的重要參與者，該通路主要受到限速酶PTEN和PDK1的調(diào)控[18]。PTEN作為一種肌糖磷脂磷酸酶，可以通過(guò)使3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化從而下調(diào)PI3K/Akt通路，而在血小板PI3K/Akt通路起到重要的負(fù)向調(diào)控作用[7, 19]。它以活化態(tài)形式存在于血小板中，Ser370位點(diǎn)磷酸化可使其活性下降。我們研究發(fā)現(xiàn)，ERK5的抑制劑可下調(diào)PTEN Ser370位點(diǎn)的磷酸化使其活性增強(qiáng)，從而抑制Akt的磷酸化水平，而PTEN敲除可部分消除抑制劑的這種影響。因此，我們認(rèn)為，ERK5通過(guò)上調(diào)PTEN磷酸化降低PTEN的活性，從而促進(jìn)PI3K/Akt通路的活化而起到調(diào)控血小板活化的作用。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與DMSO相比，ERK5的抑制劑對(duì)PTEN-/-小鼠血小板的聚集仍有部分影響，因此，我們認(rèn)為ERK5可能還可以通過(guò)其它通路調(diào)節(jié)血小板的活化，還有一種可能是由于抑制劑的非特異性，這種可能需要由血小板特異ERK5敲除小鼠來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。該信號(hào)通路的意義還在于，由于PTEN是一種重要的抑癌基因，其活性降低在腫瘤發(fā)生發(fā)展中都有重要作用，針對(duì)ERK5的研究可能會(huì)為抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供一種思路。

綜合我們前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為ERK5在血小板活化中扮演重要角色，并可通過(guò)調(diào)控Akt的磷酸化調(diào)節(jié)血小板活化從而參與了動(dòng)脈血栓的形成。針對(duì)ERK5的藥物對(duì)在體血栓形成有良好的抑制作用。我們推斷ERK5是很有前景的抗栓靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

內(nèi)皮TLR4和腸道菌群引發(fā)腦海綿狀血管畸形

腦海綿狀血管畸形(cerebral cavernous malformations, CCMs)是導(dǎo)致中風(fēng)和癲癇的原因之一，目前還沒(méi)有有效的藥物治療方法。CCMs是由于在腦內(nèi)皮細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)MEKK3-KLF2/4信號(hào)的銜接子復(fù)合物的缺失而產(chǎn)生的，但是該疾病通路的上游激活因子尚未被確定。Tang等確認(rèn)了Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)和腸道菌群是CCMs形成的關(guān)鍵刺激物。通過(guò)革蘭陰性細(xì)菌或脂多糖激活TLR4，可加速CCMs形成；而在基因或藥理學(xué)上阻斷TLR4信號(hào)，可防止小鼠CCMs形成。增加 TLR4 基因(或編碼其輔助受體CD14的基因)表達(dá)的多態(tài)性與人類較高的CCMs損傷負(fù)荷相關(guān)。無(wú)菌小鼠沒(méi)有CCMs形成，且單療程的抗生素可永久改變小鼠的CCM易感性。該研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群和先天免疫信號(hào)在CCMs發(fā)病機(jī)制中具有意想不到的作用，有望成為CCMs藥物治療的靶點(diǎn)。

Nature, 2017, 545(7654):305-310(李肖肖)

Role of ERK5 in platelet activation in vitro and arterial thrombosis in vivo

GAO Wen, LI Jian, NI Huan-chun, LIU Jun-ling, LUO Xin-ping

(DepartmentofCardiology,HuashanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200040,China.E-mail:luoxp206@163.com)

AIM: To investigate the role of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) in platelet aggregationinvitroand arterial thrombosisinvivo.METHODSThe expression and phosphorylation levels of ERK5 in human platelet were detected by Western blot. The effects of ERK5 selective inhibitor XMD8-92 on platelet aggregation and dense granule secretion were detected by Chrono-Log aggregometer. The effect of ERK5 oninvivothrombosis was analyzed using an FeCl3artery thrombosis model. The effects of XMD8-92 on protein kinase B (PKB/Akt) and phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) phosphorylation levels were determined by Western blot.RESULTSERK5 was stably expressed in human platelets and its phosphorylation level increased significantly after platelet activation (P<0.05). XMD8-92, a selective inhibitor of ERK5, inhibited platelet aggregation and dense granule secretion in response to several platelet stimulators (P<0.05). The results of Western blot showed that XMD8-92 inhibited Akt phosphorylation level by down-regulating PTEN Ser370 phosphorylation and enhancing PTEN activity. The pathway was further confirmed using platelet specificPTENdeficiency mice. The first occlusion time was obviously extended in the mice intravenously given XMD8-92 in the FeCl3-induced carotid artery injury model.CONCLUSIONERK5 plays a role in platelet activation and arterial thrombosis by influencing PTEN and Akt phosphorylation.

Extracellular signal-regulated kinase 5; Platelet; Thrombosis; Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten

1000- 4718(2017)11- 1958- 06

2017- 04- 17

2017- 05- 17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270278)；上海市科委基金資助項(xiàng)目(No. 16411965600)

△通訊作者 Tei: 021-52888762； E-mail： luoxp206@163.com

R541.4； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.006