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(藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室,四川抗菌素工業(yè)研究所,成都大學(xué)，四川成都 610052)

墊狀卷柏總黃酮的 抗氧化和抗腫瘤活性

鄭瑞鳳,劉嵬,梁立,楊晨,顏軍,茍小軍,何鋼*

(藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室,四川抗菌素工業(yè)研究所,成都大學(xué)，四川成都 610052)

目的：研究墊狀卷柏總黃酮的抗氧化能力,以及對人宮頸癌細胞Hela、人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人前列腺癌細胞PC-3M的生長抑制作用。方法：采用Fenton法、鄰苯三酚自氧化法、DPPH法和還原力測定法評價墊狀卷柏總黃酮的體外抗氧化能力。CCK-8法檢測墊狀卷柏總黃酮的抗腫瘤細胞增殖活性。結(jié)果：在總黃酮質(zhì)量濃度為20～100 μg/mL之間,墊狀卷柏總黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除率隨總黃酮質(zhì)量濃度升高而增高,半數(shù)清除率EC50分別為111.86、89.24、26.51 μg/mL;對Hela、PC-3M和MDA-MB-231細胞的抑制作用在總黃酮質(zhì)量濃度為6.59～79.02 μg/mL范圍內(nèi)均呈劑量依賴性,作用時間為72 h的抑制率高于48 h的抑制率。結(jié)論：墊狀卷柏總黃酮抗氧化活性作用能力強,對Hela、PC-3M和MDA-MB-231細胞具有顯著的增殖抑制作用。

墊狀卷柏,總黃酮,抗氧化,腫瘤細胞,生長抑制

卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)為蕨類植物門卷柏科卷柏屬植物,分布廣泛,我國約有60～70種[1],四川約有21種[2],常作為藥用的有6種?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版收載了卷柏科植物卷柏或墊狀卷柏。中醫(yī)學(xué)上認為卷柏具有活血通經(jīng)之功效,用于經(jīng)閉痛經(jīng),跌撲損傷,癥瘕痞塊;炒炭后可化瘀止血,用于吐血、便血、崩漏、脫肛[3]。卷柏含有豐富的雙黃酮類生物活性物質(zhì),具有抗氧化[4-5]、抗炎[6]、抑菌[7]、抗病毒[8]、抗腫瘤[9-11]、舒張血管[12]等多種藥理活性。

已有研究表明卷柏總黃酮對結(jié)腸癌HT-29細胞,肝癌Bel-7402細胞,人肝癌HepG2細胞,肺癌A549細胞具有顯著的抑制作用[9-11]。而卷柏總黃酮對乳腺癌和前列腺癌細胞的活性研究較少。研究墊狀卷柏總黃酮對前列腺癌PC-3M細胞和乳腺癌MDA-MB-231細胞的抑制活性,以及采用體外抗氧化模型評價體外抗氧化活性,為墊狀卷柏的進一步開發(fā)利用提供依據(jù),尤其在抗氧化劑和抗癌藥物的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

墊狀卷柏 成都鐘氏蟲草行;PC-3M、Hela細胞 英國利物浦大學(xué)柯有強教授實驗室贈送;MDA-MB-231細胞 中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究院細胞庫;蘆丁標準品(純度≥99%) 中國藥品生物制品檢定所;鄰菲羅啉、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、噻唑藍(CCK)、二甲基亞砜(DMSO)、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 均為分析純，成都市科龍化工試劑廠;PBS緩沖液(pH7.4)、DMEM培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液 美國Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.05%胰酶-EDTA消化液(trypsin-ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)、青霉素、鏈霉素混合液(×100) 美國Gibco公司;細胞培養(yǎng)瓶、96孔板、15 mL離心管 美國Corning公司。

7200型可見光分光光度儀 尤尼柯(上海)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市英峪予華儀器廠;電子天平JT202N 上海越平科學(xué)儀器有限公司;臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;KQ3200超聲波清洗器 北京滬光學(xué)實驗儀器有限公司;微型植物式樣粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;全自動酶標儀(EL×800) Bioteck Instruments Inc.;CO2細胞培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;超凈工作臺 蘇州集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 墊狀卷柏總黃酮的制備 將干燥至恒重的墊狀卷柏全草,粉碎過40目篩,儲存于干燥器中備用。按照實驗室前期研究方法,準確稱取200 g墊狀卷柏干燥粉末,按料液比(g∶mL=1∶20),用70%乙醇浸提24 h,超聲輔助提取30 min,真空抽濾,濾渣重復(fù)上述操作提取兩次,合并濾液,減壓旋蒸除去乙醇,冷凍干燥得墊狀卷柏總黃酮粉末。以蘆丁為標準品,經(jīng)硝酸鋁顯色法[12],檢測波長為512 nm,測定墊狀卷柏總黃酮質(zhì)量濃度。

1.2.2 清除DPPH自由基能力的測定 DPPH(二苯代苦味?；杂苫?是一種比較穩(wěn)定的人工合成自由基,現(xiàn)已廣泛的用于提取物[13]、酚類物質(zhì)[14]、多糖類化合物[15]或其它物質(zhì)[16]的抗氧化能力評價。根據(jù)對DPPH自由基的清除能力的原理方法[17-18]評價墊狀卷柏總黃酮的體外抗氧化活性。樣品用70%乙醇溶液配制成不同濃度溶液,取1.0 mL樣品溶液、2.0 mL DPPH乙醇溶液和1.0 mL無水乙醇混合反應(yīng),置于暗處30 min,于波長517 nm處測定吸光度。用樣品乙醇溶液作為樣品顏色空白參比,無水乙醇為空白對照。按照同樣方法以同濃度VC做陽性對照。

清除率(%)=A空白對照-(A樣品-A顏色對照)/A空白對照×100

1.2.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[19]。于試管中加入5 mL 0.05 mol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液和2 mL蒸餾水,25 ℃水浴20 min后,取出加入不同濃度樣品溶液2 mL,并立即加入3 mmol/L 鄰苯三酚1 mL(在25 ℃水浴中已預(yù)熱),立即混勻,在25 ℃水浴中準確反應(yīng)4 min后,加入10 mmol/L的HCl溶液1 mL終止反應(yīng),并于320 nm處測定吸光度。按照同樣方法以同濃度VC做陽性對照。

清除率(%)=A不加樣品時吸光度-(A樣品吸光度-A不加鄰苯三酚樣品的吸光度)/A不加樣品時吸光度×100

1.2.4 清除羥基自由基能力的測定 采用水楊酸法[20],于試管中加入2 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和2 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液,混勻,再加入2 mL不同濃度樣品溶液和0.2 mL 0.3%的H2O2溶液(以不加H2O2作為顏色空白對照,以蒸餾水作為空白對照)于37 ℃反應(yīng)30 min,以去離子水為參比,然后在510 nm波長下分別測定吸光度A,按照同樣方法以同濃度VC做陽性對照。

清除率(%)=A空白對照-(A樣品-A顏色對照)/A空白對照×100

1.2.5 墊狀卷柏總黃酮還原力的測定 參考文獻[21]中的方法,于試管加入不同濃度的樣品溶液2.5 mL,pH6.8的磷酸鹽緩沖液2.5 mL、1% K3Fe(CN)6溶液2.5 mL,并加蒸餾水至10 mL,混合均勻,混合液于50 ℃保溫20 min,再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液,混合后3000 r/min 離心10 min。取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水,加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,室溫放置10 min,測定反應(yīng)液在700 nm處的吸光度。

1.2.6 細胞培養(yǎng) Hela人宮頸癌細胞[22]用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng);PC-3M前列腺癌細胞[23],MDA-MB-231乳腺癌細胞[24]用含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

教師的專業(yè)化發(fā)展始終離不開學(xué)校組織的各類培訓(xùn)。本研究對吉林省4所有代表性的應(yīng)用型本科院校商務(wù)英語教師進行了問卷調(diào)查，結(jié)合我省具體狀況，總體分析國內(nèi)同類高校一般情況，首先向被調(diào)查教師解釋問卷調(diào)查的目的是為了了解院校商務(wù)英語教師發(fā)展現(xiàn)狀，探尋應(yīng)用型本科院校商務(wù)英語教師專業(yè)化發(fā)展途徑，請他們?nèi)鐚嵖陀^地回答。共發(fā)放問卷 76份，全部回收，有效問卷73份。為了消除被調(diào)查者顧慮，調(diào)查問卷采取無記名的方式。在問卷調(diào)查的基礎(chǔ)上還對4所學(xué)校的一些教師進行隨機訪談。因此，該調(diào)查結(jié)果有一定代表性。調(diào)查結(jié)果相對真實而客觀，調(diào)查的師資情況見表1。

1.2.7 體外抑制腫瘤細胞增殖實驗 采用CCK法進行測定[24-25]。取對數(shù)生長期的腫瘤細胞Hela、PC-3M、NDA-MB-231細胞接種于96孔板,使每孔細胞約為1×104個/mL,實驗組和正常對照組分別加入100 μL細胞懸浮液,空白組加入100 μL培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2條件下預(yù)培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的樣品溶液,每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔,正常對照組和空白組分別加入100 μL培養(yǎng)基。繼續(xù)在37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)48、72 h后,吸棄上清后每孔各加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后取出用酶標儀在490 nm處測定吸光度值。計算對癌細胞的抑制率或細胞活力。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實驗處理重復(fù)3次,實驗結(jié)果均表示為平均值±標準差。采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,進行單因素方差分析,各組間的差異比較采用LSD法,以p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1DPPH抗氧化活性

不同濃度的墊狀卷柏總黃酮對DPPH的清除率結(jié)果見圖1。濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)其清除能力隨總黃酮濃度的升高而加強,而濃度增加為200 μg/mL時,清除率增加不明顯,并趨于平衡,墊狀卷柏和VC的清除率分別為83.42%和94.98%,卷柏總黃酮對DPPH自由基的半數(shù)清除率EC50為26.51 μg/mL;通過考察墊狀卷柏總黃酮對DPPH自由基的清除,表明墊狀卷柏總黃酮有較好的清除能力,可能與總黃酮中的穗花杉雙黃酮化合物有關(guān)[5],有文獻研究報道墊狀卷柏雙黃酮和穗花杉雙黃酮[26]均可濃度依賴性清除DPPH自由基。

圖1 墊狀卷柏總黃酮對DPPH自由基清除率測定結(jié)果Fig.1 Scavenging effects of total flavonoids from selaginella on DPPH free radicals

2.2清除超氧陰離子自由基的能力

超氧陰離子是一類重要的活性氧自由基,可誘導(dǎo)大分子物質(zhì)產(chǎn)生氧化損傷,因此通過測定對超氧陰離子自由基的清除作用可以評價物質(zhì)的抗氧化能力大小。不同濃度的墊狀卷柏總黃酮清除超氧陰離子的作用如圖2所示,在20～100 μg/mL范圍內(nèi),墊狀卷柏總黃酮的清除作用隨濃度增加而增強,當濃度為200 μg/mL時,VC和墊狀卷柏總黃酮對超氧陰離子自由基的清除率分別為91.75%和62.5%,卷柏總黃酮對超氧陰離子自由基的半數(shù)清除率EC50為89.24 μg/mL。

圖2 墊狀卷柏總黃酮對超氧陰離子 自由基清除率測定結(jié)果Fig.2 Scavenging effects of total flavonoids from selaginella on superoxide anion free radical

利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生具有高反應(yīng)活性的·OH。如果在體系中含有清除·OH能力的物質(zhì),能與水楊酸競爭·OH,使水楊酸捕捉·OH后產(chǎn)生的有色物質(zhì)生成量減少,該物質(zhì)在510 nm 處有最大吸收[15]。不同濃度的墊狀卷柏總黃酮對羥基自由基的清除作用如圖3所示,總黃酮濃度為20～200 μg/mL的范圍內(nèi),VC和墊狀卷柏總黃酮的清除作用隨濃度的增加而清除活性增強,兩者趨勢基本一致,當濃度為200 μg/mL時,VC對羥基自由基的清除率為91.25%,墊狀卷柏總黃酮的清除能力為64.67%,半數(shù)清除率EC50為111.86 μg/mL。結(jié)果表明墊狀卷柏總黃酮對羥基自由基的清除能力較強。

圖3 墊狀卷柏總黃酮對羥基自由基清除率測定結(jié)果Fig.3 Scavenging effects of total flavonoids from selaginella on hydroxyl radical

2.4還原力測定

物質(zhì)還原力的原理揭示了待評價化合物是電子給予體,它可將Fe3+還原成Fe2+,能與Fe3+形成普魯士藍,在700 nm 處有最大吸收峰,吸光度越大,抗氧化能力越強。表明物質(zhì)的還原能力和其抗氧化能力呈正相關(guān)性,測定物質(zhì)的還原能力是測定物質(zhì)抗氧化能力的重要指標之一。由圖4所示,在濃度為200 μg/mL時,墊狀卷柏總黃酮和VC的OD值分別為0.913、1.439,表明墊狀卷柏總黃酮有較強的還原能力,還原能力隨總黃酮濃度增加而增強,通過分析計算墊狀卷柏總黃酮的總還原能力與其濃度呈正相關(guān)性,得到VC和卷柏總黃酮的相關(guān)系數(shù)分別為0.99和0.98。

圖4 墊狀卷柏總黃酮的還原力Fig.4 The reducing power of total flavonoids

2.5對癌細胞生長抑制作用

黃酮類化合物發(fā)揮抗腫瘤活性的機制主要是抑制腫瘤細胞增殖[27],促進腫瘤細胞凋亡[28-29]等途徑發(fā)揮活性作用。墊狀卷柏總黃酮對Hela細胞、PC-3M細胞以及MDA-MB231細胞增殖活力均有明顯的抑制作用,對不同腫瘤細胞的增殖活力抑制具有差異。如圖5所示,墊狀卷柏總黃酮對不同癌細胞的抑制作用隨濃度的增加而增加,揭示了在6.59～79.02 μg/mL濃度范圍內(nèi)墊狀卷柏總黃酮對三種腫瘤細胞的抑制作用是呈劑量依賴作用,并隨著作用時間的延長,墊狀卷柏總黃酮對腫瘤細胞的抑制作用是逐漸增強的。如圖6所示,在6.59～131.7 μg/mL范圍內(nèi),卷柏總黃酮對Hela細胞、MDA-MB-231細胞的增值抑制結(jié)果均是72 h高于48 h的抑制率;對PC-3M細胞的抑制作用是在卷柏總黃酮濃度為6.59～13.17 μg/mL范圍內(nèi)是48 h高于72 h,濃度增加為26.34 μg/mL范圍內(nèi)是72 h的抑制作用強于48 h。墊狀卷柏總黃酮對Hela、PC-3M和MD-MDA-231細胞作用48 h的半數(shù)抑制率IC50分別為:67.29、150.84、139.55 μg/mL,作用72 h的IC50分別為:28.62、48.60、25.74 μg/mL。

圖5 不同濃度的墊狀卷柏總黃酮 對腫瘤細胞在72 h的生長抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of total flavones on the growth of three different cancer cells after 72 h 注:*表示與空白對照組相比差異顯著(p<0.05); **表示與空白對照組相比差異極顯著(p<0.01)。

圖6 墊狀卷柏總黃酮對腫瘤細胞在48 h 和72 h的生長抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of total flavones on the growth of three different cancer cells after 48 h and 72 h

3 結(jié)論

本實驗以卷柏總黃酮為研究對象,采用體外抗氧化模型評價墊狀卷柏總黃酮抗氧化能力作用。當總黃酮濃度為200 μg/mL,清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除率分別為64.67%、62.5%、83.42%;而卷柏總黃酮對Fe3+還原能力強,當濃度為200 μg/mL,吸光度值為0.913。結(jié)果表明卷柏總黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有一定的清除能力,并在一定濃度范圍內(nèi)總黃酮濃度與清除自由基的能力呈正相關(guān)。墊狀卷柏總黃酮表現(xiàn)出較強的抗氧化能力,可能與穗花衫雙黃酮、羅波斯塔雙黃酮、羅波斯塔-4-甲醚雙黃酮3種活性成分有關(guān),其作用機制與調(diào)節(jié)黃嘌呤氧化酶[30-31]、脂質(zhì)氧化酶[32]、環(huán)氧化酶Ⅱ[33]活性有關(guān)。

同時,通過對抗腫瘤細胞的增殖作用研究,表明墊狀卷柏總黃酮對Hela、PC-3M、MDA-MB-231細胞均表現(xiàn)出較強的增殖抑制活性。隨著墊狀卷柏總黃酮的質(zhì)量濃度增加,作用時間延長細胞抑制作用增強,墊狀卷柏總黃酮作用72 h時的抑制能力高于作用時間為48 h。當墊狀卷柏總黃酮濃度為131.7 μg/mL時,作用時間48 h時對Hela、PC-3M和MD-MDA-231細胞的抑制率分別為:74.95%、43.83%、61.35%,IC50分別為:67.29、150.84、139.55 μg/mL;作用時間72 h時對Hela、PC-3M和MD-MDA-231細胞的抑制率分別為:81.81%、70.49%、73.38%,IC50分別為:28.62、48.60、25.74 μg/mL。卷柏總黃酮對PC-3M細胞的增殖抑制作用,可能與卷柏雙黃酮化合物能夠下調(diào)環(huán)氧化酶-2活性有關(guān)。同時,本實驗對墊狀卷柏總黃酮對PC-3M、MDA-MB231、Hela細胞的增殖作用研究中,發(fā)現(xiàn)了許多關(guān)于腫瘤細胞凋亡的現(xiàn)象,未對其細胞誘導(dǎo)凋亡量化,有待今后實驗進一步的研究探討。下一步,我們將通過分離純化等技術(shù)研究卷柏總黃酮的有效成分,為卷柏總黃酮抗氧化作用和抗癌作用提供理論依據(jù)。

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[33]黎莉. 七種卷柏屬藥用植物抑制黃嘌呤氧化酶、脂氧化酶和環(huán)氧化酶的活性作用研究[D].湖北:湖北中醫(yī)藥大學(xué),2008.

AntioxidantandantiproliferativeactivitiesoftotalflavonoidsextractedfromSelaginellapulvinata(Hook,etGrev.)Maxim

ZHENGRui-feng,LIUWei,LIANGLi,YANGChen,YANJun,GOUXiao-Jun,HEGang*

(Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Department, Sichuan Industrial Institute of Antibiotics,Chengdu University,Chengdu 610052,China)

Objective:To explore the antioxidant activity ofSelaginellapulvinata(Hook,et Grev.)Maxim of total flavone and its growth inhibitory effect on HeLla、PC-3M and MDA-MB231 cells. Methods:Fenton reaction,pyrogallol auto-oxidation and DPPH radical-scavenging systems were used for antioxidant evaluation of total flavonoidsinvitro. The reducing power was evaluated by potassium ferricyanide assay. Growth inhibitory effect of total flavonoids on Hela,PC-3M and MDA-MB231 cells was assessed by CCK-8 assay. Results:The scavenging effects of the total flavonoids on the hydroxyl,superoxide anion and DPPH free radicals increased as the total flavonoids concentration increased within 20～100 μg/mL. The EC50of total flavonoids in scavenging hydroxyl,superoxide anion and DPPH free radicals were 111.86,89.24,26.51 μg/mL,respectively. The growth of HeLa,PC-3M and MDA-MB231 cells was remarkably inhibited by total flavonoids in a dose-dependent manner within the conservation of total flavonoids of 6.59～79.02 μg/mL. The inhibiting Hela,PC-3m and MDA-MB231 cells growth in 72 h was higher than in 48 h. Conclusion:Total flavonoids ofSelaginellapulvinata(Hook,et Grev.)Maxim shows strong antioxidant activity and good inhibitory effect against the growth of Hela,PC-3m and MDA-MB231 cells.

SelaginellapulvinatamMaxim;total flavorne;antioxidant;tumor cells;growth inhibition

2017-03-29

鄭瑞鳳(1992-),女,在讀碩士研究生,研究方向:藥物分析,E-mail:zrfblue@163.com。

*

何鋼(1982-),男,博士,副教授,研究方向:微生物與生化藥學(xué),E-mail:hegang@cdu.edu.cn。

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2015JY0117);四川省教育廳基礎(chǔ)項目(17ZA0089);四川省高校重點實驗室項目(TRCWYXFZCH2016014)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)21-0037-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.008