武學(xué)東，張悅天，賈仁勇,3

鴨坦布蘇病毒甲基轉(zhuǎn)移酶的序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測

武學(xué)東1,2，張悅天1,2，賈仁勇1,2,3

為了確定鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase, MTase)功能的氨基酸序列。本研究運用生物信息學(xué)方法，以已知的黃病毒MTase的序列和結(jié)構(gòu)為模板，對GenBank上注入的DTMUV MTase序列進(jìn)行同源比對分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測。分析結(jié)果表明，DTMUV MTase與WNV，DENV-2，JEV三種病毒MTase的核酸序列同源性分別為64.76%，64.55%，67.33%，氨基酸序列同源性分別為74.71%，68.45%，75.15%；其可能結(jié)構(gòu)含有SAM結(jié)合位點且具有典型的4個α螺旋和7個β折疊的黃病毒MTase的結(jié)構(gòu)特點；同時，DTMUV MTase序列上存在黃病毒MTase經(jīng)典保守位點K-D-K-E；從而為確定DTMUV MTase屬于黃病毒MTase家族成員提供一些理論依據(jù)。

鴨坦布蘇病毒；甲基轉(zhuǎn)移酶；序列分析；結(jié)構(gòu)預(yù)測

黃病毒RNA具有5′帽子結(jié)構(gòu)，由于病毒在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制而無法利用宿主內(nèi)核加帽機制，這些病毒已經(jīng)進(jìn)化出了自己的甲基轉(zhuǎn)移酶來進(jìn)行基因組RNA的N7和2′-O甲基化。黃病毒NS5蛋白的N端約300個氨基酸是編碼MTase的區(qū)域，催化病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)中腺苷酸核糖的N7和2′-O甲基化。N7和2′-O甲基化是基因組5′帽子結(jié)構(gòu)形成過程中所必需的[1]。兩步甲基化按照GpppA-RNA →m7Gppp A-RNA→m7Gppp Am-RNA先進(jìn)行N7甲基化后進(jìn)行2′-O甲基化，從而形成Ⅰ型帽子結(jié)構(gòu)[2]。

鴨坦布蘇病毒(DTMUV)屬于黃病毒科，黃病毒屬，基因組5′端具有Ⅰ型帽子結(jié)構(gòu)，3′端無polyA尾巴結(jié)構(gòu)[3-5]。在形成帽子結(jié)構(gòu)過程中，必然有甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)的參與。而DTMUV發(fā)揮MTase功能的蛋白序列還未確定。目前，DENV，WNV，YFV等黃病毒的MTase晶體結(jié)構(gòu)均已被解析[6-8]，從而可以為DTMUV MTase的序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測提供參考。晶體結(jié)構(gòu)顯示，黃病毒的MTase包括核心區(qū)，N端和C端的亞結(jié)構(gòu)域。本研究參照其他黃病毒，運用生物信息學(xué)方法對GenBank上標(biāo)注的DTMUV MTase序列進(jìn)行分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測，對其發(fā)揮MTase功能的真實性和可靠性做出理論判斷。進(jìn)而，為DTMUV MTase的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1DTMUV基因序列 DTMUV基因序列為本實驗室分離的CQW1株DTMUV基因序列，序列號為KM233707.1。

1.2DTMUV MTase核酸序列同源比對分析 利用DNAMAN軟件對CQW1株DTMUVMTase對應(yīng)的核酸序列和在GenBank中隨機抽取的DENV，JEV，WNV 3種病毒MTase對應(yīng)的核酸序列進(jìn)行同源比對分析。

1.3DTMUV MTase氨基酸序列的同源比對分析 利用DNAMAN軟件對CQW1株DTMUVMTase對應(yīng)的氨基酸序列和在GenBank中隨機抽取的DENV，JEV，WNV 3種病毒MTase對應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析。

1.4DTMUV MTase結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SWISS-MODEL在線軟件和PyMOL軟件對DTMUV MTase的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié) 果

2.1DTMUV基因組結(jié)構(gòu) DTMUV為黃病毒科，黃病毒屬，恩塔雅病毒群。DTMUV病毒基因組為單股正鏈RNA，有一個ORF框編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白以及一個含有23aa的2K蛋白?；蚪M5′端具有Ⅰ型帽子(m7GpppAmG)結(jié)構(gòu)，其非編碼區(qū)長為94 nt；3′端不具有polyA尾巴結(jié)構(gòu)，其非編碼區(qū)長為618 nt[3-4,9]。如圖1所示。

圖1 DTMUV基因組結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the genome of DTMUV

2.2DTMUV MTase核酸序列同源比對分析 由本實驗室分離的CQW1株DTMUVMTase對應(yīng)的核酸序列和在GenBank中隨機抽取的DENV，JEV，WNV 3種病毒MTase對應(yīng)的核酸序列利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源比對分析。根據(jù)比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種病毒的MTase核酸同源性為79.04%，并且MTase的K61-D146-K182-E218經(jīng)典保守位點[1,10-11]對應(yīng)的密碼子均相同(圖2)(注：aaa和aag均能編碼K賴氨酸)。同時，利用DNAMAN對4種病毒MTase核酸序列兩兩比對后，同源性分別為63.58%，70.87%，64.76%，65.54%，64.55%，67.33%(圖4)。

注：***標(biāo)注為K61-D146-K182-E218對應(yīng)的密碼子*** label to mark codons of K61-D146-K182-E218圖2 MTase核酸序列同源比對分析Fig.2 Homologous analysis of MTase nucleic acid sequences

2.3DTMUV MTase氨基酸序列的同源比對分析

同樣，由本實驗室分離的CQW1株DTMUVMTase對應(yīng)的氨基酸序列和從GenBank中隨機抽取的DENV，JEV，WNV 3種病毒MTase對應(yīng)的氨基酸序列利用DNAMAN進(jìn)行比對分析。根據(jù)序列比對分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種病毒的MTase氨基酸序列同源性較高為82.65%，經(jīng)典保守位點K61-D146-K182-E218在4種病毒MTase氨基酸序列中均一致，非常保守(圖3)。同時，利用DNAMAN對四種病毒MTase氨基酸序列兩兩比對后，同源性分別為68.82%，81.18%，70.83%，74.71%，68.45%，75.15%(圖4)。

圖3 MTase氨基酸序列同源比對分析Fig.3 Homologous analysis of MTase amino acid sequences

圖4 黃病毒MTase核酸和氨基酸相似性Fig.4 Similarity of flaviviruses MTase in nucleotide and protein level

注：A: DTMUV; B: WNV(下同)A: DTMUV; B: WNV (The same below)圖5 MTase核心區(qū)的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of MTase core region

2.4DTMUV MTase結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SWISS-MODEL和PyMOL軟件預(yù)測了DTMUV MTase序列的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，它展示的是DTMUV MTase的核心區(qū)結(jié)構(gòu)，該區(qū)域是其功能區(qū)，與其他黃病毒MTase核心區(qū)的三級結(jié)構(gòu)十分相似。DTMUV MTase的可能結(jié)構(gòu)為4個α螺旋和7個β折疊，屬于黃病毒MTase的特有結(jié)構(gòu)，與DENV，WNV，JEV等黃病毒MTase核心區(qū)的結(jié)構(gòu)基本一致(圖5)。黃病毒MTase含有SAM結(jié)合位點，在甲基化過程中作為甲基供體的結(jié)合區(qū)域[8,12-13]。同時，SWISS-MODEL軟件預(yù)測結(jié)果顯示了在DTMUV MTase結(jié)構(gòu)上同樣含有SAM結(jié)合位點相似區(qū)，可推測該區(qū)域為甲基化過程中作為甲基供體的結(jié)合區(qū)域。在大多數(shù)細(xì)胞和病毒中，2′-O甲基轉(zhuǎn)移酶的活性部位存在K-D-K-E氨基酸四分體且高度保守，它們在三級結(jié)構(gòu)上聚集在一起形成活性口袋。同樣的，黃病毒MTase在結(jié)構(gòu)上具有由經(jīng)典保守氨基酸四分體(K61-D146-K182-E218)位點形成的活性口袋且高度保守[11,14-15]。而利用PyMOL軟件預(yù)測結(jié)果顯示，在DTMUV MTase可能結(jié)構(gòu)上也能發(fā)現(xiàn)氨基酸四分體K61-D146-K182-E218的存在，并在三級結(jié)構(gòu)上聚集在一起形成活性口袋(圖6)。

圖6 MTase的三級結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structure of MTase

3 討 論

黃病毒含有I型帽子結(jié)構(gòu)。因為黃病毒RNA是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制而不能利用宿主的酶系統(tǒng)，所以進(jìn)化出了自身的酶系統(tǒng)，黃病毒的NS5蛋白N端具有甲基轉(zhuǎn)移酶功能區(qū)域，其結(jié)構(gòu)形成了黃病毒MTase的特有結(jié)構(gòu)特征。本研究將DTMUV與DENV-2，JEV，WNV的MTase核心區(qū)的核酸序列和氨基酸序列同源比對及兩兩比對分析，能夠得到較高的同源性。其構(gòu)成酶活口袋的關(guān)鍵位點K-D-K-E在DTMUV MTase的序列上也很保守，從核酸序列和氨基酸序列的同源比對分析上能夠初步提供DTMUV MTase屬于黃病毒MTase家族成員的一些理論依據(jù)。利用SWISS-MODEL和PyMOL軟件預(yù)測的DTMUV MTase核心區(qū)可能結(jié)構(gòu)具有典型的黃病毒MTase 4個α螺旋和7個β折疊的結(jié)構(gòu)特征，且含有一個SAM結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步為DTMUV MTase能夠發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶功能提供了一些理論依據(jù)。然而，DTMUV MTase是否具有MTase功能需要實質(zhì)性地去檢測其酶活性。目前DENV，JEV，WNV等[2,15-16]黃病毒的體外酶活性已經(jīng)被檢測，為DTMUV MTase的酶活測定提供了參考。接下來的工作，我們將進(jìn)行體外測定DTMUV MTase的酶活活性以及功能相關(guān)研究。

近年來，隨著黃病毒MTase的研究逐漸深入，黃病毒MTase發(fā)揮的功能，在病毒中充當(dāng)?shù)慕巧皩λ拗鞯挠绊懸呀?jīng)有大量的研究報道。黃病毒MTase發(fā)揮功能的核心區(qū)是由SAM結(jié)合位點、RNA結(jié)合位點和GTP結(jié)合位點來執(zhí)行其功能，SAM結(jié)合位點作為甲基供體的結(jié)合區(qū)域，GTP結(jié)合區(qū)結(jié)合m7G，RNA結(jié)合位點結(jié)合未加帽的病毒RNA。當(dāng)SAM結(jié)構(gòu)類似物存在時，會和SAM競爭該區(qū)域，從而影響甲基化活性；同時，該區(qū)域的保守位點突變會影響MTase活性[11,17]。GTP結(jié)合區(qū)既可以結(jié)合GTP的鳥苷部分進(jìn)行鳥苷酸轉(zhuǎn)移，也可以結(jié)合m7Gppp A-RNA的m7G進(jìn)行甲基化反應(yīng)；該區(qū)域位點突變會影響2′-O甲基化，但不影響N7甲基化[12,14]；同時，在甲基化過程中，加入外源GTP會與m7G會發(fā)生競爭，相互拮抗對方結(jié)合GTP結(jié)合區(qū)[18]。RNA結(jié)合位點研究尚少，有報道稱在GTase反應(yīng)到MTase反應(yīng)時，RNA需要重新定位[8]。在黃病毒MTase酶活口袋上存在經(jīng)典保守位點K-D-K-E氨基酸四分體，該四分體的突變會影響MTase的N7和2′-O甲基化功能,當(dāng)N7甲基化功能缺失后，突變病毒將不能復(fù)制[2]；當(dāng)2′-O甲基化功能缺失后，突變病毒復(fù)制能力有所下降但不影響病毒增殖，會降低病毒毒力，接種小鼠后能產(chǎn)生很好的免疫原性，作為疫苗免疫小鼠能夠起到很好的保護效果[15-16]。最近又有重大發(fā)現(xiàn)，MTase使病毒RNA形成與宿主細(xì)胞mRNA非常相似的帽子結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致宿主天然免疫系統(tǒng)無法識別和清除，形成天然免疫逃逸[19-20]。并且有研究表明，黃病毒2′-O甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化形成5′帽子結(jié)構(gòu)的病毒能夠逃逸IFIT1的抗病毒作用[21]。從另一個角度發(fā)現(xiàn)，IFIT1優(yōu)先結(jié)合2′-O未甲基化的病毒RNA，使真核翻譯起始因子無法結(jié)合病毒RNA，最終抑制病毒的復(fù)制和翻譯[22-23]。目前為止，黃病毒MTase的大量研究報道有效的闡明了MTase在病毒侵染與宿主抗病毒之間所起的重要作用；而鴨坦布蘇病毒MTase的研究將會豐富黃病毒MTase的研究內(nèi)容。使用生物信息學(xué)的方法只能將前人大量的試驗結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，從而便于對未知結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。但是，要驗證鴨坦布蘇病毒MTase的具體功能還需具體試驗數(shù)據(jù)來提供更為可靠的依據(jù)。

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SequenceanalysisandstructurepredictionofthemethyltransferaseofduckTembusuvirus

WU Xue-dong1,2, ZHANG Yue-tian1,2, JIA Ren-yong1,2,3

(1.ResearchCenterforAvianDiseases,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;2.InstituteofPreventiveVeterinaryMedicine,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;3.KeyLaboratoryofAnimalDiseasesandHumanHealthofSichuanProvince,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

In order to determine the amino acid sequence of functionthat play a role of methyltransferase (MTase) activity in duck Tembusu virus (DTMUV),we have made sequence analysis and structure prediction of the MTase in DTMUV by bioinformatics methods, as well as using the sequence and structure of MTase in other flaviviruses which have been reported. The bioinformatical analysis results showed that the MTase and the MTase of other three kinds of flaviviruses had the higher homology in nucleotide sequence and amino acid sequence, for 64.76%, 64.55%, 67.33% and 74.71%, 68.45%, 75.15% respectively, and the same basic structural characteristics which contained SAM binding site and had a typical of 4 alpha screw and 7 beta folding. At the same time, there were classical conservative sites K-D-K-E of flavivirus MTase in DTMUV MTase sequence. In conclusion, they imply that the MTase of DTMUV might belong to MTase family of flaviviruses .

duck Tembusu virus; methyltransferase; sequence analysis; structure prediction

Jia Ren-yong, Email: jiary@sicau.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.005

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目資助 (No.2017JY0014)

賈仁勇，Email：jiary@sicau.edu.cn

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病防治研究中心, 成都 611130;

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所, 成都 611130;

3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室, 成都 611130

373

A

1002-2694(2017)10-0877-05

Funded by the Application and Base Research Project of Sichuan Science and Technology Department (No.2017JY0014)

2017-06-30編輯李友松