孫枝紅 周理華 鄧冠軍 鄭明彬++言偉強++李文軍 蔡林濤 龔萍

摘 要 循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）的簡單、快速分離和檢測是目前臨床研究中面臨的一項挑戰(zhàn)。本研究制備了具有腫瘤靶向識別作用的磁性熒光IR780Fe3O4納米顆粒， 并將其用于CTCs的分離和檢測。通過電鏡、熒光光譜儀和超導(dǎo)量子干涉儀對合成的IR780Fe3O4納米顆粒進行表征； 采用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀對IR780Fe3O4納米顆粒對腫瘤細胞和正常細胞的靶向效果進行了分析； 利用激光共聚焦顯微鏡對IR780Fe3O4納米顆粒在MCF7細胞中的位置進行定位； 并根據(jù)IR780Fe3O4納米顆粒孵育后腫瘤細胞的熒光強度繪制標準曲線。研究結(jié)果表明，IR780Fe3O4能很好地靶向多種CTCs。細胞定位實驗進一步表明，IR780Fe3O4主要靶向識別腫瘤細胞的線粒體。通過Fe3O4磁性納米顆粒偶聯(lián)IR780建立的這種方法可很好地區(qū)分腫瘤細胞和正常細胞，并對模擬血液中的CTCs進行了分離和檢測。

1 引 言

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和難以根治的重要原因[1]。腫瘤的微轉(zhuǎn)移（Micrometastasis）是指少數(shù)具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞脫離原發(fā)灶，轉(zhuǎn)移到血液、淋巴結(jié)、骨髓或遠處器官中。目前臨床上的檢測方法很難發(fā)現(xiàn)這種微轉(zhuǎn)移[2]。相關(guān)研究表明，在癌癥發(fā)展的早期，已有微轉(zhuǎn)移發(fā)生。循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）是自發(fā)或因診療操作，由實體瘤或轉(zhuǎn)移病灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞，是惡性腫瘤患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的重要標志。CTCs是公認的腫瘤轉(zhuǎn)移的先導(dǎo)標志，其可作為腫瘤分期的重要判定標準[3]。此外，研究也表明， 腫瘤患者CTCs數(shù)據(jù)可作為腫瘤分期的重要預(yù)測因子和病情改善與否的標志[4]。CTCs的早期檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的微轉(zhuǎn)移、監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)、評估療效及預(yù)后或選擇合適的個體化治療[5～7]。而且CTCs檢測樣本為血液，而血液標本易于收集且為微創(chuàng)性，因此即使是在無轉(zhuǎn)移的情況下，CTCs也可作為潛在性實時標志物用于監(jiān)測疾病進展和指導(dǎo)治療方案的建立，預(yù)測治療的有效性和必要性[8，9]。CTCs檢測常見的檢測方法有聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、流式細胞分選（Fluorescenceactivated cell scanning/sorting， FACS）、免疫磁性分離（Magneticactivated cell separation， MACS）、稀有細胞自動檢測系統(tǒng)，及基于表面拉曼增強（SERS）和量子點的方法[6，10～13]，基于納米界面的捕獲和分離方法近幾年來也備受關(guān)注[14～16]。

盡管CTCs應(yīng)用前景較好，但是在實際臨床過程中應(yīng)用程度則較低， 其原因主要有： （1）目前市場上尚無檢測CTCs的完善的商業(yè)化系統(tǒng)； （2） 對于通過EpCAM檢測CTCs的方式， 受到EpCAM表達的限制； （3）目前常用的檢測方式過于繁瑣，對操作水平要求過高并且所需成本亦較高。鑒于上述的不足，建立快速、簡易、可準確檢測CTCs并且將其有效分離的方法， 仍然是目前該領(lǐng)域所面臨的一項挑戰(zhàn)[10，11]。

納米材料尤其是磁性納米顆粒納米材料已被廣泛用于癌癥的診斷和治療。其中超順磁性氧化鐵納米顆粒尤其是Fe3O4， 因其獨特的磁特性和易于化學(xué)修飾而改善生物相容性備受關(guān)注[17，18]。Fe3O4納米顆粒已廣泛應(yīng)用于生物固定、生物分離、環(huán)境處理、生物醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)工程、食品分析等方面[19～22]。此外，近紅外染料逐漸被應(yīng)用于腫瘤成像和靶向治療方面，其穿透能力強，激發(fā)波長一般介于700～1000 nm之間，因此，在深部組織很容易檢測到熒光強度[23～25]； IR780作為近紅外染料中的一種， 具有很強的熒光強度和腫瘤靶向性， 可選擇性地靶向輸送至腫瘤的線粒體中， 常用于腫瘤成像和治療[23～30]。Zhang等[31]探討IR780靶向線粒體的機制，結(jié)果表明， 有機陰離子轉(zhuǎn)運肽OATP1B3亞型在IR780靶向腫瘤細胞線粒體的過程中扮演著重要作用； Wang等[32]利用IR780靶向腫瘤細胞線粒體的特點，將其用于耐藥性肺癌細胞的治療，同常見化療藥物相比， 其可更好地靶向腫瘤細胞， 并且誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。

本研究建立了Fe3O4磁性納米顆粒偶聯(lián)IR780分離和檢測CTCs的新的檢測方法。利用IR780兼具較強的熒光強度和靶向腫瘤細胞的特點，通過熒光成像和流式細胞術(shù)評價檢測方法的可行性，并建立了定量測定CTCs的方法，對其實用性進行了評價。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FP6000熒光光譜儀（Jasco公司）； Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）； NANO ZS多功能酶標儀（美國BioTek公司）； ViCELL XR全自動細胞計數(shù)儀（美國貝克曼庫爾特公司）； Tecnai G2F20場發(fā)射透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、鏈霉素、青霉素等購于美國Hyclone公司； Lysotracker Green、DAPI磁珠（Fe3O4納米顆粒， 美國Thermo Fisher公司）。所用試劑均為分析純

2.2 IR780Fe3O4納米顆粒的制備

2.2.1 IR780NH（CH2）6NH2的合成 在5 ml無水DMF中加入6.97 mg己二胺2.1 μL三乙胺（TEA）， 氮氣保護下，加入10 mg IR780，進行氯取代，室溫下反應(yīng)4 h。減壓蒸餾除去DMF，用二氯甲烷/甲醇溶解， 層析過柱，得到綠色固體，產(chǎn)率為78%。

2.2.2 IR780Fe3O4的制備 將100 μL磁珠、 200 μL 0.4 mol/L NHS、 200 μL 0.4 mol/L EDC在DMF中活化3 h。 在氮氣保護下，加入IR780NH（CH2）6NH2， 室溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)液用水透析3天后，將透析好的納米顆粒用截留分子量100 kDa 的超濾管超濾洗滌3次，即得到IR780Fe3O4納米顆粒。endprint

2.3 IR780Fe3O4納米顆粒的表征

采用透射電鏡（ TEM）觀察IR780Fe3O4納米顆粒的形貌。取純水溶液中的IR780Fe3O4納米顆粒通過FP6000熒光光譜儀測定其熒光發(fā)射光譜； 采用VSM振動樣品磁強計測定IR780Fe3O4納米粒子的磁化曲線。

2.4 細胞培養(yǎng)

選擇MCF7、bEnd3、A498、293、A549、HepG2、LO2、SKOV3和MCF10A（中國科學(xué)院細胞庫）進行實驗，其中MCF10A、LO2細胞系用RPMI1640完全培養(yǎng)基，其余細胞系均用DMEM完全培養(yǎng)基（10%小牛血清+1%的青霉素，鏈霉素）培養(yǎng)，置于5% CO2氣氛中， 37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

2.5 激光共聚焦顯微鏡測定IR780Fe3O4的靶向效果

將處于對數(shù)生長期的MCF7、bEnd3細胞按照5000個/孔的濃度鋪于8孔共聚焦平板中，放置于5% CO2， 37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無血清的DMEM，同時加入5 μL濃度為2.5 μg/mL IR780Fe3O4納米顆粒，孵育30 min后，PBS洗滌2次，加入DAPI染色液對細胞核染色和Lyso tracker Green對細胞溶酶體進行染色。15 min后，PBS洗滌兩次，加入DMEM后用激光共聚焦顯微鏡對其進行成像及定位觀察。

2.6 流式細胞儀檢測腫瘤細胞和正常細胞對IR780Fe3O4納米顆粒攝取

將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞（MCF7、A498、SKOV3和A549）和正常細胞（bEnd3、293、LO2、和MCF10A）按照5×104 cell/mL鋪于培養(yǎng)皿中，放置于5% CO2， 37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜后，分別加入10 μL 2.5 μg/mL IR780Fe3O4納米顆粒，孵育30 min，棄去培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化，置于1.5 mL離心管，再用PBS離心洗2次，流式細胞儀測定腫瘤細胞和正常細胞對IR780Fe3O4納米顆粒的攝取情況。

2.7 CTC檢測標準曲線的建立及性能評價

將處于對數(shù)生長期的MCF7細胞按照5 × 104 cell/mL鋪于培養(yǎng)皿中，置于5% CO2， 37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜后，加入10 μL IR780Fe3O4納米顆粒至終濃度為2.5 μg/mL，孵育30 min，棄去培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化，稀釋成不同的濃度（50、100、5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105 cell/mL），測定不同濃度下的熒光值，根據(jù)熒光測定值繪制標準曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 IR780Fe3O4的合成及對腫瘤和正常細胞的靶向識別原理

IR780具有很強的熒光強度和腫瘤靶向性，并且其穿透能力強，在深部組織中也可檢測到其熒光強度[33，34]。在所有類別的納米顆粒中，超順磁性氧化鐵納米顆粒，尤其是Fe3O4，因其獨特的磁特性和易于化學(xué)修飾而改善生物相容性備受關(guān)注[17，18]。

IR780Fe3O4納米顆粒的透射電鏡（圖1A）顯示其顆粒大小均一，分散性好，呈經(jīng)典的球形。通過動態(tài)光散射DLS粒度儀測得IR780Fe3O4納米顆粒的平均水合粒徑約為31.6 nm； IR780Fe3O4在不同pH值和不同NaCl濃度的穩(wěn)定性如圖1B所示，表明IR780Fe3O4在pH值介于5～9之間具有很好的穩(wěn)定性，但是過高的離子濃度則破壞IR780Fe3O4的穩(wěn)定性； 圖1C為IR780的激發(fā)和發(fā)生光譜，在730 nm激發(fā)下，IR780Fe3O4納米顆粒的發(fā)射峰在788 nm，具有較好的體內(nèi)成像潛力[13，17]； 室溫下測得IR780Fe3O4納米粒子磁化曲線，其飽和磁強度為4.02 emu/g，如圖1D所示，說明IR780Fe3O4納米顆粒兼具Fe3O4的磁特性優(yōu)勢[18]，可用于腫瘤細胞的磁分離。

3.2 IR780Fe3O4對腫瘤細胞的靶向識別作用

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示， 視野中經(jīng)IR780Fe3O4孵育后，在同樣的參數(shù)條件下，MCF7細胞和bEnd3細胞相比呈現(xiàn)更強熒光強度，為進一步說明條件的一致性，將IR780Fe3O4孵育后MCF7和bEnd3細胞分別給予溶酶體探針標記，通過對比可更清晰地呈現(xiàn)出兩種細胞之間的熒光差異性。此外，將MCF7和bEnd3細胞混合共培養(yǎng)，經(jīng)IR780Fe3O4孵育，在同一視野下可清晰分辨出MCF7和bEnd3熒光差異性，同時也將其用溶酶體探針染色后，通過對比可顯示出更明顯熒光差異（圖2）。

流式細胞儀分析IR780Fe3O4，孵育后腫瘤細胞（MCF7、A498、A549和SKOV3）和正常細胞（bEnd3、293、LO2和MCF10A）熒光強度的變化（圖3），IR780Fe3O4孵育后，無論是腫瘤細胞，還是正常細胞，均較未孵育的細胞的熒光強度增加，但是孵育后腫瘤細胞的熒光強度均介于104～105，明顯高于正常細胞的熒光強度（102～103）。

3.3 IR780Fe3O4納米顆粒在細胞中的定位

圖2和圖3表明IR780Fe3O4可進入細胞。通過激光共聚焦顯微鏡觀察IR780Fe3O4在細胞器中的具體分布情況（圖4），將經(jīng)2.5 μg/mL IR780Fe3O4孵育后的MCF7細胞，分別進行溶酶體和細胞核雙染及線粒體和細胞核雙染，在激發(fā)波長為405， 543和633 nm激光下觀察IR780Fe3O4的分布情況，IR780Fe3O4位于細胞質(zhì)中，并未進入細胞核內(nèi)，其熒光與線粒體探針熒光基本上可以完全重合，表明IR780Fe3O4納米顆?？梢赃M入細胞并且靶向于線粒體中，結(jié)果如圖4所示，這與文獻[31，32]一致，IR780可以靶向至腫瘤的線粒體中，可用于腫瘤熒光成像。

3.4 IR780Fe3O4應(yīng)用于CTC檢測

將IR780Fe3O4納米顆粒孵育MCF7細胞，分別稀釋成50、100、500、1×103、5×103、1×104、5×104和1×105 cell/mL，采用FP6000熒光光譜儀測定不同濃度下相應(yīng)的熒光值，并且根據(jù)熒光測定值繪制標準曲線（圖5）； 取IR780Fe3O4納米顆粒孵育過，但細胞濃度未知的MCF7、A549、A498和SKOV3 細胞，按照1∶1， 1∶5和1∶25的比例稀釋成3個梯度，每個梯度分別取3 mL（分裝在3個離心管中，每管1 mL），其中管1通過測定熒光強度并根據(jù)熒光標準曲線計算細胞數(shù)量； 另外，管2應(yīng)用磁分離技術(shù)將分離出的細胞分別用細胞板和細胞計數(shù)儀測定細胞數(shù)量，細胞計數(shù)儀和熒光法均具有較好依從性優(yōu)于細胞板計數(shù)法，表明采用IR780Fe3O4檢測CTC的標準曲線具有可行性（見表1和圖5）。

為了進一步闡明IR780Fe3O4可有效地檢測和分離腫瘤細胞和正常細胞，將1000 cell/mL MCF7分別與同濃度正常細胞bEnd3、293、LO2、和MCF10A

4 結(jié) 論

CTCs是循壞癌癥極為重要的標志物，可作為患者預(yù)后判斷的無創(chuàng)檢測指標。本研究通過分析熒光強度變化，成功構(gòu)建了CTCs檢測體系。與其它方法相比，本方法制備簡單、檢測和分離方式快捷，可有效地用于檢測腫瘤細胞。但是，CTCs因癌癥種類不同而存在差異性，因此不能通過單一的檢測方式就能夠確定CTCs數(shù)量，進而評估患者疾病狀態(tài)及其預(yù)后，而是應(yīng)根據(jù)不同腫瘤細胞表面分子表達特點聯(lián)合小分子熒光測定的優(yōu)勢，確定CTCs的數(shù)量，因此，后續(xù)的研究可在此基礎(chǔ)上進一步完善，進而提高檢測效率。endprint