姚雪蓮+陳查丹+張晶+崔漢峰+林艷+洪年+何玲玲+孔德榮+樊浩+程林

摘 要 基于β環(huán)糊精（βCD）主客體競爭模式，構(gòu)建了開關(guān)型凝血酶適配體電化學(xué)傳感器。將末端修飾了二茂鐵（Fc）的核酸適配體通過與βCD的主客體識(shí)別固定在金電極表面，當(dāng)凝血酶存在時(shí)，適配體由原來的直立線狀構(gòu)型變?yōu)椤癎四鏈體”，遠(yuǎn)離電極表面，適配體探針的氧化還原電流強(qiáng)度減小，即“Signaloff”。利用此效應(yīng)對(duì)凝血酶進(jìn)行了靈敏檢測，結(jié)果表明，在5.0×10mol/L（3σ）。與其它蛋白分子相比，本方法對(duì)凝血酶蛋白的檢測具有高特異性。本傳感器構(gòu)建簡單，再生性好，為生物血清樣本中凝血酶的實(shí)時(shí)高效檢測提供了方法。

1 引 言

凝血酶是一種重要的凝血系統(tǒng)絲氨酸蛋白酶，在傷口愈合、血管止血、炎癥、組織黏合、動(dòng)脈硬化等過程中發(fā)揮了重要作用[1，2]。此外，凝血酶對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長具有調(diào)節(jié)作用，濃度較低時(shí)促進(jìn)生長，濃度較高時(shí)抑制其生長，甚至產(chǎn)生凋亡效應(yīng)[3]，在激活正常細(xì)胞的致瘤性和惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面也扮演著重要角色[4，5]。凝血酶含量是衡量機(jī)體凝血功能異常一種指標(biāo)，因此，建立靈敏、快速檢測凝血酶的方法對(duì)疾病診斷具有重要意義。

適配體（Aptamer）可與目標(biāo)物高特異性、高選擇性結(jié)合，具有易合成、易修飾、高穩(wěn)定性、配體廣泛、無免疫原性、易儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)[6]，基于適配體的傳感方法近年來得到廣泛應(yīng)用[7～12]。很多文獻(xiàn)報(bào)道了利用適配體構(gòu)建的凝血酶電化學(xué)傳感器 [13～19]。Gao[20]等設(shè)計(jì)了一種三明治型凝血酶適配體電化學(xué)傳感器，將巰基化的一條適配體固定在金電極表面，形成適配體凝血酶復(fù)合物，并與另一條修飾了Pt NPs/CNCs的適配體結(jié)合，通過納米粒子催化H2O2的電化學(xué)還原產(chǎn)生陰極電流，對(duì)凝血酶實(shí)現(xiàn)放大檢測，檢出限為1.0×10

mol/L。Wang等[21]基于金納米粒修飾的au@GS和CoPd NPs，用巰基標(biāo)記的探針作為捕獲探針，生物素標(biāo)記的探針作為報(bào)道探針，形成的夾層結(jié)構(gòu)對(duì)凝血酶的檢出限低至5 pg/mL。這些方法雖然能有效放大信號(hào)，但是檢測過程中需多步識(shí)別，操作過程復(fù)雜。有研究者利用電活性標(biāo)記物在電極表面的電子傳遞構(gòu)建了“Signalon”開關(guān)型凝血酶電化學(xué)傳感器，如Radi[22]和Katakis[23]等將Fc標(biāo)記的適配體通過巰基固定在金電極表面，適配體與凝血酶結(jié)合后，形成剛性的“G四鏈體”結(jié)構(gòu)而靠近電極表面，電化學(xué)信號(hào)增大，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的檢測。Xiao等[24]設(shè)計(jì)了同樣檢測原理的凝血酶傳感器，利用適配體凝血酶的特異性結(jié)合，使適配體上標(biāo)記的亞甲基藍(lán)（MB）與電極表面接近，使信號(hào)增強(qiáng)， 2.56×10mol/L的凝血酶響應(yīng)信號(hào)約為空白的270%。此類傳感器是通過與凝血酶識(shí)別前后標(biāo)記物與電極表面距離發(fā)生的改變而導(dǎo)致電信號(hào)的改變進(jìn)行測定，雖然構(gòu)建簡便，但電化學(xué)標(biāo)識(shí)物的電子傳遞受到了適配體鏈長度的限制，因而對(duì)靈敏度有所影響。

環(huán)糊精是直鏈淀粉在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下所生成的系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含6～12個(gè)D吡喃葡萄糖單元，其中βCD是研究較多的含有7個(gè)葡萄糖單元的分子。環(huán)糊精分子具有類似錐形的中空圓筒腔體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部是疏水空腔而外部是親水環(huán)形。其特殊的腔體結(jié)構(gòu)使得環(huán)糊精具有突出的識(shí)別和包絡(luò)客體分子的能力，如有機(jī)分子、無機(jī)離子等，這種主客體間的識(shí)別作用能使分子形成良好組裝體系，在醫(yī)藥、分析、化工、環(huán)保等研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[25]。本研究利用βCD與Fc的主客體識(shí)別原理，構(gòu)建了一種“Signaloff”的開關(guān)型適配體傳感器，用于凝血酶的檢測。3′標(biāo)記Fc的抗凝血酶適配體利用βCD與Fc客體的識(shí)別作用組裝到修飾βCD的電極表面（實(shí)驗(yàn)原理見圖1），在凝血酶不存在時(shí)，由于Fc在電極表面發(fā)生氧化還原給出電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)； 凝血酶存在時(shí)，與適配體特異性結(jié)合，適配體構(gòu)型發(fā)生改變，離開電極表面，電子傳遞受阻，信號(hào)減弱。本方法中，適配體與凝血酶結(jié)合后標(biāo)記物直接脫離電極表面，檢測信號(hào)不受適配體鏈長度的影響，因此靈敏度高。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

AUTOLAB電化學(xué)工作站（瑞士萬通儀器有限公司）； 采用三電極體系：金電極（直徑1.0 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極（飽和KCl）為參比電極，鉑電極為對(duì)電極； 400 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker科技有限公司）。

βCD（SigmaAldrich公司）； 凝血酶、牛血清白蛋白（BSA）、溶血酶（生工生物工程（上海）股份有限公司）； 核酸適配體序列：3′FcGGTTGGTGTGGTTGG5′（大連寶生物工程有限公司）； 所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水（美國Millipore公司超純水系統(tǒng)）制備。

2.2 SHβCD的合成

參照文獻(xiàn)[26]，將βCD （1.10 g， 1.0 mmoL）加入含三苯基膦（5.20 g， 20 mmoL）和碘（5.05 g， 20 mmoL）的20 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，混合體系在氮?dú)獗Ｗo(hù)下80℃磁力攪拌15 h，將反應(yīng)液濃縮約1/2，使得pH=9.0～10.0，再加入甲醇鈉的甲醇溶液 （3 moL， 8.0 mL）中，冷卻后在室溫下放置30 min，以破壞在反應(yīng)中形成的酯類，加入100 mL冰甲醇和500 mL冰水環(huán)境下產(chǎn)生沉淀，收集沉淀，用冰水和甲醇沖洗，干燥后得到白色粉末（6IβCD）（1.56 g，82%）。

取6IβCD（1.56 g， 0.82 mmoL）、硫脲（0.48 g， 6.4 mmoL） 溶于16 mL DMF中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下70℃反應(yīng)19 h后，減壓除去DMF，再加入NaOH（0.42 g， 1.05 mmol/L），氮?dú)夥障录訜峄亓? h后，用水合KHSO4過濾沉淀，用蒸餾水洗滌，干燥除去殘留的DMF。在得到的懸浮液中加入少量NaOH使澄清，加入KHSO4產(chǎn)生沉淀，經(jīng)過濾真空干燥后得到白色粉末（0.85 g，83%），即6SHβCD，所得1H NMR化學(xué)位移為：δ 5.92（d， J=6.0 Hz， 7 H）， 5.82（s， 7 H）， 4.93（s， 7 H）， 3.68（t， J=6 Hz， 7 H）， 361（t， J=7.5 Hz， 7 H）， 3.19（brd， J=15 Hz， 7 H）， 2.77～2.74（m， 7 H）， 2.13（t， J=6.0 Hz， 7 H）， 如圖2。endprint

2.3 傳感器的制備

分別用0.30和0.05 μm Al2O3粉末打磨金電極，用超純水超聲清洗后在0.5 mmoL/L H2SO4中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描（掃描電壓

0.01 mol/L SHβCD溶液中，4℃孵育2 h。修飾后的電極用20 mmol/L TrisHCl緩沖液（pH 7.4）清洗，氮?dú)饬飨赂稍?，再將電極浸泡在3.0×10

mol/L適配體乙醇（1∶1，V/V）的溶液中12 h，將適配體組裝到電極表面，用超純水清洗后于氮?dú)饬飨赂稍?，即制得傳感器?/p>

2.4 凝血酶的檢測

在TrisHCl緩沖液中，將制備的適配體傳感器用示差脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行電位掃描（掃描范圍0.2～0.6 V，增量0.001 V，脈沖振幅0.05 V，掃描速率0.002 V/s），記錄峰電流的大小。然后在緩沖液中加入凝血酶，37℃下孵化5 min后，測量DPV峰電流大小，加入凝血酶前后峰電流變化的差值可用于定量檢測凝血酶。

3 結(jié)果與討論

3.1 主客體識(shí)別的驗(yàn)證

為了研究βCD的主客體識(shí)別特性，分別將裸金電極和SHβCD修飾的金電極浸泡在濃度為1.0×10

mol/L Fc溶液中10 min后，在TrisHCL緩沖液中進(jìn)行DPV掃描。結(jié)果表明，裸電極在0.2 V附近未觀察到Fc的氧化還原峰（圖3 曲線a），說明Fc未吸附在電極表面； 修飾了SHβCD的金電極則在1.1 μA處產(chǎn)生了明顯的氧化還原峰（圖3 曲線b），證明基于βCD和Fc的主客體識(shí)別作用使大量的Fc

固定于金電極表面。

3.2 修飾電極的電化學(xué)阻抗表征

采用電化學(xué)阻抗對(duì)電極的組裝和監(jiān)測過程進(jìn)行了表征，如圖4所

示，裸金電極作為一個(gè)理想的導(dǎo)體在阻抗譜

中的高頻部分出現(xiàn)一個(gè)小半圓（曲線a），其直徑相當(dāng)于電子轉(zhuǎn)移阻抗（Ret）； 用SHβCD修飾電極后，金電

在金電極表面的電子交換，Ret值從裸電極的345 Ω增加到990 Ω（曲線b）； 將適配體組裝到電極表面后，電極表面與氧化還原探針間的負(fù)電荷相互排斥，阻礙了電子傳遞，使得Ret值繼續(xù)增大至1300 Ω（曲線c），表明適配體組裝成功； 與5.0×mol/L凝血酶作用后，適配體的構(gòu)型發(fā)生改變離開電極，少數(shù)未反應(yīng)部分仍留在電極表面，因而電極的Ret阻抗值減小為1140 Ω（曲線d）。

3.3 傳感器的分析性能

將制備的適配體傳感器分別與0、5.0×10mol/L的凝血酶作用，發(fā)現(xiàn)隨著凝血酶濃度的增加，DPV信號(hào)強(qiáng)度從1.0 μA降至0.1 μA（如圖5 a～f）這是因?yàn)椴煌瑵舛鹊哪概c適配體結(jié)合后構(gòu)型改變，F(xiàn)c標(biāo)記物遠(yuǎn)離電極表面，電子傳遞阻礙越來越大，表現(xiàn)為電流信號(hào)減弱。對(duì)響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行線性回歸，在5.0×10 mol/L范圍內(nèi)，凝血酶濃度與信號(hào)響應(yīng)值呈負(fù)相關(guān)（圖5插圖），線性回歸方程為y=-0.1577lgx-1.1885， 相關(guān)系數(shù)r=0.9949， 檢出限為2.0×10

3.4 傳感器的特異性

考察了傳感器對(duì)其它蛋白分子的響應(yīng)，用傳感器分別檢測TrisHCl緩沖液、5.0×10mol/L BSA、5.0×10mol/L 溶血酶、5.0×10mol/L凝血酶，如圖6中a～d，結(jié)果表明，只有凝血酶的一組的信號(hào)明顯減小。在5.0×10mol/L凝血酶中分別混合了10和100倍于凝血酶濃度的BSA、溶血酶、BSA和溶血酶，發(fā)現(xiàn)并未干擾凝血酶的測定，檢測到的信號(hào)峰無明顯變化（圖6中e～j），表明此傳感器對(duì)凝血酶的檢測不受其它共存蛋白分子的影響，可實(shí)現(xiàn)凝血酶的特異性檢測。

3.5 實(shí)際血清樣本分析

為了研究此傳感器的實(shí)際應(yīng)用性能，用江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院健康志愿者血清樣本（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。將5 μL血清樣本用TrisHCl緩沖液稀釋10倍后，再分別加入不同濃度的凝血酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，回收率為95.5%～104.1%，RSD為4.8%～8.0%，可滿足對(duì)實(shí)際樣本的高效檢測的要求。

mol/L凝血酶進(jìn)行再次檢測， 發(fā)現(xiàn)DPV信號(hào)與再生之前基本一致，如圖7所示，在連續(xù)再生6次后的電極響應(yīng)基本不變。構(gòu)建的分子識(shí)別型傳感器與目標(biāo)物結(jié)合后，F(xiàn)c隨著適配體離開電極表面，再次使用時(shí)，識(shí)別過程不受影響，表現(xiàn)出良好的再生性。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建的基于主客體競爭模式的適配體傳感器成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血酶的高效檢測，適體探針與目標(biāo)物凝血酶結(jié)合后，脫離電極，使得信號(hào)變化最大化，克服了以往這類傳感器靈敏度受限制的缺點(diǎn)。同時(shí)，相比于通過金硫鍵固定適體構(gòu)建的傳感器，使用主客體識(shí)別修飾電極，更容易使傳感器再生。 此傳感器制備簡單，操作簡endprint