江連洲，張瀟元，伍 丹，張菀坤，張 璟，盧 燕，全惟誠，米 思，劉 爽，王中江

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

葡聚糖糖基化處理對綠豆蛋白抗氧化性影響研究

江連洲，張瀟元，伍 丹，張菀坤，張 璟，盧 燕，全惟誠，米 思，劉 爽，王中江

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

以綠豆分離蛋白(MBPI)和葡聚糖為原料，通過濕熱法制備MBPI-Dextran共價復(fù)合物。本研究通過測定產(chǎn)物的還原力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力共同評價糖基化反應(yīng)對MBPI抗氧化能力的影響。結(jié)果表明：MBPI-Dextran共價復(fù)合物具有一定的抗氧化能力，特別是90℃條件下反應(yīng)得到的產(chǎn)物，抗氧化能力較80℃產(chǎn)物顯著提升，這與美拉德反應(yīng)程度有關(guān)，較高溫度下美拉德反應(yīng)進(jìn)程加快，促使更多具有抗氧化能力的物質(zhì)生成。因此，糖基化改性后的綠豆蛋白在抗氧化能力研究上具有一定的應(yīng)用價值。

綠豆蛋白；葡聚糖；糖基化處理；抗氧化性

不同品種的綠豆中蛋白含量為20%～30%[1]，所含蛋白質(zhì)中60%以上都是水溶性球蛋白[2]。美拉德反應(yīng)被廣泛認(rèn)為是有效和安全的提高蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的方法[3-4]。目前的研究較多集中于利用生物酶解技術(shù)來制備綠豆肽，極少考慮利用糖基化對綠豆中的蛋白質(zhì)進(jìn)行改性[5-6]。本研究通過對糖基化改性后綠豆蛋白的抗氧化性進(jìn)行研究，運用多種分析檢測手段，探討糖基化反應(yīng)在綠豆分離蛋白中對其抗氧化能力所起的影響，同時對其作用機(jī)理進(jìn)行探究，以期為拓展綠豆蛋白的應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆分離蛋白，實驗室堿溶酸沉法自制(蛋白質(zhì)含量90.76%)；葡聚糖，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，天津市科密歐化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：分析純試劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

PH SJ-4A型實驗室pH計，中國上海雷磁公司；JJ-1增力電動攪拌器，江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠；TD5M-WS臺式大容量離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1綠豆分離蛋白的制備 綠豆→浸泡12h(料液比為1∶ 10，4℃)→去皮→磨漿→用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為9.0→室溫下攪拌20min→10 000×g離心30min(4℃)→上清液用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為4.0→10 000×g離心30min(4℃)→沉淀加水分散→用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性→真空冷凍干燥(-50℃)→綠豆分離蛋白。

1.3.2綠豆分離蛋白—糖接枝物的制備 將綠豆分離蛋白和葡聚糖(1/1)溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌2h至完全溶解，置于水浴鍋中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫，離心后上清液置于蒸餾水中透析24h(4℃)，凍干成粉后置于冰箱中備用。

1.3.3接枝度測定 采用OPA法。配制OPA試劑，此試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用。準(zhǔn)確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入20%(w/w)的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.5 mL，硼砂(0.1 mol/L)25.0 mL，β-巰基乙醇100 μL最后用蒸餾水定容到50 mL。在測定過程中，取1支干凈試管放入4.0 mL的OPA試劑以及200 μL的樣品，混勻，置于35℃的恒溫水浴鍋中水浴2 min，并用可見分光光度計于340nm下測出吸光值A(chǔ)340。同時，另取一支試管中放入4.0 mL OPA試劑和200 μL水作為空白對照。

接枝度可以用式(1)計算：

DG(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(1)

式(1)中：A0—接枝反應(yīng)前溶液的吸光值；A1—接枝反應(yīng)后溶液的吸光值

1.3.4接枝產(chǎn)物褐變程度的測定 用0.1% SDS(w/w)將樣品液稀釋至蛋白濃度為0.2%(w/v)，以稀釋液做空白，在420 nm下測定吸光值A(chǔ)420。

1.3.5DPPH自由基清除能力測定 根據(jù)Benjakul S[7]的方法對接枝產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力進(jìn)行測定。當(dāng)日配制0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，避光保存。取2 mL的上述溶液，加入1 mL一定蛋白濃度的蛋白或者接枝物溶液，混合均勻后，25℃下避光反應(yīng)30 min，然后測定溶液在517 nm處的吸光值。對照中樣品溶液由去離子水替代，空白中DPPH-乙醇溶液由無水乙醇替代。DPPH自由基清除能力根據(jù)式(2)計算：

(2)

式(2)中：Ac—對照的吸光值；AS—樣品溶液的吸光值；A0—空白的吸光值

1.3.6還原力測定 參照Oyaizu的方法[8]對接枝產(chǎn)物的還原力進(jìn)行測定。取樣品0.5mL(5mg/mL)，加入濃度為0.2mol/L、pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL以及1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，充分?jǐn)嚢?。在恒溫水浴鍋?nèi)將混合物在5℃條件下保持恒溫20min后加入冰塊進(jìn)行冷卻，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL，將樣液置于3 000r/min離心機(jī)下離心10min。隨后用移液槍取上清液2.5mL，蒸餾水2.5mL以及0.1%的氯化鐵溶液0.5mL，充分?jǐn)嚢?，靜置10min后，并用可見分光光度計在700nm處測定溶液的吸光值。

1.3.7羥基自由基(OH·)清除能力的測定 通過Fenton體系模型[9]測定羥基自由基(OH·)的清除能力。吸取9.0mmol/L FeSO4和9.0mmol/L水楊酸乙醇溶液各2.0mL，然后加入10mg/mL樣品液2mL，最后加入2mL 8.8mmol/L H2O2。對照液中樣品液由去離子水替代，并于37℃下保持恒溫30min。以蒸餾水為空白，用可見分光光度計在510nm處測定其吸光值。

對OH·清除率的公式如式(3)：

(3)

式(3)中：OD0——空白對照液吸光度值；ODx——加入樣品液后吸光值；ODx0——樣品的本底吸光度值

(4)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

至少進(jìn)行3次試驗，利用Origin9.1軟件、OMNIC軟件包等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時間對糖基化反應(yīng)接枝度和褐變程度的影響

圖1表明，產(chǎn)物的接枝度在反應(yīng)進(jìn)行過程中逐漸增加。這是因為，在初期，蛋白質(zhì)鏈上的ε-氨基基團(tuán)并未完全暴露，隨著糖基化反應(yīng)時間延長，ε-氨基基團(tuán)不斷暴露出來，與還原性羧基末端發(fā)生反應(yīng)程度增加，從而增加產(chǎn)物的接枝度[11-12]。游離氨基和還原性羰基之間產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)同時也能提高產(chǎn)物的褐變程度。美拉德反應(yīng)的高級階段涉及Amadori產(chǎn)物的降解，和生成被稱為“類黑精”的有色的高分子化合物[13]。同時，褐變程度也在反應(yīng)進(jìn)行的過程中逐漸增加，這表明有部分美拉德反應(yīng)的高級產(chǎn)物生成。

圖2為90℃條件下反應(yīng)的接枝度先迅速增加而后增加速度變緩，這是因為，溫度過高在促進(jìn)蛋白和多糖之間反應(yīng)的同時，也使蛋白質(zhì)之間發(fā)生了一定程度的聚集，從而不利于反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。隨反應(yīng)時間延長產(chǎn)物的褐變程度急劇增加，這表明90℃下美拉德反應(yīng)的高級產(chǎn)物生成量逐漸增加。反應(yīng)時間過長導(dǎo)致產(chǎn)物出現(xiàn)不良的色澤和氣味，這會限制其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，因此，控制反應(yīng)的時間和溫度在一定范圍內(nèi)是十分必要的。

2.2 還原力

由圖3可知，產(chǎn)物的還原力隨著反應(yīng)時間的延長緩慢升高。研究表明，美拉德反應(yīng)初級階段的Amadori熱解產(chǎn)物[14-15]、中間產(chǎn)物還原酮[16]、高級階段產(chǎn)物裂解形成“類黑精[17]”都具有一定的還原能力，此外，焦糖化反應(yīng)產(chǎn)物也具有一定的還原能力[18]。其中，中間產(chǎn)物還原酮是起到還原能力的主要物質(zhì)[19]。80℃條件下隨著反應(yīng)時間延長，產(chǎn)物接枝度不斷增大，中間產(chǎn)物還原酮積累增多，因此，產(chǎn)物的還原力不斷增大。Limsuwanmanee J等[18]研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中羥基基團(tuán)的存在與其還原性呈相關(guān)性。Daglia等[20]研究表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是一種特殊的由許多不同分子量的化合物組成的物質(zhì)，特別是高分子量化合物。這種高分子量化合物是使產(chǎn)物表現(xiàn)出抗氧化性質(zhì)的主要物質(zhì)。由圖4可知，在反應(yīng)開始1h內(nèi)產(chǎn)物的還原能力增加較小，隨反應(yīng)時間延長還原力迅速上升，并在反應(yīng)4h后達(dá)到峰值，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，產(chǎn)物還原力有略微的下降，但仍處于較高水平。整體上90℃下產(chǎn)物的還原能力較80℃條件下產(chǎn)物有所提高，這可能是由于90℃下美拉德反應(yīng)速率提高，產(chǎn)物褐變程度進(jìn)一步增大，美拉德高級產(chǎn)物積累由此增多而導(dǎo)致。有研究表明，高級美拉德產(chǎn)物中的這些羥基基團(tuán)也是使其表現(xiàn)出還原能力的重要物質(zhì)[16]。反應(yīng)時間繼續(xù)延長，產(chǎn)物還原力下降，這可能是因為過度熱處理一部分具有還原能力的產(chǎn)物分解所致。

2.3 DPPH自由基清除能力

圖5結(jié)果表明，在美拉德反應(yīng)過程中，中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物“類黑精”均可作為氫供體，其中高級階段產(chǎn)物“類黑精”主要起消除自由基作用[21-22]。隨著美拉德反應(yīng)時間延長，產(chǎn)物的褐變程度逐漸增強(qiáng)，DPPH自由基清除能力也隨之增大。圖6結(jié)果表明，在反應(yīng)開始1h內(nèi)，DPPH自由基清除能力上升幅度較小，反應(yīng)2h后急劇增加，反應(yīng)進(jìn)行到3h時，產(chǎn)物DPPH自由基清除能力達(dá)到峰值，之后DPPH自由基清除能力緩慢下降。研究表明，高級階段產(chǎn)物“類黑精”主要起清除自由基作用。在反應(yīng)開始階段，DPPH自由基清除能力提升并不明顯，這是由于美拉德反應(yīng)高級階段產(chǎn)物生成量有限；隨著時間延長，高級產(chǎn)物積累增多，DPPH自由基清除能力隨之增大，但反應(yīng)時間過長，DPPH自由基清除能力也會下降，這可能是由于過度的熱處理，蛋白質(zhì)發(fā)生劇烈聚集，不利于自由基清除反應(yīng)的發(fā)生。90℃下產(chǎn)物相比于80℃反應(yīng)產(chǎn)物DPPH清除能力有所提高，這是由于90℃下產(chǎn)物反應(yīng)程度更高，在美拉德反應(yīng)過程中積累了更多高級產(chǎn)物“類黑精”。但整體而言，MBPI-葡聚糖共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力水平略低。有報道稱，DPPH自由基是一類相對疏水的自由基，較難作用于蛋白質(zhì)、多糖類大分子，從而導(dǎo)致其難以與MBPI及MBPI-葡聚糖共價復(fù)合物作用，使樣品整體的DPPH自由基清除處于較低水平[23]。

2.5 羥自由基(·OH)清除能力

由圖9、10可知，90℃下產(chǎn)物反應(yīng)開始1h時，·OH清除能力迅速提升，之后隨著反應(yīng)時間的延長呈現(xiàn)先緩慢上升而后下降的趨勢，反應(yīng)4h時產(chǎn)物的·OH清除能力達(dá)到峰值，為未處理MBPI的1.46倍，隨著反應(yīng)時間的延長，·OH清除能力出現(xiàn)下降，研究發(fā)現(xiàn)是由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中具有·OH清除能力的物質(zhì)在長時間高溫加熱的環(huán)境下被熱分解。反應(yīng)一定時間后80℃與90℃產(chǎn)物的·OH清除能力相當(dāng)，表明糖基化反應(yīng)產(chǎn)物對·OH清除能力的影響有限。整體上MBPI-葡聚糖共價復(fù)合物的·OH清除能力高于MBPI，原因可能是，MBPI與葡聚糖共價結(jié)合后導(dǎo)致分子量變大以及螯合Fe2+的能力增強(qiáng)，使MBPI無法產(chǎn)生羥自由基，進(jìn)一步阻斷了反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，最終表現(xiàn)為其清除能力的增強(qiáng)[24]。

圖1 80℃下反應(yīng)時間對接枝度及褐變程度的影響

圖2 90℃下反應(yīng)時間對接枝度及褐變程度的影響

圖3 80℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物還原力的影響

圖4 90℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物還原力的影響

圖5 80℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響

圖6 90℃下反應(yīng)時間對MBPI-葡聚糖共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響

圖7 80℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物超氧自由基清除能力的影響

圖8 90℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物超氧自由基清除能力的影響

圖9 80℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響

圖10 90℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響

3 結(jié)論

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

The Inoxidizability of Mung Bean Protein with Dextran Glycosylation Process

JIANG Lian-zhou，ZHANG Xiao-yuan，WU Dan，ZHANG Wan-kun，ZHANG Jing，LU Yan，QUAN Wei-cheng，MI Si，LIU Shuang，WANG Zhong-jiang
(College of Food Science，Northeast Agricultural Univeristy，Harbin 150030，China)

mung bean protein；dextran；glycosylation process；inoxidizability

國家自然科學(xué)基金面上項目(項目編號：31671807、3157101375)；十三五重點研發(fā)專項“中華傳統(tǒng)食品工業(yè)化加工關(guān)鍵技術(shù)研究與裝備開發(fā)”(項目編號：2016YED0400402)；方便即食豆制品制造關(guān)鍵技術(shù)研究及新產(chǎn)品創(chuàng)制(項目編號：2016YFD0400702)；霍英東教育基金會高等院校青年教師基金(項目編號：20152325210002)。

江連洲(1960— )，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

王中江(1987— )，男，博士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。