王傲雪，裴俊平，王貫，歐陽(yáng)亮

（四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610041）

共價(jià)抑制劑是通過(guò)共價(jià)鍵與靶蛋白氨基酸殘基產(chǎn)生更牢固的結(jié)合作用，從而更好地發(fā)揮靶蛋白抑制活性的一類小分子化合物。傳統(tǒng)的抑制劑通過(guò)氫鍵與范德華力等非共價(jià)相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的結(jié)合與抑制，較小的作用強(qiáng)度往往使得此類藥物具有較低的選擇性與抑制能力?？紤]到共價(jià)鍵的強(qiáng)度遠(yuǎn)高于非共價(jià)相互作用，共價(jià)抑制劑顯然具有更強(qiáng)的抑制潛力。并且與非共價(jià)抑制劑相比，共價(jià)結(jié)合的藥物不符合標(biāo)準(zhǔn)平衡動(dòng)力學(xué)，藥物被排出體外后仍能保持抑制效果，這意味著系統(tǒng)的藥物暴露和非靶藥物結(jié)合減少，從而使得毒性降低[1]。然而，共價(jià)抑制劑的脫靶效應(yīng)以及對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性修飾等現(xiàn)象仍然是研究人員擔(dān)憂的問(wèn)題，因此，長(zhǎng)期以來(lái)很少有藥物被有意設(shè)計(jì)為共價(jià)抑制劑。

盡管如此，仍有許多小分子共價(jià)抑制劑上市。最早的共價(jià)抑制劑可以追溯到阿司匹林。早在19世紀(jì)初，其已經(jīng)被用來(lái)治療疼痛和發(fā)熱，而直到20世紀(jì)70年代經(jīng)研究才發(fā)現(xiàn)阿司匹林以與絲氨酸殘基共價(jià)結(jié)合的方式不可逆抑制乙酰化環(huán)氧合酶[2]。英國(guó)醫(yī)生于20世紀(jì)偶然發(fā)現(xiàn)的抗生素青霉素也是共價(jià)抑制劑，其通過(guò)β-內(nèi)酰胺環(huán)不可逆地與青霉素結(jié)合蛋白的絲氨酸殘基形成共價(jià)鍵，阻止細(xì)胞壁合成[3]。阿法替尼被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療相應(yīng)轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌，其能夠不可逆地與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的半胱氨酸形成共價(jià)鍵[4]。硼替佐米通過(guò)硼化作用可逆地與26S蛋白酶體活性位點(diǎn)的β5與β5i亞基中的蘇氨酸共價(jià)結(jié)合，并于2003年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)或難治性骨髓瘤[5]。這些藥物都是醫(yī)藥界不可或缺的重要組成部分。對(duì)共價(jià)抑制劑的研究，證明了其具有降低給藥濃度、延長(zhǎng)有效治療時(shí)間、減少耐藥性、增加不可成藥靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)可能性等明確優(yōu)勢(shì)[6-8]。隨著人們對(duì)共價(jià)抑制劑機(jī)制的研究以及對(duì)親電彈頭與親核氨基酸的探索，越來(lái)越多的共價(jià)抑制劑得到開(kāi)發(fā)。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，已有至少50種共價(jià)抑制劑獲批上市用于治療各類疾病[9]。本文將重點(diǎn)介紹已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市或進(jìn)入臨床的共價(jià)抑制劑以及具有臨床應(yīng)用潛力的共價(jià)抑制劑的研究近況，以期為新型共價(jià)抑制劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)與線索。

1 共價(jià)抑制劑的作用機(jī)制

共價(jià)抑制劑通常具有導(dǎo)引頭和彈頭2個(gè)結(jié)構(gòu)，其通過(guò)2個(gè)相關(guān)卻不連續(xù)的步驟完成與靶蛋白的共價(jià)結(jié)合：1）小分子配體會(huì)通過(guò)導(dǎo)引頭與靶蛋白特定的結(jié)合口袋可逆地發(fā)生非共價(jià)相互作用，形成中間體E·I；2）中間體復(fù)合物中小分子配體的親電彈頭會(huì)與靶蛋白的親核氨基酸殘基通過(guò)加成、取代、氧化等反應(yīng)發(fā)生共價(jià)相互作用，生成共價(jià)復(fù)合物E-I，這一步反應(yīng)通常比第1步慢。根據(jù)第2步反應(yīng)是否可逆，可將共價(jià)抑制劑分為不可逆共價(jià)抑制劑和可逆共價(jià)抑制劑，其作用模式如圖1所示。在第2步中，K2，K-2分別代表生成速率常數(shù)與解離速率常數(shù)。當(dāng)K-2不等于0時(shí)，該化合物為可逆共價(jià)抑制劑；當(dāng)K-2等于或趨近于0時(shí)，該化合物為不可逆共價(jià)抑制劑[1,10-12]。

圖1 共價(jià)抑制劑與靶蛋白相互作用機(jī)制Figure 1 Mechanism of the interaction between covalent inhibitor and target protein

不可逆共價(jià)抑制劑包含的親電彈頭有丙烯酰胺、α-鹵酮、環(huán)氧化物、氮丙環(huán)、乙烯基砜、活化乙炔等，大多用于激酶類抑制劑的設(shè)計(jì)。只有在機(jī)體形成新的蛋白或原蛋白復(fù)合物降解時(shí)才能解除此類化合物的抑制作用，這也使得不可逆共價(jià)抑制劑能夠產(chǎn)生持久又強(qiáng)大的效力，從而降低服用劑量與次數(shù)，提高患者的依從性。

可逆共價(jià)抑制劑包含的親電彈頭通常有醛類、活化酮類、α-酮基酰胺類、腈類和硼酸衍生物等，多用于蛋白酶體、絲氨酸水解酶、組織蛋白酶等靶標(biāo)的可逆共價(jià)抑制劑的設(shè)計(jì)。這類抑制劑與靶標(biāo)產(chǎn)生可逆的共價(jià)結(jié)合,藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)在不可逆抑制劑與非共價(jià)抑制劑之間，使其不僅兼?zhèn)淞瞬豢赡嬉种苿┑膬?yōu)點(diǎn),也減少了因脫靶效應(yīng)導(dǎo)致的潛在風(fēng)險(xiǎn)。常見(jiàn)靶向特定氨基酸的共價(jià)基團(tuán)分類如表1所示。

表1 靶向特定氨基酸的共價(jià)基團(tuán)分類Table 1 Classification of covalent groups targeting specific amino acids

2 靶向親核基團(tuán)含硫元素氨基酸的共價(jià)抑制劑

2.1 靶向半胱氨酸的共價(jià)抑制劑

半胱氨酸（cysteine，Cys）的硫醇基團(tuán)親核性并不高，而當(dāng)其側(cè)鏈中的硫醇基團(tuán)以巰基形式存在時(shí)，親核能力會(huì)大大提升，并使其一躍成為20種常見(jiàn)氨基酸親核性之首，這也使得半胱氨酸成為最為普遍靶向的共價(jià)氨基酸殘基[13-14]。強(qiáng)親核能力意味著弱親電彈頭的小分子同樣能夠作為共價(jià)抑制劑被開(kāi)發(fā)，降低了脫靶的風(fēng)險(xiǎn)。目前靶向半胱氨酸的抑制劑有EGFR、布魯頓酪氨酸激酶（Brutons tyrosine kinase，BTK）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）、Kirsten肉瘤病毒致癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、核輸出蛋白1（exportin 1，XPO1）、p90核糖體S6激酶（p90 ribosomal S6 kinase，RKS）、含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLR family pyrin domain containing protein 3，NLRP3）、中心 體相 關(guān)激 酶2（NIMA related kinase 2，NEK2）、Janus激酶3（Janus kinase 3，JAK3）抑制劑等[11,15-22]，本文將選取其中部分經(jīng)典共價(jià)抑制劑進(jìn)行介紹。

2.1.1 表皮生長(zhǎng)因子受體共價(jià)抑制劑EGFR是多種癌癥的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)，研究人員致力于開(kāi)發(fā) EGFR抑制劑或雙靶抑制劑進(jìn)行相關(guān)疾病的治療[23-24]。但其激酶結(jié)構(gòu)域經(jīng)常發(fā)生突變而對(duì)多種EGFR抑制劑產(chǎn)生耐藥。共價(jià)EGFR抑制劑能夠很好地降低耐藥可能性，且目前已有許多策略被用于減少其脫靶的風(fēng)險(xiǎn)。

2.1.1.1 不可逆共價(jià)抑制劑這類EGFR共價(jià)抑制劑通常將邁克爾受體基團(tuán)作為親電彈頭，其中心雜環(huán)支架的N原子能夠與EGFR形成氫鍵，增加小分子的停留時(shí)間。阿法替尼（afatinib，1）是首個(gè)上市的第2代EGFR共價(jià)抑制劑，被FDA批準(zhǔn)用于治療EGFR 19外顯子缺失或21外顯子（L858R）突變的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌[4]。阿法替尼的邁克爾受體基團(tuán)為丙烯酰胺基團(tuán)，其與靶蛋白結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基Cys797通過(guò)1，4共軛加成反應(yīng)形成共價(jià)鍵（見(jiàn)圖2）。臨床前數(shù)據(jù)表明，阿法替尼對(duì)EGFRL858R/T790M突變體激酶的IC50為10 nmol · L-1，約為非共價(jià)抑制劑吉非替尼抑制效力的100倍，并在EGFRL858R/T790M突變體以及19外顯子缺失的小鼠模型中能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)[15]。這主要?dú)w因于共價(jià)抑制劑效率的提高和共價(jià)復(fù)合物形成的持久性，因?yàn)橥蛔兡軌蛟鰪?qiáng)EGFR對(duì)腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的親和力而導(dǎo)致非共價(jià)抑制劑耐藥，而共價(jià)鍵的形成能夠降低EGFR對(duì)ATP濃度的敏感性。作為第3代EGFR抑制劑，奧希替尼（osimertinib，2）于2015年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)治療轉(zhuǎn)移性EGFRT790M突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌[25]。研究表明，奧希替尼對(duì)L858R/T790M EGFR突變體激酶的IC50為1 nmol · L-1，抑制效力約為野生型的200倍。奧希替尼顯著下調(diào)多種腫瘤細(xì)胞中的EGFR磷酸化水平并在相應(yīng)小鼠模型中抑制腫瘤的生長(zhǎng)。其結(jié)構(gòu)中的丙烯酰胺親電靶頭指向Cys797并與之共價(jià)結(jié)合，以此發(fā)揮強(qiáng)效治療作用[26]。然而臨床數(shù)據(jù)顯示，許多EGFRT790M突變的患者會(huì)在治療中產(chǎn)生C797S突變，誘導(dǎo)奧西替尼耐藥性的產(chǎn)生[27]。

圖2 化合物1與表皮生長(zhǎng)因子受體的共晶結(jié)構(gòu)（PDB ID：4G5P）Figure 2 Co-crystal structure of compound 1 with EGFR (PDB ID: 4G5P)

2.1.1.2 可逆共價(jià)抑制目前仍未有可逆EGFR共價(jià)抑制劑上市，但已有許多抑制劑對(duì)突變EGFR具有高度選擇性及良好的抑制能力，如化合物3，其能夠與EGFR中的氨基酸殘基Cys797共價(jià)結(jié)合，并具有更高的選擇性，對(duì)EGFRL858R的IC50為0.15 μmol · L-1，對(duì)EGFRL858R/T790M的IC50為0.037 μmol · L-1[25,28]。

2.1.2 布魯頓酪氨酸激酶共價(jià)抑制劑BTK能夠影響B(tài)淋巴細(xì)胞的發(fā)育和功能，是血液系統(tǒng)惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并能夠?qū)е伦陨砻庖咝约膊〉陌l(fā)生。近年來(lái)科研人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)了大量小分子BTK共價(jià)抑制劑以及蛋白降解靶向嵌合體（proteolysis-targeting chimera，PROTAC），為相關(guān)疾病的治療提供了新的策略[16,29-32]。

2.1.2.1 不可逆共價(jià)抑制劑2013年，伊布替尼（ibrutinib，4）被批準(zhǔn)治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤。其對(duì)BTK具有較高選擇性，并對(duì)BTK有著較高的抑制效力（IC50= 0.5 nmol · L-1），臨床前數(shù)據(jù)表明其在自身免疫性疾病和B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤動(dòng)物模型中十分有效[29]。伊布替尼中的丙烯酰胺彈頭與BTK蛋白ATP結(jié)合域中的氨基酸殘基Cys481發(fā)生共價(jià)結(jié)合，發(fā)揮對(duì)BTK的抑制作用，然而該抑制劑能夠以時(shí)間依賴的方式與非靶標(biāo)蛋白發(fā)生反應(yīng)。并且由于不能與絲氨酸的羥基形成共價(jià)鍵，伊布替尼對(duì)BTK C481S突變的抑制效力大大下降（IC50= 1 μmol · L-1）。作為第2代BTK抑制劑，阿卡替尼（acalabrutinib，5）于2017年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，其對(duì)BTK具有更高的選擇性、更強(qiáng)的抑制能力和更小的副作用。其同樣靶向BTK的Cys481，對(duì)BTK的IC50為3 nmol · L-1，在人全血CD69 B淋巴細(xì)胞活化試驗(yàn)中,其EC50為8 nmol · L-1[30,33]。

2.1.2.2 可逆共價(jià)抑制劑由于伊布替尼帶來(lái)的非靶效應(yīng)相關(guān)的毒性作用，F(xiàn)DA并未批準(zhǔn)其治療自身免疫性疾病，因此，研究人員深入研究了BTK可逆共價(jià)抑制劑，以期為相關(guān)疾病的治療做出貢獻(xiàn)。2017年，PRN1008（6）用于健康志愿者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明，該藥具有較高的安全性與良好的耐受性[34]。研究結(jié)果顯示，PRN1008在外周血單核細(xì)胞中緩慢持續(xù)結(jié)合BTK蛋白，而不形成永久性共價(jià)鍵。PRN1008對(duì)BTK有較高抑制能力（IC50= 1.3 nmol · L-1），對(duì)人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞的IC50為7.4 nmol · L-1[35]。PRN1008在臨床前藥效學(xué)研究中表現(xiàn)出逆時(shí)針滯后的現(xiàn)象，能夠減少藥物的長(zhǎng)期體循環(huán)，從而降低潛在的脫靶副作用。

2.1.3 KRAS共價(jià)抑制劑KRAS是原癌基因RAS中突變頻率最高的亞型，多年來(lái)一直被認(rèn)為是一個(gè)不可成藥的靶標(biāo)。KRASG12C是最常見(jiàn)的一種突變體，半胱氨酸的存在使得突變KRAS的選擇性共價(jià)靶向成為可能[17,36-38]。

2018年，美國(guó)安進(jìn)公司通過(guò)基于具有半胱氨酸反應(yīng)功能的片段篩選與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)得到高效、高選擇性、耐受性良好的共價(jià)抑制劑AMG510（7），這是FDA批準(zhǔn)的首個(gè)KRASG12C不可逆共價(jià)抑制劑。臨床前研究表明，AMG510對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）的IC50為68 nmol · L-1，對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞也具有顯著的抑制增殖作用，IC50為5 nmol · L-1。在KRASG12C突變腫瘤模型中，發(fā)現(xiàn)其能夠持續(xù)抑制MAPK信號(hào)通路。當(dāng)經(jīng)口給藥劑量大于10 mg · kg-1時(shí)，觀察到小鼠體內(nèi)ERK磷酸化被顯著抑制。在長(zhǎng)達(dá)24 d的治療時(shí)間里，AMG510顯著持續(xù)抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。盡管AMG510半衰期相對(duì)較短，但由于KRAS蛋白半衰期長(zhǎng)達(dá)22 h，AMG510的快速共價(jià)滅活也能夠產(chǎn)生持久的藥學(xué)效應(yīng)[39]。除此之外，威爾斯普林公司與米拉提治療公司開(kāi)發(fā)的ARS-1620（8）及MRTX849（9）同樣也進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)[38,40]。禮來(lái)公司研發(fā)的LY3537982在臨床前研究中顯示出極佳的抗腫瘤活性，對(duì)具有KRASG12C突變的H23肺癌細(xì)胞系展現(xiàn)出較高的抑制效力（IC50= 1.04 nmol · L-1）,并能誘導(dǎo)異種移植模型中腫瘤的完全消退。

2.1.4 其他靶點(diǎn)的共價(jià)抑制劑XPO1對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)十分重要，在許多腫瘤細(xì)胞中都觀察到XPO1的過(guò)表達(dá)，并與包括血液惡性腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)。目前已經(jīng)有許多選擇性XPO1抑制劑得到開(kāi)發(fā)，但僅有抑制劑selinexor（10）通過(guò)臨床試驗(yàn)，并于2019年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)與地塞米松聯(lián)用治療患有復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤的成年患者[41]。Selinexor能夠選擇性靶向XPO1,并與XPO1的氨基酸殘基Cys528發(fā)生緩慢可逆的共價(jià)結(jié)合[42]。目前針對(duì)骨質(zhì)疏松已有許多藥物上市， 組織蛋白酶K（Cathepsin K，Cat K）是治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其可逆性共價(jià)抑制劑奧當(dāng)卡替（odanacatib，11）正在進(jìn)行臨床研究，用以減少老年婦女的骨折發(fā)生[14,43]。其結(jié)構(gòu)中的腈基與Cat K活性口袋中半胱氨酸的共價(jià)結(jié)合是可逆的，這可能降低其在人體內(nèi)的潛在副作用。富馬酸二甲酯（12）早已被應(yīng)用于治療銀屑病和多發(fā)性硬化病。2018年，Andersen等[18]發(fā)現(xiàn)其能夠作為邁克爾受體與核糖體S6激酶2（ribosomal S6 kinase 2，RSK2）中的Cys599共價(jià)結(jié)合，這使得其能夠高效抑制RSK/有絲分裂原和應(yīng)激活化型蛋白激酶（mitogen-and stress-activated protein kinase，MSK）。

2.2 靶向甲硫氨酸的共價(jià)抑制劑

甲硫氨酸（methionine，Met）在脊椎動(dòng)物中十分稀有，其同樣含有硫原子，但其硫醚基團(tuán)僅具有中等親核能力，且甲硫氨酸因其疏水性通常并不存在于蛋白表面，這也使得靶向甲硫氨酸的共價(jià)抑制劑開(kāi)發(fā)并不常見(jiàn)。

溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是一種關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)控因子，能夠影響細(xì)胞增殖、遷移與周期等，這也使得其表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2018年，Kharenko等[44]開(kāi)發(fā)出了一系列選擇性BRD4共價(jià)抑制劑，如化合物13，其能夠選擇性地與BRD4的Met149形成不可逆共價(jià)鍵（見(jiàn)圖3），其IC50為0.05 μmol · L-1，并在MV4-11細(xì)胞中表現(xiàn)出比可逆抑制劑更加持久的抗腫瘤細(xì)胞增殖的能力。

圖3 化合物13與溴結(jié)構(gòu)域蛋白4的共晶結(jié)構(gòu)（PDB ID：6CZU）Figure 3 Co-crystal structure of compound 13 with BRD4 (PDB ID: 6CZU)

3 靶向親核基團(tuán)含氮元素氨基酸的共價(jià)抑制劑

3.1 靶向賴氨酸的共價(jià)抑制劑

與半胱氨酸相比，賴氨酸（lysine，Lys）的豐度更高，其殘基中的伯胺帶有潛在親核性，能夠與一些帶有親電彈頭的小分子抑制劑發(fā)生不可逆共價(jià)結(jié)合作用。然而，在生理?xiàng)l件下，氨基往往以質(zhì)子化形式存在，這為靶向賴氨酸的共價(jià)抑制劑開(kāi)發(fā)帶來(lái)了挑戰(zhàn)。為了成功靶向賴氨酸殘基，其解離常數(shù)需產(chǎn)生變化從而使其在生理環(huán)境下保持中性，這意味著靶蛋白的賴氨酸殘基需在生理環(huán)境中被干擾，或與配體結(jié)合時(shí)被干擾[13]。

3.1.1 磷酯酶A2共價(jià)抑制劑首個(gè)靶向賴氨酸殘基的共價(jià)抑制劑為1977年從帕勞的變異絲瓜菌中分離得到的天然二倍半類萜烯抗生素曼諾力得（manoalide，14）。其被認(rèn)為能夠與磷酯酶A2（phospholipase A2，PLA2）中的氨基酸殘基Lys6和Lys79發(fā)生不可逆共價(jià)結(jié)合，并在體外表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌顯著的增殖抑制作用，IC50為2 ~ 4 nmol · L-1[45]。

3.1.2 磷脂酰肌醇-3激酶共價(jià)抑制劑1957年首次分離得到的甾體類天然產(chǎn)物渥曼青霉素（wortmannin，15）是磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的高效不可逆抑制劑[46]?；衔?5通過(guò)氮雜邁克爾加成與配體呋喃環(huán)的開(kāi)環(huán)對(duì)PI3K活性位點(diǎn)的Lys833進(jìn)行共價(jià)修飾（見(jiàn)圖4），對(duì)PI3K的IC50為2 ~ 4 nmol · L-1。但是其對(duì)PI3K具有較低的選擇性，并且穩(wěn)定性不高。為了克服這些問(wèn)題，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)得到其開(kāi)環(huán)類似物，其能夠通過(guò)乙烯基酰胺轉(zhuǎn)移反應(yīng)與賴氨酸位點(diǎn)不可逆共價(jià)結(jié)合，并已經(jīng)進(jìn)入非小細(xì)胞癌、去勢(shì)抵抗性前列腺癌與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床試驗(yàn)[47]。2018年，Dalton等[48]開(kāi)發(fā)了一系列選擇性不可逆PI3Kδ共價(jià)抑制劑，如化合物16，其對(duì)PI3Kδ的pIC50為4.8。研究表明其能夠與PI3Kδ亞型的Lys779反應(yīng)，并在濃度低于1 μmol · L-1時(shí)對(duì)活細(xì)胞中的PI3Kδ具有高度選擇性。同年，提取自沙生鹽藻CNY-486的化合物neolymphostin A（17）作為PI3K和雷帕霉素受體蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）雙重選擇性共價(jià)抑制劑得到開(kāi)發(fā)，其同樣也是首個(gè)來(lái)自細(xì)菌的共價(jià)激酶抑制劑[49]。Neolymphostin A能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)中的親電乙烯基酯共價(jià)靶向Lys802，并以3 nmol · L-1的濃度阻斷活細(xì)胞中的蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）磷酸化。

圖4 化合物15與磷脂酰肌醇-3激酶的共晶結(jié)構(gòu)（PDB ID：1E7U）Figure 4 Co-crystal structure of compound 15 with PI3K (PDB ID: 1E7U)

3.1.3 真核翻譯起始因子4E共價(jià)抑制劑真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，elF4E）能夠調(diào)節(jié)依賴性蛋白質(zhì)翻譯的起始階段，研究表明，elF4E在多種腫瘤中表達(dá)水平升高，并與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)。2020年，Wan等[50]為了克服現(xiàn)有elF4E抑制劑細(xì)胞滲透性低等問(wèn)題，利用共價(jià)對(duì)接的方法開(kāi)發(fā)了首個(gè)具有細(xì)胞活性的elF4E共價(jià)抑制劑?；衔?8能夠與elF4E中的Lys162發(fā)生共價(jià)結(jié)合。盡管其穩(wěn)定性不高，但對(duì)賴氨酸殘基的高親和力能夠使其盡快完成共價(jià)修飾。

3.1.4 X連鎖凋亡抑制蛋白共價(jià)抑制劑2018年，Baggio等[51]利用熱力學(xué)方法開(kāi)發(fā)了首個(gè)有效靶向賴氨酸的共價(jià)X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein，XIAP）抑 制 劑。其中，化合物19能夠與桿狀病毒IAP重復(fù)序列3（baculovirus IAP repeat 3，BIR3）結(jié) 構(gòu) 域 中 的Lys311共價(jià)結(jié)合，并對(duì)其產(chǎn)生顯著的抑制作用（IC50= 16.6 nmol · L-1）。在對(duì)LCL161耐藥的L363細(xì)胞中，化合物19顯示出極強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞抑制能力，在濃度為20 μmol · L-1條件下處理48 h能夠抑制70%以上的細(xì)胞的生長(zhǎng)。在研究中發(fā)現(xiàn)化合物19與BIR3結(jié)構(gòu)域的共價(jià)結(jié)合過(guò)程十分緩慢，為了克服這一問(wèn)題，Baggio等[52]于2019年開(kāi)發(fā)了新的具有細(xì)胞抑制效力的芳基氟硫酸鹽類共價(jià)抑制劑化合物20?；衔?0能夠與BIR3結(jié)構(gòu)域中的Lys297殘基毗鄰，這也使得其在激酶以及細(xì)胞層面更容易發(fā)生共價(jià)反應(yīng)?；衔?0在6 h處理?xiàng)l件下對(duì)XIAP的IC50為12 nmol · L-1，在水性緩沖溶液中溶解度為2 mmol · L-1，并在血漿中能保持穩(wěn)定[半衰期（t1/2）＞2 h]。在化合物21與腫瘤壞死因子α同時(shí)存在的條件下，能夠高度誘導(dǎo)SK-MEL-28細(xì)胞系與A549細(xì)胞系的凋亡，這表明化合物20與臨床候選藥物L(fēng)CL161具有相當(dāng)?shù)募?xì)胞藥理學(xué)特性。

3.1.5 骨髓細(xì)胞白血病蛋白1共價(jià)抑制劑2016年，Akcay等[53]首次開(kāi)發(fā)了靶向骨髓細(xì)胞白血病蛋白1（myeloid cell leukemia 1，Mcl-1）的可逆共價(jià)抑制劑，其能夠通過(guò)芳基硼酸羰基彈頭共價(jià)修飾Lys234，并顯示出比非共價(jià)同源物更強(qiáng)的抑制能力?；衔?1對(duì)Mcl-1的IC50為3.4 nmol · L-1。其通過(guò)對(duì)Mcl-1的抑制作用在MOLP-8細(xì)胞中激活半胱天冬酶-3/7來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡（EC50= 0.46 μmol · L-1），這比其他非共價(jià)抑制劑活性提高了24倍以上。2021年，Gambini等[54]開(kāi)發(fā)了首個(gè)共價(jià)靶向Mcl-1的Lys殘基的BH3肽，該肽對(duì)hMcl-1具有顯著的親和力和選擇性。

3.2 靶向組氨酸的共價(jià)抑制劑

組氨酸（histidine，His）中的咪唑基團(tuán)帶有親核性，其能夠與磺酰氟、螺環(huán)氧化物、α，β-不飽和酮或醛等發(fā)生反應(yīng)形成共價(jià)鍵。研究證明，相比于其他親核試劑，組氨酸殘基能夠與親電性相對(duì)較弱的試劑特異性結(jié)合，使得這些試劑具有被開(kāi)發(fā)為共價(jià)抑制劑的可能性。盡管如此，目前對(duì)于靶向His氨基酸殘基的共價(jià)抑制劑的開(kāi)發(fā)并不多。

3.2.1 甲硫氨酸氨基肽酶2共價(jià)抑制劑從煙曲霉中提取得到的天然產(chǎn)物煙曲霉素的類似物beloranib（22）是甲硫氨酸氨基肽酶2（methionine aminopeptidase 2，MetAP2）的共價(jià)抑制劑，與其結(jié)構(gòu)中阻礙較小的螺環(huán)氧化合物能夠與MetAP2活性位點(diǎn)上的His231產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合，盡管化合物22在治療癌癥方面效果不明顯，但在研究中發(fā)現(xiàn)其具有降低體質(zhì)量的作用，并且耐受性良好。目前22已經(jīng)作為肥胖癥治療的候選藥物進(jìn)入Ⅲ期臨床研究，在臨床試驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)的明顯副作用[55-57]。

4 靶向親核基團(tuán)含碳和氧元素的氨基酸共價(jià)抑制劑

4.1 靶向絲氨酸的共價(jià)抑制劑

絲氨酸（serine，Ser）是蛋白酶和其他水解酶活性位點(diǎn)的關(guān)鍵催化殘基，其側(cè)鏈上的羥基能夠被鄰近殘基激活，從而和帶有親電彈頭的小分子產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合。

4.1.1 青霉素結(jié)合蛋白共價(jià)抑制劑1928年發(fā)現(xiàn)的青霉素（penicillin，23）作為抗生素早已應(yīng)用于臨床治療多年。研究發(fā)現(xiàn)化合物23的β-內(nèi)酰胺環(huán)能夠通過(guò)酰化作用共價(jià)靶向青霉素結(jié)合蛋白（penicillinbinding protein，PBP）活性位點(diǎn)Ser36，通過(guò)這種方式青霉素能夠抑制細(xì)菌合成細(xì)胞壁從而發(fā)揮對(duì)應(yīng)的抗菌作用[3]。

4.1.2 β-內(nèi)酰胺酶共價(jià)抑制劑β-內(nèi)酰胺類抗生素在治療過(guò)程中出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，這是由于細(xì)菌能夠通過(guò)表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶使得這類抗生素中的β-內(nèi)酰胺水解從而失去對(duì)細(xì)菌的抑制能力。為了克服這種耐藥性，靶向β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑應(yīng)運(yùn)而生。阿維巴坦（avibactam，24）是一種可逆共價(jià)抑制劑，其五元環(huán)脲中的羰基能夠與靶蛋白活性部位的Ser殘基產(chǎn)生共價(jià)相互作用并使其乙?；痆58]。阿維巴坦與頭孢噻林的聯(lián)用在針對(duì)革蘭陰性菌感染患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的療效，并于2015年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。

4.1.3 乙酰膽堿酯酶共價(jià)抑制劑阿爾茨海默病仍是難以攻克的神經(jīng)退行性疾病，除抑制β-淀粉樣蛋白聚集外，靶向乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase，AchE）同樣能夠?qū)@種疾病進(jìn)行一定程度的治療[59]。天然產(chǎn)物硬豆堿的類似物卡巴拉?。╮ivastigmine，25）是一種共價(jià)靶向AchE的抑制劑，其能夠選擇性地作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的AchE[60]。卡巴拉汀已經(jīng)被批準(zhǔn)用于阿爾茨海默病的治療，其能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)中的酚類氨基甲酸酯酰化AchE活性位點(diǎn)的氨基酸殘基Ser203，抑制時(shí)間可達(dá)10 h[61]。

4.1.4 丙型肝炎病毒蛋白酶共價(jià)抑制劑丙型肝炎病毒蛋白酶（hepatitis C virus，HCV）能夠誘導(dǎo)丙型肝炎病毒的復(fù)制以及病毒復(fù)合物的形成，通過(guò)抑制HCV能夠治療相關(guān)的感染。

2006年，Perni等[62]開(kāi)發(fā)了特拉匹韋（telaprevir，26）作為HCV的可逆共價(jià)抑制劑，特別是選擇性靶向HCV NS3-4A。在臨床前研究中，化合物26能夠在1b型HCV復(fù)制子細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的抗病毒活性（IC50= 354 nmol · L-1），并在動(dòng)物模型中顯示良好的藥動(dòng)學(xué)特性?；衔?6結(jié)構(gòu)中的α-酮酰胺彈頭通過(guò)1，2加成到Sp2原子共價(jià)靶向HCV中的Ser1 139，并且已經(jīng)被批準(zhǔn)上市。同年，Venkatraman等[63]通過(guò)篩選小分子化合物庫(kù)得到先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到HCV NS3選擇性抑制劑波普瑞韋（boceprevir，27）。研究發(fā)現(xiàn)其具有較高的口服生物利用度，其結(jié)構(gòu)中的親電酮酰胺可逆地共價(jià)靶向Ser139，對(duì)人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（human neutrophil elastase，HNE）/HCV選擇性較高,并在復(fù)制子分析中顯示出較高的細(xì)胞效力（EC90= 0.35 μmol · L-1）。波普瑞韋已于2011年被批準(zhǔn)上市。那拉匹韋（narlaprevir，28）同樣具有酮酰胺結(jié)構(gòu)，其在反應(yīng)過(guò)程中被重排與活性位點(diǎn)的Ser139形成可逆共價(jià)鍵（見(jiàn)圖5）。那拉匹韋抑制復(fù)制子RNA的EC90為40 nmol · L-1。該藥于2016年被FDA批準(zhǔn)上市[64]。

圖5 化合物28與丙型肝炎病毒NS3-4a蛋白酶的共晶結(jié)構(gòu)（PDB ID: 3LON）Figure 5 Co-crystal structure of compound 28 with HCV NS3-4a protease (PDB ID: 3LON)

4.2 靶向蘇氨酸的共價(jià)抑制劑

蘇氨酸（threonine，Thr）的側(cè)鏈羥基同樣能夠被鄰近的殘基激活從而提高其親核性，這也使得其能夠作為親核氨基酸被帶有親電彈頭的抑制劑共價(jià)靶向。

4.2.1 蛋白酶體抑制劑蛋白酶體是在細(xì)胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的一類復(fù)合物，在真核生物、古細(xì)菌以及某些放線菌中普遍存在。其能夠通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的降解調(diào)控包括基因表達(dá)與細(xì)胞周期在內(nèi)的多種細(xì)胞進(jìn)程，這也使得蛋白酶體的表達(dá)水平與許多疾病的發(fā)生發(fā)展相互關(guān)聯(lián)。由于其活性位點(diǎn)具有親核Thr殘基，設(shè)計(jì)共價(jià)結(jié)合Thr的抑制劑已經(jīng)成為了靶向蛋白酶體從而治療癌癥等相關(guān)疾病的一種策略。

4.2.2 可逆共價(jià)抑制劑2003年，硼替佐米（bortezomib，29）作為首個(gè)蛋白酶體共價(jià)抑制劑被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)或難治性骨髓瘤。作為一種二肽硼酸類化合物，硼替佐米能夠通過(guò)硼化作用可逆地與26S蛋白酶體活性位點(diǎn)的β5與β5i亞基中的蘇氨酸共價(jià)結(jié)合，通過(guò)對(duì)蛋白酶體的抑制發(fā)揮抗腫瘤活性[65-66]。其通過(guò)靜脈注射或者皮下注射給藥。臨床前研究表明其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的IC90為0.05 mmol · L-1,對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460的IC50為0.1 μmol · L-1，并展現(xiàn)出對(duì)骨髓瘤的良好療效[5,67]。然而，在長(zhǎng)期的治療過(guò)后，許多患者出現(xiàn)了對(duì)硼替佐米的耐藥性，這可能部分由于編碼β5亞基的PSMB5基因產(chǎn)生了突變。2015年，伊沙佐米（ixazomib，30）作為首個(gè)口服蛋白酶體抑制劑被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于至少接受過(guò)1次既往治療的多發(fā)性骨髓瘤患者的治療[68]。伊沙佐米在血漿中能夠水解為硼酸，可逆地共價(jià)靶向20S蛋白酶體的β5亞基，從而發(fā)揮對(duì)蛋白酶體的抑制作用。其對(duì)20S蛋白酶體的β5亞基的抑制能力較高（IC50= 3.4 nmol · L-1）[69]。在臨床前研究中發(fā)現(xiàn)其能夠抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路，并誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。

4.2.3 不可逆共價(jià)抑制劑卡非佐米（carfilzomib，31）于2012年被批準(zhǔn)通過(guò)靜脈注射治療多發(fā)性骨髓瘤。研究表明，作為一種環(huán)氧酶素衍生物，卡非佐米通過(guò)結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧酮與β5亞基中的Thr催化殘基發(fā)生不可逆的共價(jià)相互作用（見(jiàn)圖6）。在臨床前研究中，卡非佐米體現(xiàn)出對(duì)硼替佐米耐藥細(xì)胞更強(qiáng)的抑制活性和更長(zhǎng)的抑制時(shí)間，并對(duì)蛋白酶體具有更高的選擇性。其對(duì)20S蛋白酶體β5的IC50為3.4 nmol · L-1。在臨床試驗(yàn)中，卡非佐米具有良好的療效以及耐受性[70]。

圖6 化合物31與20S蛋白酶體的共晶結(jié)構(gòu)（PDB ID: 4R67）Figure 6 Co-crystal structure of compound 31 with 20S proteasome (PDB ID: 4R67)

4.3 靶向酪氨酸的共價(jià)抑制劑

酪氨酸（tyrosine，Tyr）中同樣含有羥基，親核性相對(duì)較低。但酪氨酸殘基存在于蛋白質(zhì)中時(shí)，容易形成高度親核性的苯氧基陰離子，使得其能夠被多種路易斯酸共價(jià)靶向。

4.3.1 SR-蛋白特異性激酶1/2抑制劑Hatcher等[71]于2018年開(kāi)發(fā)了首個(gè)共價(jià)靶向SR-蛋白特異性激酶1/2（SRSF protein kinase 1/2，SPRK1/2）的不可逆抑制劑SRPKIN-1（32），其對(duì)SRPK1的IC50為 11 nmol · L-1。SRPKIN-1能夠與SPRK1/2的ATP結(jié)合口袋中酪氨酸的酚羥基共價(jià)結(jié)合，從而發(fā)揮對(duì)SPRK1/2的抑制作用。研究表明，SRPKIN-1能有效地將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）從促血管生成亞型VEGFA165a轉(zhuǎn)化為抗血管生成亞型VEGF-A165b，并在年齡相關(guān)性黃斑變性小鼠模型中以劑量依賴的方式抑制血管的形成。

4.3.2 B細(xì)胞淋巴瘤6共價(jià)抑制劑2020年，Teng等[72]通過(guò)將磺酰氟引入已有的可逆B細(xì)胞淋巴瘤6（B-cell lymphoma 6，BCL6）抑 制 劑，開(kāi) 發(fā) 出BCL6共價(jià)抑制劑TMX-2164（33）。其能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)中的磺酰氟與BCL6中的Tyr58的羥基發(fā)生共價(jià)結(jié)合。TMX-2164能有效抑制BCL6的激酶活性（IC50= 251 nmol · L-1），并在DLBCL細(xì)胞中顯示出較高的抗增殖活性。

4.3.3 Ras相關(guān)蛋白共價(jià)抑制劑由于Ras相關(guān)蛋白（Ras-related protein，Ral）缺乏親核半胱氨酸殘基，Bum-Erdene等[73]利用作用于酪氨酸的親電彈頭芳基磺酰氟共價(jià)靶向Ras 樣GTP水解酶（Ras-like guanosine triphosphatase，RAL GTPase）的氨基酸殘基Tyr82（見(jiàn)圖7）?；衔?4能夠抑制鳥(niǎo)嘌呤交換因子Rgl2介導(dǎo)的Ral GTPase的核苷酸交換，IC50為49.5 nmol · L-1。

圖7 化合物34與GDP結(jié)合的人RalA蛋白的共晶結(jié)構(gòu)（PDB ID: 6P0I）Figure 7 Co-crystal structure of compound 34 with GDP-bound human RalA (PDB ID: 6P0I)

6 結(jié)語(yǔ)與展望

共價(jià)抑制劑具有降低耐藥性及靶向不可成藥的靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)，使其成為激酶抑制劑領(lǐng)域的焦點(diǎn)，并在疾病治療中發(fā)揮著不可替代的作用，共價(jià)結(jié)合也早已應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域的研究當(dāng)中[74-77]。但其同樣具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，如對(duì)合成速度緩慢且具有重要功能的靶蛋白的持續(xù)抑制可能會(huì)造成嚴(yán)重的副作用。為更好地發(fā)揮共價(jià)抑制劑優(yōu)勢(shì)，Bradshaw等[78]利用半胱氨酸反應(yīng)性反式氰基丙烯酰胺親電試劑鑒定了新的BTK、FGFR的共價(jià)抑制劑。開(kāi)發(fā)具有低固有反應(yīng)性彈頭的共價(jià)抑制劑以降低脫靶可能性同樣是共價(jià)抑制劑的發(fā)展方向之一，如McAulay等[79]于2020年發(fā)現(xiàn)了新的炔基苯并噁嗪和二氫喹唑啉親電彈頭，并開(kāi)發(fā)出新型靶向半胱氨酸的JAK3共價(jià)抑制劑。除半胱氨酸外，研究人員也在努力開(kāi)發(fā)共價(jià)靶向弱親核氨基酸殘基的共價(jià)抑制劑，如靶向谷氨酸和精氨酸[80-81]。共價(jià)抑制劑目前正受到廣泛的關(guān)注，可以說(shuō)這一浩瀚的寶庫(kù)仍具有廣泛的開(kāi)發(fā)空間。相信隨著眾多開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)共價(jià)抑制劑的策略的提出與改進(jìn)，共價(jià)抑制劑必將迎來(lái)蓬勃發(fā)展并為人類疾病的治療帶來(lái)新的希望。