李在建+王懷山+趙京楊+操繼躍

摘要：給大鼠飼喂高脂日糧，建立大鼠肥胖模型，以研究肥胖對腸道微生態(tài)的影響。給肥胖大鼠灌胃芽孢桿菌懸液，分別在芽孢桿菌處理試驗(yàn)的第4周、第7周采樣，研究灌喂芽孢桿菌后肥胖大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，以及芽孢桿菌對糞便中短鏈脂肪酸和大鼠體質(zhì)量的影響。結(jié)果表明，芽孢桿菌能夠顯著提高其腸道菌群的多樣性，并且對肥胖動(dòng)物的體質(zhì)量控制起到一定的積極作用。

關(guān)鍵詞：肥胖；大鼠；肥胖抵抗；芽孢桿菌；腸道微生態(tài)

中圖分類號： S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0162-04

收稿日期：2016-04-14

基金項(xiàng)目：聊城大學(xué)博士啟動(dòng)基金（編號：318051314）。

作者簡介：李在建（1986—），男，山東青州人，博士，講師，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與生物制品學(xué)研究。Tel：（0635）8239936；E-mail：lizj8603@163.com。

通信作者：王懷山，男，碩士，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物微生態(tài)制劑方面的研究。E-mail：wanghuaishan@163.com。 近年來，肥胖人群的數(shù)量越來越大，肥胖及由其引起的一系列疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響到人類的生活質(zhì)量。盡管有研究證明，某種類型的肥胖可能和機(jī)體的基因突變有關(guān)，但是人類的基因在短時(shí)期內(nèi)很難發(fā)生特別大的改變，所以現(xiàn)在研究專家已經(jīng)將研究的注意力轉(zhuǎn)移到可能導(dǎo)致肥胖的外界因素上[1-2]。有“人類第二基因”之稱的腸道微生物目前已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，有研究表明，腸道微生物可以提高宿主從食物中攝取能量的效率并且能對脂肪代謝起調(diào)控作用，最終導(dǎo)致肥胖的產(chǎn)生[3]。所以，如何通過外界因素影響機(jī)體的腸道微生態(tài)進(jìn)而達(dá)到控制肥胖的目的已經(jīng)成為國際關(guān)注的焦點(diǎn)。益生菌作為腸道益生產(chǎn)品對腸道微生態(tài)的影響較大，它能明顯改變腸道的菌群結(jié)構(gòu)，因此，通過益生菌調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)來觀察其對肥胖的影響就成為了一個(gè)比較熱門的研究方向[4-5]。

本試驗(yàn)首先建立大鼠肥胖模型研究肥胖與腸道微生態(tài)之間的關(guān)聯(lián)，然后通過給肥胖大鼠灌喂芽孢桿菌菌懸液，研究芽孢桿菌對肥胖大鼠腸道微生態(tài)、腸道微生物代謝產(chǎn)物（短鏈脂肪酸）及其體質(zhì)量的影響，為研究芽孢桿菌對肥胖動(dòng)物的益生作用提供新的依據(jù)，對如何通過外源性益生物質(zhì)調(diào)節(jié)肥胖動(dòng)物的腸道微生態(tài)進(jìn)而對肥胖的影響有重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

50只健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量100～200 g，無特定病原體（SPF）等級，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供；芽孢桿菌，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室保存；基礎(chǔ)日糧，由同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；高脂日糧，由60%基礎(chǔ)飼料、15%豬油、10%蛋黃粉、8%脫脂奶粉、5%干酪素、2%白砂糖組成。

1.2 主要試劑與設(shè)備

Tris飽和酚，北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)；marker，北京鼎國生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；擴(kuò)增所用引物，生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)；色譜標(biāo)準(zhǔn)酸，上海化學(xué)試劑有限公司試劑一廠生產(chǎn)；高速低溫離心機(jī)，Eppendorf公司生產(chǎn)；水浴鍋，常州國華電器有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；PCR儀，廣東東盛生物科技有限公司生產(chǎn)；變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）系統(tǒng)（D-Code），Bio-Rad公司生產(chǎn)；氣相色譜儀（Trace-GC2000），美國熱電集團(tuán)生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物處理 50只大鼠于同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，肥胖模型建立期間把大鼠隨機(jī)分成2個(gè)組：陰性對照組（20只，飼喂基礎(chǔ)日糧）、模型組（30只，飼喂高脂日糧）。各組自由飲水、采食。以飼喂高脂日糧組大鼠體質(zhì)量達(dá)到正常大鼠體質(zhì)量120%以上為肥胖模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)[6]。肥胖模型建立成功后進(jìn)入芽孢桿菌灌喂期，進(jìn)入灌喂期再將陰性對照組分出10只大鼠作為陰性芽孢桿菌組，將模型組分為3組：10只肥胖模型組、10只肥胖芽孢桿菌組、10只肥胖抵抗組（飼喂奧利司他）。陰性芽孢桿菌組和肥胖芽孢桿菌組在灌喂期間的灌喂量為每次灌喂芽孢桿菌菌懸液1 mL/只（1×107 CFU/mL），每天灌喂1次，持續(xù)45 d。其他各組按相同時(shí)間和相同劑量灌喂蒸餾水。

1.3.2 采樣 在肥胖模型建立前首先采集1次大鼠的糞便，此后每周采集1次各組大鼠的糞便，所有樣品立即在-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 ERIC-PCR分析 參照Gordon等的報(bào)道[7]，引物序列為ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGG GATTCAC-3′，ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)（ERIC-PCR）擴(kuò)增體系如表1所示。

反應(yīng)條件：95 ℃ 7 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，30個(gè)循環(huán)；65 ℃ 16 min。取1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測定濃度。然后使用1.5%瓊脂糖凝膠在180 V電壓下電泳約 50 min 得到相應(yīng)的圖譜，每個(gè)樣品的上樣量約為400 ng。最后使用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行拍照。

1.3.4 糞便中短鏈脂肪酸（SCFA）的測定 準(zhǔn)確稱取0.5 g糞便樣品于7 mL離心管中，然后加入0.5 mL純水，渦旋混勻3 min，15 000 r/min、4 ℃離心20 min，取0.5 mL上清液于另一離心管中，加入100 μL 25%偏磷酸，混勻3 min，4 ℃放置過夜，取出后15 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液稀釋100倍后供氣相色譜分析[8]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Quantity One v4.4軟件將試驗(yàn)所得凝膠上的條帶進(jìn)行非加權(quán)平均距離（UPGMA）聚類分析、相似度分析等。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 肥胖模型建立結(jié)果

由表2可知，與肥胖模型組相比各組大鼠體質(zhì)量均差異極顯著（P<0.01）。

2.2 ERIC-PCR結(jié)果

2.2.1 肥胖大鼠腸道微生物的ERIC-PCR結(jié)果 由圖1可知，建模前、后陰性對照組的主條帶并無明顯差異，許多明亮的主條帶屬于2組共有，但是肥胖模型組的主條帶卻發(fā)生了比較大的變化，多條原本灰暗的條帶在建模成功后變成了明亮的主條帶，并且在建模前、后模型組條帶的多樣性明顯增多。這說明，肥胖對腸桿菌的影響比較明顯，不但可以增高其多樣性，還能增加其數(shù)量。

2.2.2 各處理對大鼠腸道微生態(tài)影響的ERIC-PCR結(jié)果 由圖2可知，在芽孢桿菌處理第4周時(shí)（圖2-a），各組條帶的多樣性較高，有些明亮的條帶所有組均具備，但是不同組之間的優(yōu)勢條帶存在差異。肥胖模型組和肥胖芽孢桿菌組無論從條帶的數(shù)目還是條帶的亮度上都要優(yōu)于其他各組。與陰性對照組相比，肥胖抵抗組明亮條帶的數(shù)目明顯較少。在芽孢桿菌處理第7周時(shí)（圖2-b），陰性對照組和肥胖芽孢桿菌組的條帶比較集中，明亮的條帶較多，肥胖鼠經(jīng)芽孢桿菌處理后，其條帶的多樣性增加。而肥胖抵抗組條帶的數(shù)目明顯下降，亮條帶也基本消失。這說明，芽孢桿菌對肥胖大鼠腸桿菌菌群的影響是比較明顯的， 它能增加其腸桿菌的多樣性和數(shù)量。在這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，肥胖抵抗組大鼠腸桿菌的多樣性和數(shù)量均低于肥胖模型組大鼠。

由圖3可知，在芽孢桿菌處理第4周時(shí)（圖3-a），陰性對照組和肥胖芽孢桿菌組大鼠之間的腸桿菌菌群已經(jīng)開始出現(xiàn)輕微的差異性。肥胖抵抗組跟陰性對照組相比也表現(xiàn)出一定的差異性，但不是十分明顯。在芽孢桿菌處理第7周時(shí)（圖3-b），肥胖抵抗組和肥胖芽孢桿菌組之間存在一定的差異。陰性對照組和肥胖芽孢桿菌組也表現(xiàn)出比較明顯的差異。上述結(jié)果表明，肥胖大鼠腸桿菌的菌群結(jié)構(gòu)受芽孢桿菌的影響比較大，到第7周時(shí)，其菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變已經(jīng)非常明顯。而肥胖抵抗大鼠腸桿菌的菌群結(jié)構(gòu)與肥胖鼠相比差異性隨時(shí)間變化逐漸增大。

2.3 大鼠糞便中SCFA的測定結(jié)果

2.3.1 大鼠糞便中SCFA的色譜圖分析結(jié)果 由圖4可知，與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖相比，各試驗(yàn)組樣品色譜圖的各個(gè)峰之間沒有疊加，分離良好。

2.3.2 試驗(yàn)處理對大鼠糞便中SCFA的影響及其分析 由表3可知，陰性對照組糞便中總SCFA的含量為（19.50±1.96） μg/mL，其中乙酸的含量最多，丙酸、丁酸的含量次之；肥胖模型組糞便中SCFA含量為（25.33±1.99） μg/mL，顯著高于陰性對照組（P<0.05），其中乙酸的含量為（20.52±1.83） μg/mL，顯著高于陰性對照組乙酸的含量（P<0.05）；另外，與肥胖模型組相比，肥胖抵抗組樣品糞便中SCFA總量和乙酸的含量均差異極顯著（P<0.01）， 丙酸的含量顯著降低（P<0.05），而丁酸的含量略有升高；肥胖大鼠在芽孢桿菌作用下其糞便中SCFA的總含量、乙酸、丁酸的含量均有不同程度的升高，但變化不顯著。這些試驗(yàn)結(jié)果間接反映出大鼠

腸道厭氧菌菌群的變化情況，大鼠肥胖后其腸道厭氧菌菌群的結(jié)構(gòu)變化明顯，可能是總菌量增加或菌的活性增高；芽孢桿菌可以改善肥胖大鼠腸道厭氧菌的菌群結(jié)構(gòu)， 但是這種作用不明顯。另外，與肥胖模型組大鼠相比，肥胖抵抗組大鼠腸道厭氧菌的數(shù)量或活性都明顯偏低，說明兩者腸道厭氧菌菌群的結(jié)構(gòu)差異性較大。

4 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，芽孢桿菌不僅可以改變肥胖大鼠腸道微生物數(shù)量，還能夠影響菌群的種類。芽孢桿菌能夠增加腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性，這種調(diào)節(jié)作用的直接后果就是降低了肥胖大鼠的體質(zhì)量，數(shù)據(jù)顯示，給肥胖大鼠飼喂適量的芽孢桿菌4周后，其體質(zhì)量明顯下降。這說明外源性芽孢桿菌能夠改變肥胖大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，增高其菌群多樣性并能增加菌群的數(shù)量，通過這種對腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用，可以達(dá)到控制其肥胖體質(zhì)量的目的[9-10]。進(jìn)一步說明，外源性芽孢桿菌和肥胖大鼠內(nèi)源性腸道菌相互作用可以給肥胖大鼠腸道微生物的能量代謝帶來較大的影響，進(jìn)而影響體內(nèi)脂肪的堆積程度，最終改變了肥胖大鼠的體質(zhì)量。

肥胖模型組大鼠糞便中各種SCFA的含量均明顯高于陰性對照組，說明在肥胖的形成過程中其糞便中SCFA的含量逐漸升高；肥胖抵抗組大鼠糞便中各種SCFA的含量明顯偏低于肥胖模型組大鼠，說明動(dòng)物的肥胖程度與其糞便中短鏈脂肪酸含量之間呈現(xiàn)一種正相關(guān)的關(guān)系。這從側(cè)面反映出肥胖可能改變了腸道厭氧菌群的結(jié)構(gòu)，增加了厭氧菌的數(shù)量或增強(qiáng)了厭氧菌的活性，從而使厭氧菌的代謝產(chǎn)物SCFA含量隨之增加。其原因可能是高脂飲食的攝入改變了腸道內(nèi)厭氧菌的發(fā)酵底物，而這種發(fā)酵底物正好適合厭氧菌的生活特性，因此，該發(fā)酵產(chǎn)物可能刺激厭氧菌增加了其發(fā)酵活性，也有可能是增加了厭氧菌的總量[11-12]。

肥胖與腸道微生態(tài)之間有直接的聯(lián)系，動(dòng)物肥胖后腸道菌群結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生較大的變化，并有新的優(yōu)勢菌群產(chǎn)生，至于該優(yōu)勢菌群的種屬還有待于做進(jìn)一步的鑒定；芽孢桿菌能改變肥胖動(dòng)物的腸道菌群結(jié)構(gòu)，明顯提高其菌群多樣性，通過這種調(diào)節(jié)作用能夠?qū)Ψ逝謩?dòng)物的體質(zhì)量控制起到一定的積極影響[13]。

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